MC LC
3.2.5. Ảnh hưởng của hàm lượng sucrose đến khả năng ra rễ
Khả năng quang hợp và sinh trưởng của cây in vitro bị hạn chế bởi nồng độ khí CO2 cung cấp cho cây trong bình nuôi cấy không đủ trong suốt thời gian chiếu sáng (Desjardins et al.,1988; Fujiwara et al., 1987; Kozai, 1991). Nên khả năng quang hợp sẽ bị ảnh hưởng, do đó đòi hỏi phải cung cấp nguồn cacbon cho các hoạt động sinh trưởng của tế bào. Trong giai đoạn tạo rễ, chồi đã có lá đầy đủ và được nuôi cấy trong bình để dưới giàn đèn neon giúp cây có thể quang hợp để tạo ra lượng đường nhất định nên việc bổ sung thêm lượng đường vừa đủ cũng rất cần thiết đối với giai đoạn tạo rễ, nếu bổ sung quá nhiều đường sẽ lãng phí và môi trường có thể dễ bị nhiễm khuẩn. Trong nội dung nghiên cứu này, thí nghiệm được bố trí với môi trường khoáng cơ bản MS bổ sung 0,1 mg/l IBA, 0,1 mg/l NAA, (10 - 20) g/l sucrose. Kết quả được trình bày ở bảng 3.6.
Bảng 3.6. Kết quả ảnh hƣởng của hàm lƣợng sucrose ến khả năng ra rễ CTTN Sucrose (g/l) Tỉ lệ ra rễ (%) Số rễ TB/cây Chiều dài TB/rễ
(cm)
ĐT1 10 62,33c 1,21c 1,9bc
ĐT2 15 71,67b 1,93b 2,2cb
ĐT3 20 78,33a 2,70a 3,1d
Ghi chú: Chữ cái khác nhau trong các bảng số liệu thể hiện sự sai khác c ý nghĩa thống kê α = 0,05 trong phép phân tích SPSS
Biểu ồ 3.5. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng sucrose ến khả năng ra rễ
Kết quả thí nghiệm (bảng 3.6 và biểu đồ 3.5) cho thấy các công thức thí nghiệm với lượng đường khác nhau đã tạo sự khác biệt, trong công thức ĐT3 bổ sung lượng sucrose 20 mg/l cho kết quả tạo rễ tốt nhất với tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/cây, chiều dài rễ đạt được lần lượt là 78,33%; 2,7 rễ/cây; 3,1 cm. Kết quả xử lý thống kê cũng cho thấy sự khác nhau trên có ý nghĩa.
3.2.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và IBA đến khả năng ra rễ
Tạo cây hoàn chỉnh là bước cuối trong quy trình nuôi cấy in vitro trước khi đưa cây ra huấn luyện và trồng ngoài vườn ươm nên việc nghiên cứu cho ra rễ tạo cây hoàn chỉnh với tỷ lệ cao là quan trọng. Theo Farooq et al. (2008), auxin có vai trò trong việc tạo rễ ở môi trường tạo rễ in vitro, thông qua ảnh hưởng của nó đến sự phân chia tế bào và hình thành rễ đầu tiên. Trong nội dung nghiên cứu này, các công thức thí nghiệm được bố trí với môi trường khoáng cơ bản MS có bổ sung hai chất điều hòa sinh trưởng nhóm auxin là (0,2 – 0,6 mg/l) IBA và (0,2 - 0,6 mg/l) NAA. Kết quả theo dõi trong 6 tuần được trình bày ở bảng 3.7. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 ĐT1 ĐT2 ĐT3 62,33 71,67 78,33 % Tỉ lệ ra rễ %) Tỉ lệ ra rễ (%) download by : skknchat@gmail.com
Bảng 3.7. Kết quả ảnh hƣởng nồng ộ IBA và NAA ến khả năng ra rễ
CTTN
Chất ĐHST
