MC LC
2.4.2. Phương pháp nghiên cứu
2.4.2.1. Xây dựng cơ sở dữ liệu D mã vạch cho loài Dây thìa canh a) Phương pháp tách chiết ADN t ng số
Thực hiện tách chiết ADN từ mẫu lá Dây thìa canh bằng đệm chiết CTAB.
Các bước tiến hành:
- Chuẩn bị dụng cụ, thiết bị và hóa chất. Các dụng cụ đã được hấp khử trùng - Quy trình
+ Nghiền 100 mg mẫu bổ sung thêm 800 - 1000 µl đệm CTAB. Cho dịch vào ống eppendorf 2 ml.
+ Ủ 65o C trong 30 phút.
Trong quá trình ủ cứ 10 phút đảo 1 lần. + Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút.
+ Hút dịch nổi sang ống 2ml. Bổ sung C:I với tỉ lệ 1:1, lắc mạnh. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 15 phút.
+ Lấy dịch nổi sang ống 2ml, bổ sung C:I theo tỉ lệ 1:1. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 15 phút.
+ Lấy dịch nổi sang ống 1,5 ml, bổ sung 400 µl Isopropanol, lắc nhẹ. + Ủ dịch ở -20ᵒ C trong 1 giờ.
+ Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 15 phút.
+ Đổ dịch lấy tủa, rửa bằng 500µl cồn tuyệt đối 2 lần, hong khô khoảng 30 phút. Thêm 100 µl H20 deion, búng nhẹ cho tan.
b) Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm ADN sau tách chiết
Sản phẩm ADN sau tách chiết được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1% trong đệm TE ở hiệu điện thế 80V.
- Cách tiến hành:
Pha gel agarose với nồng độ 1%: Cân 1g agarose cho vào 100 ml dung dịch TAE 1X, đun sôi bằng lò vi sóng cho agarose tan thật đều.
Để hỗn hợp giảm nhiệt độ xuống còn 50 - 600
C, bổ sung Redsafe, trộn đều và đổ vào khay điện di.
Trước khi đổ bản gel cần lau sạch giấy đổ bằng giấy thấm mềm dễ hút ẩm sau đó cài lược. Lược tạo giếng được đặt ở phía cực âm của bể điện di, tiến hành cân bằng mặt phẳng của giá bể bằng giọt nước sao cho giọt nước ở chính giữa hình tròn trên giá. Đổ gel, chờ agarose đông và tháo lược nhẹ nhàng tránh làm nứt, vỡ giếng.
Đổ dung dịch TAE 1X vào bể điện di, thể tích TAE cần thay đổi sao cho phù hợp để đặt bản gel vào trong bể.
Đặt bản gel vào bể điện di, dung dịch TAE trong bể sao cho bản gel ngập khoảng 1mm so với bề mặt dung dịch điện di.
Lấy 8 ở mỗi mẫu ADN đã được tách chiết và trộn với 2 Dye trên bề mặt giấy parafilm. Cho cẩn thận hỗn hợp trên vào giếng điện di bằng micropipet. Ghi chép lại thứ tự tra các mẫu ADN vào giếng, chạy điện di ở 80V trong 90 phút. Quan sát sự dịch chuyển của hỗn hợp mẫu.
Sau khi điện di xong, lấy bản gel từ bể soi trực tiếp dưới đèn tia UV.
c) Phương pháp nhân gen đích bằng kĩ thuật PCR Thành phần phản ứng PCR:
Thể tích mỗi phản ứng PCR mỗi mẫu là 15µl.
