MC LC
3.1.3. Phân tích trình tự các đoạn mã vạch ADN với các đoạn mồi khác
Với cách lựa chọn ba mẫu Dây thìa canh cùng ba lần lặp lại ở mỗi mẫu, tổng cộng thu được 15 trình tự nucleotide cho một đoạn mã vạch ADN đề xuất. Chất lượng trình tự nucleotide là cao ở tất cả các mẫu, tỷ lệ đọc thành công là 100%. Các trình tự này sau đó được chỉnh sửa và ghép nối bằng tay và phần mềm Bioedit version 7.2.5. Kết quả trình tự nucleotide phân tích thuộc 3 vùng ADN là 565bp, 567bp và 767bp cho psbA-trnH, trnL và ITS1 (bảng 3.1). Tiếp theo, trình tự nucleotide của từng đoạn mã vạch được so sánh trực tiếp với cùng loại mã vạch ADN ở cùng loài Dây thìa canh (Gymnema sylvestre) hoặc cùng chi Gymnema
trên Cơ sở dữ liệu mã vạch ADN (BOLD- Barcode of Life Data Systems), Trung tâm thông tin Công nghệ sinh học Hoa Kỳ (NCBI-National Center for Biotechnology Information) bằng công cụ BLAST (có sẵn tài địa chỉ website: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) và phần mềm ClustalW2 (có sẵn tại địa chỉ website: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/).
3.1.3.1. Kết quả phân tích trình tự nucleotide của đoạn gen psbA-trnH
Với đoạn mã vạch psbA-trnH, hiện chi Gymnema có 03 trình tự trên NCBI: MF064898.1; MF064896.1; MF064897.1; Bằng phần mềm Bioedit, trình tự nucleotide của psbA-trnH từ loài Dây thìa canh được so sánh với cùng loại mã vạch psbA-trnH mã số MF064898.1 từ 01 loài thuộc chi
Gymnema. Điểm bắt đầu so sánh ở vị trí nucleotide thứ 1, kết quả chỉ ra 01 nucleotide sai khác (bảng 3.1, hình 3.5), trong đó 01 vị trí (nucleotide thứ 319 thay A bằng T).
Hình 3.5. Vị trí nucleotide sai khác so sánh trên vùng psbA-trnH
3.1.3.2. Kết quả phân tích trình tự nucleotide của đoạn gen trnL
Với đoạn mã vạch trnL, có 06 trình tự trên NCBI: HE805512.1, HG530575.1, AJ402142.2, KE953920.1, AJ402137.1, AJ431750.1. So sánh trình tự nucleotide của trnL của Dây thìa canh được so sánh với mã vạch trnL
mã số KE953920.1 của một loài thuộc chi Gymnema, kết quả chỉ ra 01 nucleotide sai khác (bảng 3.1, hình 3.6), trong đó 01 vị trí (nucleotide thứ 201 thay T bằng A).
Hình 3.6. Vị trí nucleotide sai khác so sánh trên vùng trnL
3.1.3.3. Kết quả phân tích trình tự nucleotide của đoạn gen ITS1
Cũng như thế, với đoạn mã vạch ITS1, có 07 trình tự trên NCBI: MF409652.1, MG730191.1, MG730189.1, MG730190.1, MG818139.1, MF063778.1, MF063777.1. So sánh trình tự nucleotide của ITS1 của Dây thìa canh được so sánh với mã vạch ITS1 mã số MG730191.1 của một loài thuộc chi Gymnema, kết quả chỉ ra 01 nucleotide sai khác (bảng 3.1, hình 3.7), trong đó 01 vị trí (nucleotide thứ 376 thay C bằng G).
Hình 3.7. Vị trí nucleotide sai khác so sánh trên vùng ITS1
Như vậy, với ba vùng ADN được lựa chọn, psbA-trnH, trnL và ITS1 đại diện cho sự tiến hóa dẫn đến sai khác nucleotide đủ để đảm bảo cho sự phân định loài. Kết quả phân tích từ ba vùng trên đều cho sự khác biệt nucleotide giữa hai hệ gen nghiên cứu là không nhiều nên có thể sử dụng 3 trình tự thuộc ba vùng gen trên làm cơ sở cho giám định loài.