(mg/l) Tỉ lệ ra rễ (%) Số rễ TB/cây Chiều dài rễ (cm) IBA NAA ĐC 00 00 19,68a 0,40hgd 0,63a RT1 0,2 00 67,06bef 1,44ghd 2,33bf RT2 0,4 00 86,51ch 2,53fb 3,40cd RT3 0,6 00 96,54dg 3,56e 3,90dc RT4 00 0,2 61,35ebf 2,98dhg 2,80egh RT5 00 0,4 76,67fbe 1,97c 2,33fb RT6 00 0,6 90,01gd 2,26bf 3,13ghe RT7 0,3 0,3 88,52hc 2,11a 2,87hge
Ghi chú: Chữ cái khác nhau trong các bảng số liệu thể hiện sự sai khác c ý nghĩa thống kê α = 0,05 trong phép phân tích SPSS
Biểu ồ 3.6. Ảnh hƣởng nồng ộ IAA và NAA ến khả năng ra rễ
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 ĐC RT1 RT2 RT3 RT4 RT5 RT6 RT7 19,68 67,06 86,51 96,54 61,35 76,67 90,01 88,52 Tỉ lệ ra rễ %) Tỉ lệ ra rễ (%) download by : skknchat@gmail.com
Kết quả thu được (bảng 3.7 và biểu đồ 3.6) cho thấy, mẫu cấy ở các công thức môi trường đều ra rễ, trong đó chồi in vitro được cấy trên môi trường khoáng cơ bản MS không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng (R0), tỷ lệ ra rễ thấp chỉ đạt 19,68 %, số rễ trung bình chỉ đạt 0,4 rễ/cây, chiều dài trung của rễ 0,63 cm, rễ màu trắng nhạt, mảnh. Các công thức môi trường có sử dụng chất điều hòa sinh trưởng thực vật với liều lượng khác nhau (0,2 - 0,6 mg/l) IBA (RT1-RT3) cho tỷ lệ ra rễ cao nhất ở RT3 đạt 96,54%, số rễ trung bình đạt 3,56 rễ/cây và chiều dài rễ trung bình đạt 3,9 cm. Công thức môi trường bổ sung (0,2 - 0,6 mg/l) NAA (RT4 - RT6) có tỷ lệ chồi ra rễ đạt 61,35 đến 90,01%, với số rễ trung bình/cây, chiều dài trung bình/rễ cao nhất lần lượt là 2,26 rễ; 3,13 cm (RT6). Thí nghiệm bổ sung đồng thời cả IBA và NAA (RT7) cho tỷ lệ ra rễ đạt 88,52%, với số rễ trung bình/cây, chiều dài trung bình/rễ lần lượt là 2,11 rễ; 2,87 cm. Như vậy, có thể chọn công thức môi trường RT3 là môi trường MS bổ sung 0,6 mg/l IBA là phù hợp nhất cho nuôi cấy ra rễ tạo cây hoàn chỉnh đối với Dây thìa canh.Kết quả xử lý thống kê cũng cho thấy sự khác nhau có ý nghĩa.
Tạo rễ ở các môi trường khác nhau Tạo rễ ở môi trường RT3
Hình 3.11. Dây thìa canh hoàn chỉnh
KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
Đã xác định được trình tự nucleotide của đoạn gen trnH- PsbA, trnL và
ITS1 của các sản phẩm PCR có kích thước tương ứng là 565bp, 567bp và
767bp và chỉ ra sự sai khác chỉ ở 01 cặp nucleotide của cả 3 đoạn gen trên so với các trình tự gen trnH-PsbA, trnL và ITS1 của các loài thuộc chi Gymnema,
với mã số trên NCBI lần lượt là: MF064898.1, KE953920.1 và MG730191.1. Nghiên cứu nhân giống in vitro Dây thìa canh đã đạt được một số kết quả sau:
Khử trùng mẫu cành Dây thìa canh là khử trùng kép bằng dung dịch HgCl2 0,1% trong 7 phút. Nuôi cấy trên môi trường khoáng cơ bản MS bổ sung 0,2 mg/l BAP, 30 g/l sucrose, 6,5 g/l agar đạt tỷ lệ mẫu sạch 72,15%, tỷ lệ tái sinh 68,25%.