Bảng 2.2. Thành ph n phản ứng PCR STT Thành ph n Nồng ộ Thể tích l) 1 H2O deion 4,5 2 Master mix 2 X 7,5 3 Mồi xuôi 10 pM 1 4 Mồi ngược 10 pM 1 5 DNA khuôn 50 ng 1 Tổng thể tích 15
Bảng 2.3. Chu ì nhiệt cho phản ứng PCR
Bƣớc Số chu ì Chu kỳ nhiệt (0C) Thời gian P10 P11 P12 Khởi động 1 94 94 94 4 phút Tách mạch 40 94 94 94 45 giây Gắn mồi 56 58 58 30 giây
Kéo dài 72 72 72 45 giây
Ổn định 1 72 72 72 7 phút
Bảo quản 4 ∞
Các bước tiến hành:
Bước 1: Cho các thành phần phản ứng PCR. Thực hiện ở nhiệt độ thấp. Bước 2: Trộn đều hỗn hợp bằng pipetman.
Bước 3: Lập chương trình và chạy PCR trên máy.
Chu trình nhiệt: Nhiệt độ gắn mồi thay đổi phụ thuộc vào loại mồi của phản ứng.
Sau khi PCR kiểm tra mẫu ADN bằng phương pháp điện di: tra mẫu vào gen Agarose có hòa tan Redsafe trong bể điện di, thêm 1 giếng cho marker để đo độ dài băng ADN. Tiến hành chạy điện di ở 80V trong 90 phút. Soi UV và chụp kết quả.
d) Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự
Những sản phẩm sau khi dược khuếch đại thành công sẽ được tinh sạch bằng kit Prification Kit do hãng Norgen - Canada sản xuất. Các bước tinh sạch như sau:
Bước 1: Thêm một tỉ lệ thể tích là 1:5 của binding solution vào ống chứa sản phẩm PCR (1 thể tích sản phẩm PCR cần 5 thể tích Binding solution) sau đó trộn đều.
Bước 2: Chuyển tối đa 750 dung dịch thu được từ bước 1 sang cột lọc collection tube. Ly tâm với 8000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dung dịch lọc qua cột.
Lưu ý: Nếu dung dịch thu được từ bước một nhiều hơn 750 cần chia để ly tâm hết số dịch đó.
Bước 3: Thêm 500 Washing solution vào cột lọc. Ly tâm 1000 vòng/phút trong 1 phút. Bỏ dịch lọc qua cột.
Ly tâm lại ở 14000 vòng/phút trong 2 phút để loại bỏ hoàn toàn dịch.
Bước 4: Lắp cột vào ống 1,5 ml. Thêm 50 Elution buffer đến trung tâm màng của cột collection tube và ly tâm trong 1 phút ở 13000 vòng/phút.
Sau khi tinh sạch sản phẩm PCR được gửi cho phòng thí nghiệm 1st Base ở Malaysia để giải trình tự. Trình tự nucleotide của đoạn ADN được xác định tại bằng máy giải trình tự, sử dụng bộ Kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing.
2.4.2.2. hân giống Dây thìa canh bằng phương pháp nuôi cấy in vitro
a) Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử tr ng bằng HgCl2 0,1% đến hiệu quả tạo mẫu sạch in vitro và tái sinh chồi.
+ Mẫu cấy là các cành bánh tẻ, sau khi lấy mẫu về đem rửa sạch bằng nước máy, rồi tiếp tục ngâm trong dung dịch xà phòng loãng khoảng 5 – 10 phút và tráng sạch dưới vòi nước chảy, tiếp tục tráng lại 3 - 4 lần bằng nước cất.
+ Khử trùng mẫu: Mẫu sau khi được làm sạch bụi bẩn, cắt bỏ phần thừa tiến hành khử trùng (HgCl2 0,1%) và tráng lại bằng nước cất nhiều lần .
+ Sử dụng cành bánh tẻ Dây thìa canh đã khử trùng cấy vào môi trường đã được chuẩn bị sẵn.
+ Sau khi cấy xong đưa vào phòng nuôi với điều kiện nuôi cấy nhiệt độ phòng từ 22 – 250C, cường độ chiếu sáng 2000 – 2500 lux, Độ ẩm: 60 – 65 % quang chu kì 16h sáng/8h tối. Tiến hành theo dõi mẫu (quan sát bằng mắt thường).