3.2. Kết quả nhân giống Dây thìa canh bằng phƣơng pháp nuôi cấy in vitro 3.2.1. ết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% tỷ lệ tạo mẫu sạch và tái sinh chồi
Nghiên cứu quy trình nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro.Việc tạo được mẫu sạch có khả năng tái sinh chồi tốt là một trong những chỉ tiêu có ý nghĩa then chốt đến việc thành bại của kỹ thuật này.Trong quá trình khử trùng sử dụng cồn 70% để sát khuẩn bề mặt mẫu cấy trong thời gian ngắn nhất (1-2 phút), sau đó dùng dung dịch HgCl2 0,1% để khử trùng mẫu cấy trong khoảng thời gian nhất định sẽ đạt hiệu quả mẫu sạch in vitro. Dung dịch khử trùng trên có độc tính mạnh đối với tế bào sống, do vậy trong quá trình khử trùng tạo mẫu sạch in vitro nếu kéo dài thời gian khử trùng thì sẽ thu được tỷ lệ mẫu sạch cao nhưng hầu hết mẫu sẽ chết hoặc giảm khả năng tái sinh chồi nên ít có ý nghĩa. Ngược lại, nếu khử trùng khử trùng trong thời gian ngắn sẽ cho tỉ lệ mẫu sạch thấp, do thời gian chưa đủ để tiêu diệt hết các vi sinh vật. Vì vậy, cần nghiên cứu để tìm ra công thức khử trùng tối ưu để nâng cao hiệu quả của việc tạo mẫu sạch in vitro và khả năng tái sinh chồi của mẫu sạch.
Trong nghiên cứu này tôi đã sử dụng mẫu vật là phần đoạn thân của Dây thìa canh để tạo mẫu sạch in vitro. Sau thời gian nghiên cứu 4 tuần, thu được kết quả được trình bày trong bảng 3.
Bảng 3.2. Kết quả ảnh hƣởng thời gian khử trùng ến tỷ lệ mẫu sạch và tái sinh chồi
CTTN Loại hóa chất Thời gian khử trùng (phút) Tỉ lệ mẫu sạch (%) Tỉ lệ tái sinh (%) CT1 HgCl2 0,1% 5 58,89a 51,44ac CT2 7 72,15bc 68,25ba CT3 9 84,44cb 48,89ca
Ghi chú: Chữ cái khác nhau trong các bảng số liệu thể hiện sự sai khác c ý nghĩa thống kê α = 0,05 trong phép phân tích SPSS
Biểu ồ 3.1. Ảnh hƣởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% ến tỷ lệ tạo mẫu sạch và tái sinh chồi
Qua kết quả ở bảng 3.2 và biểu đồ 3.1 cho thấy khi sử dụng cùng một loại hóa chất nhưng với thời gian khử trùng khác nhau cũng cho hiệu quả khác nhau với các chỉ tiêu: Mẫu sạch và mẫu tái sinh .
Hình 3.8. Mẫu sạch tái sinh chồi tại môi trƣờng dinh dƣỡng MS
Mẫu cành bánh tẻ Dây thìa canh sau khi rửa sạch được khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% với 3 công thức thí nghiệm, khác nhau về thời gian.
Sau 4 tuần nuôi cấy, kết quả cho thấy (bảng 3.2), tỷ lệ mẫu sạch cao nhất đạt 84,44%, thời gian khử trùng tăng thì tỷ lệ mẫu sạch được tăng lên (58,89 đối với 5 phút và 84,44% đối với 9 phút). Tuy nhiên, tỷ lệ mẫu tái sinh cao nhất lại từ mẫu xử lý theo CT2 đạt đến 68,25%. Nguyên nhân có thể do thời gian khử trùng dài (9 phút) thì tỷ lệ mẫu sạch cao nhưng gây độc, làm giảm tỷ lệ tái sinh chồi xuống 48,89%. Điều này tương đối phù hợp, bởi dung dịch HgCl2 là một loại hóa chất có tính độc đối với tế bào và mô, nếu thời gian khử trùng lâu, hóa chất sẽ ngấm vào mô và có thể làm chết tế bào thực vật (Nguyễn Văn Việt và CS, 2016).