Nhân nhanh chồi Dây thìa canh trên môi trường khoáng cơ bản MS bổ sung 1,5 mg/l BAP, 0,5 mg/l Kinetin, 0,1 mg/l NAA, 100 ml/l nước dừa, 100 g/l khoai tây, 6,5 g/l agar, 30 g/l sucrose, cho tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi là 96,66%, số chồi trung bình trên mẫu 3,45 chồi, chiều cao chồi 4,23 cm, chồi cao, mập, lá màu xanh đậm.
Kích thích ra rễ tạo cây hoàn chỉnh trên môi trường khoáng cơ bản MS bổ sung 0,6 mg/l IBA, 100 ml/l nước dừa, 100 g/l khoai tây, 20 g/l sucrose, 6,5 g/l agar. Tỷ lệ ra rễ đạt 96,54%, số rễ trung bình đạt 3,56 rễ/cây với chiều dài rễ 3,90 cm.
2. Kiến nghị
- Đăng kí trình tự các đoạn mã vạch đã nghiên cứu trên ngân hàng gen quốc tế NCBI.
- Tiếp tục nghiên cứu thiết kế cặp mồi thích hợp cho việc nhân gen để tiến hành giải trình nucleotide xác định đoạn ADN đặc trưng những gen còn lại từ mẫu ADN dây thìa canh.
- Tiếp tục nghiên cứu với nhiều thang nồng độ chất điều hòa sinh trưởng để nhân nhanh chồi và ra rễ tạo cây hoàn chỉnh để đưa ra công thức phù hợp nhất cho hệ số nhân nhanh chồi và ra rễ .
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Trần Thế Bách (2007), ghiên cứu phân loại Họ Thiên Lý ở Việt am, Luận án Tiến sỹ Sinh học, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật.
2 Võ Văn Chi (2007), Sách tra cứu tên cây cỏ Việt am, NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, tr.283-284.
3 Võ Văn Chi (2004), Từ điển thực vật thông dụng tập 2, NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.
4 Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt am (Tập 2), NXB Trẻ, tr. 671-703 5 Hà Văn Huân (2015), Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử ADN (mã vạch
DNA) trong phân tích đa dạng di truyền và giám định sinh vật ở Việt Nam, Ngân hàng dữ liệu DNA Việt Nam.
6 Huỳnh Văn Kéo, Ngô Viết Nhơn (2006), Nghiên cứu bảo tồn nguồn gen thực vật ở vườn quốc gia Bạch Mã. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 1(2): 127-129.
7 Trần Văn Minh, Bùi Thị Tường Thu (2003), Ứng dụng công nghệ tế bào thực vật phục hồi loài gỗ quý Giá tỵ, Những vấn đề cơ bản của sự sống trong khoa học sự sống, Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc lần thứ 2, 25-26/7/2003, NXB Khoa học và Kỹ thuật, 352-357
8 Trần Văn Minh, Bùi Thị Tường Thu (2003), Ứng dụng công nghệ tế bào thực vật phục hồi loài cây đặc sản Trầm hương. Những vấn đề cơ bản của sự sống trong khoa học sự sống, Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc lần thứ 2, 25- 26/7/2003, NXB Khoa học và Kỹ thuật, 358-361.
9 Lưu Trường Sinh, Hoàng Văn Lương (2005), Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân nhanh cây Trinh nữ hoàng cung bằng phương pháp in vitro. Những vấn đề cơ bản của sự sống trong khoa học sự sống, Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc 2005, Hà Nội 3/11/2005, NXB Khoa học và Kỹ thuật, 722-724. 10 Nguyễn Quang Thạch (2000). Giáo trình sinh lý thực vật. Nxb Nông nghiệp
Hà Nội.
11 Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh (2000). Bài giảng môn học công nghệ sinh học thực vật - Trường Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội.
12 .Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương Thảo (2005), Giáo trình Công nghệ sinh học nông nghiệp, NXb Nông Nghiệp Hà Nội
13 Đinh Thị Thu Thủy (2014), Đánh giá tác dụng hạ glucose máu của dịch chiết lá các loài trong chi Gymnema R.Br ở Việt Nam, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Thư viện trường Đại học Dược Hà Nội.
14 Phạm Hà Thanh Tùng (2012), Nghiên cứu tính đa dạng thực vật và thành phần hoá học của các loài trong chi Gymnema R.Br. ở Việt nam, Luận văn thạc sĩ dược học, Thư viện trường Đại học Dược Hà Nội.
