MC LC
2.2. Mục tiêu cụ thể
- Xây dựng được cơ sở dữ liệu ADN mã vạch cho loài Dây thìa canh. - Xây dựng được kỹ thuật nhân giống Dây thìa canh bằng phương pháp nuôi cấy in vitro.
2.3. Đối tƣợng, phạm vi nghiên cứu
2.3.1. Đối tượng nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Dây thìa canh (Gymnema sylvestre)
- Vật liệu nghiên cứu: Cành bánh tẻ của Dây thìa canh (Gymnema sylvestre) được thu nhận từ các cây khỏe mạnh, sinh trưởng tốt, không sâu bệnh.
- Địa điểm lấy mẫu: Vườn bảo tồn đa dạng cây thuốc – Trại giam Suối II - Ba Vì - Hà Nội
2.3.2. Hóa chất
- H a chất d ng trong tách chiết ADN t ng số:
Quá trình tách chiết sử dụng đệm chiết CTAB và một số hóa chất khác như: Dung dịch Chloroform: Isoamylalcohol (24:1) (C:I); 70% ethanol; Isopropanol; H2O deion.
H a chất PCR: sử dụng bộ kít PCR Master Mix của hãng (Norgen – Canada); H2O deion và các cặp mồi đặc hiệu nhân các gen trnL, ITS1, matK,
PsbA- trnH.
Bảng 2.1. Trình tự và thông tin về c p mồi c hiệu
Gen Kí hiệu
mồi Trình tự mồi 5 -3 ) Nhiệt ộ gắn mồi (OC) ITS1 P12F GGG TTC AAA CGC TCG CCT CGA 58 P12R AGA ATC GGG CGG CTC CGC CG trnH- PsbA
P10F GGA AAT TAT GAG CAT TAG TGA ATC AC
56
P10R GCA TTA CGT TCA TTG CAT AAA CA
trnL
P11F CTT GCA CCC CTT CTA TCC CCA TCT A
58
P11R TCC GTA GCG TCA ACC CGA TTT CGA
H a chất tinh sạch sản phẩm PCR: sử dụng bộ Kit tinh sạch sản phẩm PCR của Norgen – Canada.
H a chất điện di, bao gồm: Agarose, hóa chất nhuộm Red safe, dung dịch đệm điện di TAE 1X, đệm màu Loading Buffer, DNA marker 1kb.
Các loại hóa chất sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào : Môi trường MS, 1/2MS, WBM
Các hóa chất khử trùng mẫu cấy: HgCl2 0,1%
Các chất điều hòa sinh trưởng nhóm cytokinin: BAP, KIN Các chất ĐHST nhóm auxin: IBA, NAA
Đường sucrose (g) Agar (g)
2.3.3. Dụng cụ - máy móc
Dụng cụ nghiền mẫu cối chày sứ, ống eppendorf các loại, pipetman, ống pancol, đầu côn các loại, v.v. Máy móc gồm: bể ổn nhiệt, cân điện tử, máy li tâm lạnh, máy PCR 9700, bể điện di gel agarose nằm ngang, máy soi gel, máy vontex, lò vi sóng, máy chụp ảnh, v.v.
2.4. Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch loài Dây thìa canh Tách chiết ADN tổng số từ mẫu lá Dây thìa canh.
Nhân bản đoạn gen trnL, ITS1, PsbA-trnH bằng phương pháp PCR với mồi đặc hiệu.
Xác định và phân tích trình tự nucleotide của gen ITS1, trnL, trnH- PsbA.
Nội dung 2: Xây dựng quy trình nhân giống Dây thìa canh bằng phương pháp nuôi cấy in vitro.
Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% đến tỷ lệ tạo mẫu sạch và tái sinh chồi;
Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng nhân nhanh chồi;
Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến khả năng nhân nhanh chồi;
Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường và nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến khả năng ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh.