Như vậy, công thức khử trùng tốt nhất đối với mẫu cành Dây thìa canh là công thức CT2 với thời gian khử trùng 7 phút, cho tỷ lệ mẫu sạch là 72,15%, tỷ lệ mẫu sạch tái sinh 68,25%. Kết quả phân tích thống kê cho thấy, công thức khử trùng khác nhau có ảnh hưởng rõ rệt đến tỷ lệ mẫu sạch và khả năng tái sinh chồi.
3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng nhân nhanh chồi nhân nhanh chồi
Môi trường dinh dưỡng là nhân tố quan trọng ảnh hưởng rất nhiều đến hiệu quả nhân giống. Trong thí nghiệm nhân giống Dây thìa canh đã dùng một số loại môi trường MS, 1/2MS, WPM các loại bổ sung 0,5 mg/l BAP; 6 g/l agrar; 30g/l sucrose để nuôi cấy thăm dò nhằm xác định môi tốt nhất cho tái sinh chồi. Số liệu thu thập sau 5 tuần nuôi cấy .
Bảng 3.3. Kết quả ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng ến khả năng nhân nhanh chồi
CTTN Môi trƣờng dinh dƣỡng Tỉ lệ tạo cụm chồi (%) số chồi TB/mẫu MT1 1/2MS 57,79a 0,67c MT2 MS 74,62b 1,84b MT3 WPM 82,27c 1,52a
Ghi chú: chữ cái khác nhau trong các bảng số liệu thể hiện sự sai khác c ý nghĩa thống kê α = 0,05 trong phép phân tích SPSS
Biểu đồ 3.2 a. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến tỷ lệ tạo cụm chồi
Biểu đồ 3.2 b. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến nhân nhanh chồi
Sau thời gian 6 tuần, phản ứng của chồi nuôi cấy trên 3 loại môi trường có sự khác nhau rõ rệt về tỷ lệ tạo cụm chồi và số chồi hình thành trên một mẫu (bảng 3.3 và biểu đồ 3.2a,b). Tỷ lệ tạo mẫu tạo cụm chồi cao nhất là 82,27% trên môi trường WPM. Tuy nhiên số chồi/mẫu cao nhất lại của mẫu được nuôi cấy trên môi trường MS. Kết quả của sự khác biệt này do giữa 3 loại môi trường có hàm lượng cacbon, khoáng đa lượng, vi lượng và vitamin khác nhau. Thành phần các chất dinh dưỡng sẽ ảnh hưởng trực tiếp tới các quá trình sinh lý, sinh hóa của thực vật từ đó cụm chồi sẽ phát triển khác biệt.
0 20 40 60 80 100 MT1 MT2 MT3 57,79 74,62 82,27 % Tỉ lệ tạo cụm chồi %) Tỉ lệ tạo cụm chồi (%) 0 0,5 1 1,5 2 MT1 MT2 MT3 0,67 1,84 1,52 Số chồi TB/mẫu số chồi TB/mẫu download by : skknchat@gmail.com
Trong thí nghiệm này, môi trường MS là thích hợp nhất cho tái sinh chồi, chồi mập, khỏe tròn đều có màu xanh thẫm, tỷ lệ mẫu tái sinh chồi đạt 74,62% và số chồi trung bình/mẫu đạt 1,84 chồi.
3.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP đến nhân nhanh chồi
Chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng trong giai đoạn này là các chất thuộc nhóm cytokinin để kích thích sự phân chia tế bào nhanh chóng. Các loại cytokinin hay được dùng trong nuôi cấy mô tế bào là BAP, Kinetin,TDZ …
Khi đã tạo được mẫu sạch in vitro từ môi trường dinh dưỡng tốt nhất là môi trường MS, tôi tiến hành nhân nhanh chồi với môi trường MS ở trên có bổ sung hàm lượng BAP với nồng độ khác nhau.