15 Nguyễn Văn Uyển (1993). uôi cấy mô thực vật phục vụ công tác giống cây trồng. Nxb Nông nghiệp, tr. 23-44.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
16. Baskaran et al (1990), “Antidiabetic effect of a leaf extract from Gymnema sylvestre in non-insulin dependent diabetes mellitus patients”, Journal of Ethnopharmacology 30(3), pp. 295-300.
17. Balaraju K, Agastian P, Preetamraj JP, Arokiyaraj S, Ignaciumthu S (2008), Micropropagation of Vitex agnuscatus (Verbenaceae) - Avaluable medicinal plant. In vitro Cellular & Developmental Biology - Plant, 44(5): 436-411. 18. Baharum, S.N (2012), “Application of 16s rDNA and cytochrome b ribosomal
markers in studies of lineage and fish populations structure of aquatic species”,
Molecular biology reports, 39 (5), pp. 5225-5232.
19. Brown, B, Emberson R.M, and Paterson A.M (1999), “Mitochondrial COI and II provide useful markers for Wiseana (Lepidoptera: Hepialidae) species identification”, Bulletin of Entomological Research, 89 (04), pp. 287-293. 20. Casiraghi, M, Labra M, Ferri E, Galimberti A, and De Mattia F (2010), “DNA
barcoding: theoretical aspects and practical applications”.
21. Chase, M.W, Cowan R.S, et al (2007),“A proposal for a standardised protocol to barcode all land plants”, Taxon, 56 (2), pp. 295-299.
22. Chen, S, Yao H, et al (2010), “Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species”, PloS one, 5 (1), pp. e8613. 23. Chiou, S.-J, Yen J.-H, Fang C.-L, Chen H.-L, and Lin T.-Y. (2007),
“Authentication of medicinal herbs using PCR-amplified ITS2 with specific primers”, Planta medica, 73 (13), pp. 1421-1426.
24. Chase M. W, Nicolas S, Mike W, James M. D, Rao P. K., Nadia H., and Vincent S. (2005), “Land plants and DNA barcodes: short-term and long-term goals”, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 360 (1462): 1889 - 1895.
25. Fazekas, A.J., Burgess K.S., et al. (2008), “Multiple multilocus DNA barcodes from the plastid genome discriminate plant species equally well”, PLoS One, 3 (7), pp. e2802.
26. Ford, C.S, Ayres K.L, et al. (2009), “Selection of candidate coding DNA barcoding regions for use on land plants”, Botanical Journal of the Linnean Society, 159 (1), pp. 1-11.
27. Group, C.P.W, Hollingsworth P.M, et al. (2009), “A DNA barcode for land plants”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 106 (31), pp. 12794-12797.
28. Havens K, Guerrant E, Maunder M (1999), Strategies for survival: Ex situ
Plant conservation. Report of a research symposium held at the Chicago Botanic Garden, BG Journal, 3(3).
29. Hebert, P.D, Cywinska A, and Ball S.L. (2003), “Biological identifications through DNA barcodes”, Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences, 270 (1512), pp. 313-321.
30. Hebert, P.D, Penton E.H, Burns J.M, Janzen D.H, and Hallwachs W. (2004), “Ten species in one: DNA barcoding reveals cryptic species in the neotropical skipper butterfly Astraptes fulgerator”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 101 (41), pp. 14812-14817.
31. Hebert, P.D, Ratnasingham S, and De Waard J.R (2003), “Barcoding animal life:cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related
species”, Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences, 270 (Suppl 1), pp. S96-S99.
32. Hollingsworth, M.L, Andra Clark A, et al. (2009), “Selecting barcoding loci for plants: evaluation of seven candidate loci with species- level sampling in three divergent groups of land plants”, Molecular Ecology Resources, 9 (2), pp. 439-457.
33. Hollingsworth, P.M. (2011), “Refining the DNA barcode for land plants”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 108 (49), pp. 19451-19452. 34. Hollingsworth, P.M, Graham S.W, and Little D.P. (2011), “Choosing and
using a plant DNA barcode”, PloS one, 6 (5), pp. e19254.