2.4.2. Phương pháp nghiên cứu
2.4.2.1. Xây dựng cơ sở dữ liệu D mã vạch cho loài Dây thìa canh a) Phương pháp tách chiết ADN t ng số
Thực hiện tách chiết ADN từ mẫu lá Dây thìa canh bằng đệm chiết CTAB.
Các bước tiến hành:
- Chuẩn bị dụng cụ, thiết bị và hóa chất. Các dụng cụ đã được hấp khử trùng - Quy trình
+ Nghiền 100 mg mẫu bổ sung thêm 800 - 1000 µl đệm CTAB. Cho dịch vào ống eppendorf 2 ml.
+ Ủ 65o C trong 30 phút.
Trong quá trình ủ cứ 10 phút đảo 1 lần. + Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút.
+ Hút dịch nổi sang ống 2ml. Bổ sung C:I với tỉ lệ 1:1, lắc mạnh. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 15 phút.
+ Lấy dịch nổi sang ống 2ml, bổ sung C:I theo tỉ lệ 1:1. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 15 phút.
+ Lấy dịch nổi sang ống 1,5 ml, bổ sung 400 µl Isopropanol, lắc nhẹ. + Ủ dịch ở -20ᵒ C trong 1 giờ.
+ Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 15 phút.
+ Đổ dịch lấy tủa, rửa bằng 500µl cồn tuyệt đối 2 lần, hong khô khoảng 30 phút. Thêm 100 µl H20 deion, búng nhẹ cho tan.
b) Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm ADN sau tách chiết
Sản phẩm ADN sau tách chiết được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1% trong đệm TE ở hiệu điện thế 80V.
- Cách tiến hành:
Pha gel agarose với nồng độ 1%: Cân 1g agarose cho vào 100 ml dung dịch TAE 1X, đun sôi bằng lò vi sóng cho agarose tan thật đều.
Để hỗn hợp giảm nhiệt độ xuống còn 50 - 600
C, bổ sung Redsafe, trộn đều và đổ vào khay điện di.
Trước khi đổ bản gel cần lau sạch giấy đổ bằng giấy thấm mềm dễ hút ẩm sau đó cài lược. Lược tạo giếng được đặt ở phía cực âm của bể điện di, tiến hành cân bằng mặt phẳng của giá bể bằng giọt nước sao cho giọt nước ở chính giữa hình tròn trên giá. Đổ gel, chờ agarose đông và tháo lược nhẹ nhàng tránh làm nứt, vỡ giếng.
Đổ dung dịch TAE 1X vào bể điện di, thể tích TAE cần thay đổi sao cho phù hợp để đặt bản gel vào trong bể.
Đặt bản gel vào bể điện di, dung dịch TAE trong bể sao cho bản gel ngập khoảng 1mm so với bề mặt dung dịch điện di.
Lấy 8 ở mỗi mẫu ADN đã được tách chiết và trộn với 2 Dye trên bề mặt giấy parafilm. Cho cẩn thận hỗn hợp trên vào giếng điện di bằng micropipet. Ghi chép lại thứ tự tra các mẫu ADN vào giếng, chạy điện di ở 80V trong 90 phút. Quan sát sự dịch chuyển của hỗn hợp mẫu.
Sau khi điện di xong, lấy bản gel từ bể soi trực tiếp dưới đèn tia UV.
c) Phương pháp nhân gen đích bằng kĩ thuật PCR Thành phần phản ứng PCR:
Thể tích mỗi phản ứng PCR mỗi mẫu là 15µl.