Thí nghiệm 1: ghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử tr ng bằng HgCl20,1% đến hiệu quả tạo mẫu sạch và tái sinh chồi.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 công thức, mỗi công thức thí nghiệm nhắc lại 3 lần như bảng 2.4.
Bảng 2.4. Ảnh hƣởng của thời gian khử trùng ến kết quả tạo mẫu sạch
CTTN Loại hóa chất Thời gian (phút) Tổng số mẫu
CT1 HgCl2 0,1% 5 90 CT2 7 90 CT3 9 90 download by : skknchat@gmail.com
b) ghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến nhân nhanh chồi
Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến nhân nhanh chồi.
Môi trường dinh dưỡng là nhân tố quan trọng, ảnh hưởng rất nhiều đến hiệu quả nhân giống. Thí nghiệm này được tiến hành với 3 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, như bảng 2.5.
Bảng 2.5. Ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng ến nhân nhanh chồi
CTTN Môi trƣờng dinh dƣỡng Tổng số mẫu
MT1 1/2 MS 90
MT2 MS 90
MT3 WPM 90
c) Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến nhân nhanh chồi.
Thí nghiệm 3: ghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ B P đến nhân nhanh chồi.
Khi đã tạo được mẫu sạch in vitro, tiến hành cắt chồi và cấy chuyển vào môi trường nhân nhanh chồi. Thí nghiệm này được sử dụng môi khoáng cơ bản tốt nhất ở thí nghiệm trên bổ sung (0,5 - 2 mg/l) BAP như bảng 2.6.
Bảng 2.6. Ảnh hƣởng của nồng ộ BAP ến nhân nhanh chồi
CTTN BAP (mg/l) Tổng số mẫu CT0 0,0 90 CT1 0,5 90 CT2 1 90 CT3 1,5 90 CT4 2 90 download by : skknchat@gmail.com
Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của nồng độ BAP, inetin và đến nhân nhanh chồi.
Trên cơ sở chọn được được môi trường tốt nhất ở thí nghiệm 3, tiếp tục thí nghiệm với việc bổ sung (0,1 – 0,7 mg/l) Kinetin; 0,1 mg/l NAA như bảng 2.7.
Bảng 2.7. Ảnh hƣởng của nồng ộ BAP, Kinetin và α-NAA ến nhân nhanh chồi
CTTN
Chất ĐHST mg/l)
Tổng số mẫu
BAP Kinetin NAA
NT0 Nồng độ thích hợp nhất 0 0 90 NT1 0,1 0,1 90 NT2 0,3 0,1 90 NT3 0,5 0,1 90 NT4 0,7 0,1 90
d. Phương pháp nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh in vitro:
Thí nghiệm 5: ghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng sucrose đến khả năng ra rễ
Trong nội dung nghiên cứu này, thí nghiệm được bố trí với môi trường khoáng cơ bản MS bổ sung 0,1 mg/l IBA; 0,1 mg/l α-NAA; (10-20 g/l) sucrose như bảng 2.8 sau:
Bảng 2.8. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng sucrose ến khả năng ra rễ CTTN Lƣợng sucrose (g/l) Số lƣợng mẫu ĐC 00 90 ĐT1 10 90 ĐT2 15 90 ĐT3 20 90 download by : skknchat@gmail.com
Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và IB đến khả năng ra rễ
Chồi được tạo ra với số lượng đủ lớn, đạt tiêu chuẩn (chiều cao: 3 - 5 cm), cắt và cấy chuyển vào môi trường tạo rễ, thí nghiệm được bố trí như bảng 2.9 sau:
Bảng 2.9. Ảnh hƣởng tổ hợp nồng ộ IBA và NAA ến khả năng ra rễ
CTTN Chất ĐHST mg/l) Số lƣợng mẫu IBA α-NAA ĐC 00 00 90 RT1 0,2 00 90 RT2 0,4 00 90 RT3 0,6 00 90 RT4 00 0,2 90 RT5 00 0,4 90 RT6 00 0,6 90 RT7 0,3 0,3 90