35. Joshi M, Dhar U (2003), In vitro propagation of Saussurea obvallata Edgew - An endangered ethnoreligious medicinal herb of Himalaya, Plant Cell Rep, 21(10): 933-939.
36. K. Grover et al. (2002), “Medicinal plants of India with anti-diabetic potential”, Journal of Ethnopharmacology 81, pp. 81-100.
37. Kapoor LD. (1990), “Handbook of Ayurvedic Medicinal Plants”, Boca Raton, F.L, CRC Press, pp. 200-201.
38. Lee H, Yi D, Kim J, and Kim K, Development of plant DNA barcoding markers from the variable noncoding regions of chloroplast genome in Abstract presented at the second international barcode of life conference. Academia Sinica, Taipei, Taiwan. 2007.
39. Logacheva M, Penin A, Samigullin T, Vallejo-Roman C, and Antonov A (2007), “Phylogeny of flowering plants by the chloroplast genome sequences: in search of a “lucky gene””, Biochemistry (Moscow), 72 (12), pp. 1324-1330. 40. N. Shigematsu et al (2001), “Effect of administration with the extract of
Gymnema sylvestre R.Br. leaves on lipid metabolism in rats”, Biol. Pharm. Bull. 24(6), 713-717.
41. Nerea Larranaga and José L. Hormaza (2015), “DNA barcoding of perennial fruit tree species of agronomic interest in the genus Annona ( Annonaceae)
42. Park SU, Kim YK, Lee SY (2009), Improved in vitro plant regeneration and micropropagation of Rehmannia glutinosa L. Journal of Medicial Plants Research, 3(1): 031-034.
43. Pereira AM, Amui SF, Bertoni BW, Moraes RM, Franca SC (2003), Micropropagation of Anemopaegma arvense: Conservation of an endangered madicinal plant, Plant Med, 69(6): 571-573.
44. Schoch, C.L, Seifert K.A, et al (2012), “Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 109 (16), pp. 6241- 6246. 45. Scharaschklin T, Doyle J.A.( 2005), Phylogeny and historical biogeography of
Anaxagorea (Annonaceae) using morphology and noncoding chloroplast sequence data. Syst. Bot. 30: 712–735.
46. Shaw J, Lickey E.B, Schilling E. E, Small R.L (2007), “Comparison of whole chloroplast genome sequences to choose noncoding regions for phylogenetic studies in angiosperms”, The tortoise and the hare III. Amer. J. Bot, (94): 275-288.
47. Takhtajan (2009), "Flowering Plants", Springer Verlag.
48. Taberlet P, Eric C, François P, Ludovic G, Christian M, Alice V, Thierry V, Gérard C, Christian B, and Eske W (2007),” Power and limitations of the chloroplast trnL (UAA) intron for plant DNA barcoding”, Nucleic Acids Res, 35(3): 14
49. Van den Berg C, Higgins W. E, Dressler R. L, Whitten W. M, Soto Arenas M. A, Culham A, Chase M. W (2000), “A phylogenetic analysis of Laeliinae (Orchidaceae) based on sequence data from nuclear internal transcribed spacers (ITS) of ribosomal DNA”, Lindleyana 15: 96114.
50. Van DeWiel C. C. M, Van Der Schoot J, Van Valkenburg J. L, Duistermaat C. H, Smulders (2009), “DNA barcoding discriminates the noxious invasive plant species, floating pennywort (Hydrocotyle ranunculoides L.f.), from non- invasive relatives”, Molecular Ecology Resources 9: 1086-1091.
51. Vijayan K and Tsou C. H (2010), “DNA barcoding in plants: taxonomy in a new perspective”, Current science, 99: 1530 – 1540
52. Wu Z. Y & P. H. Raven (1995), “Flora of China. Vol. 16 (Gentianaceae through Boraginaceae)”, Science Press, Beijing, and Missouri Botanical Garden Press, St. Louis. pp.479.
53. Wang W, Wu Y, Yan Y, Ermakova M, Kerstetter R (2010), “DNA barcoding of the Lemnaceae, a family of aquatic monocots”, BMC Plant Biology 10: 205