Tiến hành cắt chồi đạt chiều cao từ 2 – 2,5 cm, chứa 2 - 3 mắt ngủ, nuôi cấy trên môi trường nhân nhanh thích hợp là MS có bổ sung 0,5 – 2 mg/l BAP; 100 ml/l nước dừa; 100 g/l khoai tây; 30 g/l sucrose; 6,5 g/l agar. Kết quả nhân nhanh chồi Dây thìa canh sau 6 tuần nuôi cấy được thể hiện trong bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả ảnh hƣởng của nồng ộ BAP ến nhân nhanh chồi CTTN BAP (mg/l) Tỉ lệ tạo cụm chồi (%) Số chồi TB/mẫu Chiều cao chồi TB/mẫu Chất lƣợng chồi ĐC 0,0 29,68a 0,48e 0,83 e + CT1 0,5 50,57b 1,86da 1,63 ad + CT2 1 63,43ce 1,98c 2,70 c ++ CT3 1,5 80,63d 2,89b 3,37b +++ CT4 2 62,70ce 1,18ad 2,03 ad ++
Ghi chú: Chữ cái khác nhau trong các bảng số liệu thể hiện sự sai khác c ý nghĩa thống kê α = 0,05 trong phép phân tích SPSS; +) Chồi thấp, mảnh, hơi vàng; ++) Chồi cao, mảnh, xanh; +++) Chồi cao, mập, xanh
Biểu ồ 3.3 a. Ảnh hƣởng của nồng ộ BAP ến tỷ lệ tạo cụm chồi
Biểu ồ 3.3 b. Ảnh hƣởng của nồng ộ BAP ến nhân nhanh chồi
Dây thìa canh nhân nhanh ở môi trường CT1 Dây thìa canh nhân nhanh ở môi trường CT3
Hình 3.9. Một số hình ảnh Dây thìa canh trong thí nghiệm 3
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 ĐC CT1 CT2 CT3 CT4 29,68 50,57 63,43 80,63 62,7 % Tỉ lệ tạo cụm chồi %) Tỉ lệ tạo cụm chồi (%) 0 1 2 3 4 ĐC CT1 CT2 CT3 CT4 0,48 1,86 1,98 2,89 1,18 0,83 1,63 2,7 3,37 2,03 Số chồi TB/mẫu
Chiều cao chồi TB/mẫu
Kết quả ở bảng 3.3 và biểu đồ 3.3 a,b cho thấy khi bổ sung BAP vào môi trường, tỷ lệ tạo chồi ở các công thức thí nghiệm đều đạt trên 50% (CT1 - CT4). Tuy nhiên, có sự khác nhau rõ rệt giữa các công thức thí nghiệm, điều đó nói lên các chỉ tiêu theo dõi phụ thuộc vào nồng độ BAP đã sử dụng. Trong đó công thức môi trường đối chứng N0 (không bổ sung BAP) cho kết quả thấp nhất với tỷ lệ mẫu tái sinh chồi là 29,68%, số chồi trung bình trên mẫu đạt 0,48, chồi thấp, mảnh, lá có màu vàng xanh. Khi nồng độ BAP tăng từ 0,5 đến 2 mg/l thì tỷ lệ mẫu tái sinh chồi tăng từ 50,57 đến 80,63%, số chồi trung bình trên mẫu tăng từ 1,86 lên 2,89 chồi mẫu. Công thức CT3 bổ sung 1,5 mg/l BAP cho kết quả tốt nhất tỷ lệ mẫu tái sinh chồi cao nhất 80,63%, số chồi trung bình trên mẫu 2,89 chồi, chiều cao chồi đạt 3,37 cm, chồi cao, mập và lá có màu xanh đậm. Vì thế, công thức CT3 là công thức tốt nhất để nhân nhanh chồi Dây thìa canh. Kết quả phân tích số liệu cũng cho thấy nồng độ BAP khác nhau ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng nhân nhanh chồi.
Với công thức đối chứng vẫn có thể tái sinh chồi nhưng tỷ lệ thấp là do hoocmon nội sinh có nồng độ không đủ lớn nên khả năng đủ lớn nên khả năng tái sinh chồi, số lượng chồi, chiều cao trung bình thấp.
Từ kết quả trên, tôi thấy rằng sự cần thiết phải bổ sung BAP vào môi trường nuôi cấy với các nồng độ khác nhau tùy vào đối tượng, ở thí nghiệm với Dây thìa canh tôi chọn được môi trường CT3 (môi trường khoáng cơ bản MS bổ sung 1,5 mg/l BAP, 100 ml/l nước dừa, 100 g/l khoai tây, 30 g/l sucrose, 6,5 g/l agar) là môi trường nuôi cấy tốt nhất để nuôi cấy nhân nhanh chồi cây Dây thìa canh.