Bảng 2.2. Thành ph n phản ứng PCR STT Thành ph n Nồng ộ Thể tích l) 1 H2O deion 4,5 2 Master mix 2 X 7,5 3 Mồi xuôi 10 pM 1 4 Mồi ngược 10 pM 1 5 DNA khuôn 50 ng 1 Tổng thể tích 15
Bảng 2.3. Chu ì nhiệt cho phản ứng PCR
Bƣớc Số chu ì Chu kỳ nhiệt (0C) Thời gian P10 P11 P12 Khởi động 1 94 94 94 4 phút Tách mạch 40 94 94 94 45 giây Gắn mồi 56 58 58 30 giây
Kéo dài 72 72 72 45 giây
Ổn định 1 72 72 72 7 phút
Bảo quản 4 ∞
Các bước tiến hành:
Bước 1: Cho các thành phần phản ứng PCR. Thực hiện ở nhiệt độ thấp. Bước 2: Trộn đều hỗn hợp bằng pipetman.
Bước 3: Lập chương trình và chạy PCR trên máy.
Chu trình nhiệt: Nhiệt độ gắn mồi thay đổi phụ thuộc vào loại mồi của phản ứng.
Sau khi PCR kiểm tra mẫu ADN bằng phương pháp điện di: tra mẫu vào gen Agarose có hòa tan Redsafe trong bể điện di, thêm 1 giếng cho marker để đo độ dài băng ADN. Tiến hành chạy điện di ở 80V trong 90 phút. Soi UV và chụp kết quả.
d) Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự
Những sản phẩm sau khi dược khuếch đại thành công sẽ được tinh sạch bằng kit Prification Kit do hãng Norgen - Canada sản xuất. Các bước tinh sạch như sau:
Bước 1: Thêm một tỉ lệ thể tích là 1:5 của binding solution vào ống chứa sản phẩm PCR (1 thể tích sản phẩm PCR cần 5 thể tích Binding solution) sau đó trộn đều.
Bước 2: Chuyển tối đa 750 dung dịch thu được từ bước 1 sang cột lọc collection tube. Ly tâm với 8000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dung dịch lọc qua cột.
Lưu ý: Nếu dung dịch thu được từ bước một nhiều hơn 750 cần chia để ly tâm hết số dịch đó.
Bước 3: Thêm 500 Washing solution vào cột lọc. Ly tâm 1000 vòng/phút trong 1 phút. Bỏ dịch lọc qua cột.
Ly tâm lại ở 14000 vòng/phút trong 2 phút để loại bỏ hoàn toàn dịch.
Bước 4: Lắp cột vào ống 1,5 ml. Thêm 50 Elution buffer đến trung tâm màng của cột collection tube và ly tâm trong 1 phút ở 13000 vòng/phút.
Sau khi tinh sạch sản phẩm PCR được gửi cho phòng thí nghiệm 1st Base ở Malaysia để giải trình tự. Trình tự nucleotide của đoạn ADN được xác định tại bằng máy giải trình tự, sử dụng bộ Kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing.
2.4.2.2. hân giống Dây thìa canh bằng phương pháp nuôi cấy in vitro
a) Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử tr ng bằng HgCl2 0,1% đến hiệu quả tạo mẫu sạch in vitro và tái sinh chồi.
+ Mẫu cấy là các cành bánh tẻ, sau khi lấy mẫu về đem rửa sạch bằng nước máy, rồi tiếp tục ngâm trong dung dịch xà phòng loãng khoảng 5 – 10 phút và tráng sạch dưới vòi nước chảy, tiếp tục tráng lại 3 - 4 lần bằng nước cất.
+ Khử trùng mẫu: Mẫu sau khi được làm sạch bụi bẩn, cắt bỏ phần thừa tiến hành khử trùng (HgCl2 0,1%) và tráng lại bằng nước cất nhiều lần .
+ Sử dụng cành bánh tẻ Dây thìa canh đã khử trùng cấy vào môi trường đã được chuẩn bị sẵn.
+ Sau khi cấy xong đưa vào phòng nuôi với điều kiện nuôi cấy nhiệt độ phòng từ 22 – 250C, cường độ chiếu sáng 2000 – 2500 lux, Độ ẩm: 60 – 65 % quang chu kì 16h sáng/8h tối. Tiến hành theo dõi mẫu (quan sát bằng mắt thường).
Thí nghiệm 1: ghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử tr ng bằng HgCl20,1% đến hiệu quả tạo mẫu sạch và tái sinh chồi.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 công thức, mỗi công thức thí nghiệm nhắc lại 3 lần như bảng 2.4.
Bảng 2.4. Ảnh hƣởng của thời gian khử trùng ến kết quả tạo mẫu sạch
CTTN Loại hóa chất Thời gian (phút) Tổng số mẫu
CT1 HgCl2 0,1% 5 90 CT2 7 90 CT3 9 90 download by : skknchat@gmail.com
b) ghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến nhân nhanh chồi
Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến nhân nhanh chồi.
Môi trường dinh dưỡng là nhân tố quan trọng, ảnh hưởng rất nhiều đến hiệu quả nhân giống. Thí nghiệm này được tiến hành với 3 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, như bảng 2.5.
Bảng 2.5. Ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng ến nhân nhanh chồi
CTTN Môi trƣờng dinh dƣỡng Tổng số mẫu
MT1 1/2 MS 90
MT2 MS 90
MT3 WPM 90
c) Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến nhân nhanh chồi.
Thí nghiệm 3: ghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ B P đến nhân nhanh chồi.
Khi đã tạo được mẫu sạch in vitro, tiến hành cắt chồi và cấy chuyển vào môi trường nhân nhanh chồi. Thí nghiệm này được sử dụng môi khoáng cơ bản tốt nhất ở thí nghiệm trên bổ sung (0,5 - 2 mg/l) BAP như bảng 2.6.
Bảng 2.6. Ảnh hƣởng của nồng ộ BAP ến nhân nhanh chồi
CTTN BAP (mg/l) Tổng số mẫu CT0 0,0 90 CT1 0,5 90 CT2 1 90 CT3 1,5 90 CT4 2 90 download by : skknchat@gmail.com
Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của nồng độ BAP, inetin và đến nhân nhanh chồi.
Trên cơ sở chọn được được môi trường tốt nhất ở thí nghiệm 3, tiếp tục thí nghiệm với việc bổ sung (0,1 – 0,7 mg/l) Kinetin; 0,1 mg/l NAA như bảng 2.7.
Bảng 2.7. Ảnh hƣởng của nồng ộ BAP, Kinetin và α-NAA ến nhân nhanh chồi
CTTN
Chất ĐHST mg/l)
Tổng số mẫu
BAP Kinetin NAA
NT0 Nồng độ thích hợp nhất 0 0 90 NT1 0,1 0,1 90 NT2 0,3 0,1 90 NT3 0,5 0,1 90 NT4 0,7 0,1 90
d. Phương pháp nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh in vitro:
Thí nghiệm 5: ghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng sucrose đến khả năng ra rễ
Trong nội dung nghiên cứu này, thí nghiệm được bố trí với môi trường khoáng cơ bản MS bổ sung 0,1 mg/l IBA; 0,1 mg/l α-NAA; (10-20 g/l) sucrose như bảng 2.8 sau:
Bảng 2.8. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng sucrose ến khả năng ra rễ CTTN Lƣợng sucrose (g/l) Số lƣợng mẫu ĐC 00 90 ĐT1 10 90 ĐT2 15 90 ĐT3 20 90 download by : skknchat@gmail.com
Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và IB đến khả năng ra rễ
Chồi được tạo ra với số lượng đủ lớn, đạt tiêu chuẩn (chiều cao: 3 - 5 cm), cắt và cấy chuyển vào môi trường tạo rễ, thí nghiệm được bố trí như bảng 2.9 sau:
Bảng 2.9. Ảnh hƣởng tổ hợp nồng ộ IBA và NAA ến khả năng ra rễ