3.2.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP, Kinetin và NAA đến nhân nhanh chồi. chồi.
Nhằm xác định các loại chất điều hòa sinh trưởng có nồng độ phù hợp cho nhân nhanh chồi Dây thìa canh. Trong các môi trường nuôi cấy ngoài bổ sung BAP tôi còn nghiên cứu sự ảnh hưởng của tổ hợp BAP, Kinetin và NAA.
Trên cơ sở chọn được môi trường tốt nhất ở mục 3.2.3 là công thức CT3 (bổ sung 1,5 mg/l BAP), tiếp tục tiến hành thí nghiệm với việc bổ sung dải
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 ĐC NT1 NT2 NT3 NT4 31.45 75.9 87.55 96.66 82.35 0 30.38 40.83 68.17 64.17 Tỉ lệ tạo cụm chồi (%) Tỉ lệ chồi hữu hiệu (%)
nồng độ (0,1 – 0,7 mg/l) Kinetin và 0,1 mg/l NAA. Việc bổ sung phối hợp Kinetin, BAP và NAA đã cho hệ số nhân chồi tăng lên rõ rệt. Các chất này được sử dụng để kích thích sự phân hóa, sinh trưởng và phát triển chồi của mẫu cấy in vitro, có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào, đặc biệt ảnh hưởng đếnsự hình thành và phân hóa chồi.
Sau 6 tuần nuôi cấy, kết quả (Bảng 3.5) cho thấy khi bổ sung đồng thời BAP, Kinetin và NAA vào môi trường nuôi cấy, hệ số nhân chồi và chất lượng chồi thu được cao hơn hẳn so với chỉ bổ sung BAP (Bảng 3.4).
Bảng 3.5. Kết quả ảnh hƣởng của nồng ộ BAP, Kinetin và NAA ến nhân nhanh chồi
CTTN Chất ĐHST mg/l) Tỉ lệ tạo cụm chồi (%) Số chồi TB/mẫu Chiều cao TB/chồi Tỉ lệ chồi hữu hiệu (%) Chất lƣợng chồi
BAP Kinetin NAA
ĐC 1,5 0 0 31,45a 0,66e 1,63b 00a + NT1 0,1 0,1 75,90b 1,76da 2,7ca 30,38b ++ NT2 0,3 0,1 87,55c 2,67c 3,57d 40,83c ++ NT3 0,5 0,1 96,66d 3,45b 4,23e 68,17de +++ NT4 0,7 0,1 82,35e 2,08ad 2,93ac 64,17ed ++
Ghi chú: Chữ cái khác nhau trong các bảng số liệu thể hiện sự sai khác c ý nghĩa thống kê α = 0,05 trong phép phân tích SPSS; +) Chồi thấp, mảnh, hơi vàng; ++) Chồi cao, mảnh, xanh; +++) Chồi cao, mập, xanh
Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ BAP, Kinetin và NAA đến nhân nhanh chồi
Nhân nhanh ở MT NT4 Nhân nhanh ở MT NT3
Nhân nhanh ở MT NT2 Nhân nhanh ở MT NT1
ình 3.1 . ột hình ảnh â thìa canh trong giai đoạn nhanh nhanh chồi
Kết quả thu được qua bảng 3.5 và biểu đồ 3.4 cho thấy, các công thức môi trường có sự phối hợp ba chất điều hòa sinh trưởng cho kết quả cao hơn hẳn. Môi trường bổ sung 1,5 mg/l BAP, 0,1 mg/l Kinetin và 0,1 mg/l NAA cho kết quả thấp nhất với tỷ lệ mẫu tái sinh chồi chỉ đạt 75,90%, số chồi trung bình trên mẫu là 1,76 chồi và chiều cao chồi 2,7 cm. Khi tăng nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thì kết quả nhân chồi tăng lên, ở công thức NT3 với môi trường khoáng cơ bản MS bổ sung 1,5 mg/l BAP, 0,5 mg/l Kinetin và 0,1 mg/l NAA cho kết quả cao nhất về tỷ lệ tái sinh chồi, số chồi trung bình/mẫu