CTTN Chất ĐHST mg/l) Số lƣợng mẫu IBA α-NAA ĐC 00 00 90 RT1 0,2 00 90 RT2 0,4 00 90 RT3 0,6 00 90 RT4 00 0,2 90 RT5 00 0,4 90 RT6 00 0,6 90 RT7 0,3 0,3 90
2.4.3. Chỉ tiêu theo dõi, đánh giá
Số mẫu sạch
+ Tỷ lệ mẫu sạch (%) = x 100%
Số mẫu ban đầu
Số mẫu tạo cum chồi
+ Tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi (%) = x 100%
Số mẫu cấy ban đầu
Tổng số chồi hình thành + Hệ số nhân chồi (lần) =
Số chồi cấy ban đầu Tổng số chồi
+ Số chồi TB/cụm =
Số cụm chồi
Tổng chiều cao chồi + Chiều cao trung bình chồi (cm) =
Tổng số chồi theo dõi Tổng chồi ra rễ
+ Tỷ lệ ra rễ (%) =
Tổng số chồi theo dõi Tổng số rễ ra (rễ) + Số rễ trung bình/cây (rễ) =
Tổng số mẫu cấy (mẫu)
2.4.4. Phương pháp theo dõi
Đối với các thí nghiệm vào mẫu: các chỉ tiêu theo dõi được quan sát và đo đếm 1 lần sau 30 ngày, các thí nghiệm giai đoạn nhân nhanh sau 45 ngày, các thí nghiệm ra rễ theo dõi sau 20, 30 ngày từ khi cấy vào bình rễ.
2.4.5. Phương pháp xử lý số liệu
Các thí nghiệm được thiết kế theo phương pháp Sinh học thực nghiệm với số mẫu ≥ 30, lặp lại 3 lần. Số liệu được phân tích theo phương pháp thống kê sinh học ứng dụng các phần mềm đã lập trình trên máy tính điện tử như Excel và SPSS (Nguyễn Hải Tuất và CS, 2005).
2.5. Địa iểm và thời gian bố trí thí nghiệm
Các thí nghiệm được tiến hành tại Viện công nghệ sinh học Lâm nghiệp; Thời gian tiến hành thí nghiệm: 6/2017 – 10/2018.
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch cây Dây thìa canh
3.1.1. ết quả tách chiết ADN t ng số
Tách chiết ADN là một bước khởi đầu rất quan trọng, nó quyết định sự thành công cho phản ứng PCR về sau. Để tách chiết ADN đạt hiệu suất và độ tinh sạch cao thì cần lựa chọn một phương pháp tách chiết phù hợp với đối tượng nghiên cứu.
Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ các mẫu lá được tách theo phương pháp tách chiết ADN của Shagai maroof có cải tiến cho phù hợp với tách chiết ADN của Dây thìa canh.
Sau khi tiến hành tách chiết, ADN tổng số được điện di trên gel Agarose 1% để kiểm tra và thu được kết quả như hình 3.1
Hình 3.1. Kết quả iện di ADN tổng số của 5 mẫu Dây thìa canh
Kết quả điện di cho thấy các băng vạch ADN sáng nét, không có băng phụ, chứng tỏ ADN tổng số tách chiết được từ mẫu lá Dây thìa canh tương đối tốt. Băng có độ sáng tương tự nhau, chứng tỏ hàm lượng ADN tổng số tách chiết được từ các mẫu tương đối đồng đều. Các mẫu ADN tổng số sau khi tách chiết được đo kiểm tra hàm lượng và độ sạch bằng phương pháp quang phổ kế (đo trên máy Nanodorf 200), kết quả cho thấy tỷ lệ OD260/280 nm của 5 mẫu ADN tách chiết đều nằm trong khoảng 1,8 – 2,0; điều này chứng tỏ các mẫu ADN đảm bảo độ tinh sạch để thực hiện phản ứng PCR với mồi đặc hiệu. Hàm lượng ADN ở từng mẫu được pha loãng về nồng độ 50 ng/µl để thực hiện PCR
3.1.2. ết quả PCR các đoạn mã vạch ADN