MC LC
2.4.5. Phương pháp xử lý số liệu
Các thí nghiệm được thiết kế theo phương pháp Sinh học thực nghiệm với số mẫu ≥ 30, lặp lại 3 lần. Số liệu được phân tích theo phương pháp thống kê sinh học ứng dụng các phần mềm đã lập trình trên máy tính điện tử như Excel và SPSS (Nguyễn Hải Tuất và CS, 2005).
2.5. Địa iểm và thời gian bố trí thí nghiệm
Các thí nghiệm được tiến hành tại Viện công nghệ sinh học Lâm nghiệp; Thời gian tiến hành thí nghiệm: 6/2017 – 10/2018.
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch cây Dây thìa canh
3.1.1. ết quả tách chiết ADN t ng số
Tách chiết ADN là một bước khởi đầu rất quan trọng, nó quyết định sự thành công cho phản ứng PCR về sau. Để tách chiết ADN đạt hiệu suất và độ tinh sạch cao thì cần lựa chọn một phương pháp tách chiết phù hợp với đối tượng nghiên cứu.
Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ các mẫu lá được tách theo phương pháp tách chiết ADN của Shagai maroof có cải tiến cho phù hợp với tách chiết ADN của Dây thìa canh.
Sau khi tiến hành tách chiết, ADN tổng số được điện di trên gel Agarose 1% để kiểm tra và thu được kết quả như hình 3.1
Hình 3.1. Kết quả iện di ADN tổng số của 5 mẫu Dây thìa canh
Kết quả điện di cho thấy các băng vạch ADN sáng nét, không có băng phụ, chứng tỏ ADN tổng số tách chiết được từ mẫu lá Dây thìa canh tương đối tốt. Băng có độ sáng tương tự nhau, chứng tỏ hàm lượng ADN tổng số tách chiết được từ các mẫu tương đối đồng đều. Các mẫu ADN tổng số sau khi tách chiết được đo kiểm tra hàm lượng và độ sạch bằng phương pháp quang phổ kế (đo trên máy Nanodorf 200), kết quả cho thấy tỷ lệ OD260/280 nm của 5 mẫu ADN tách chiết đều nằm trong khoảng 1,8 – 2,0; điều này chứng tỏ các mẫu ADN đảm bảo độ tinh sạch để thực hiện phản ứng PCR với mồi đặc hiệu. Hàm lượng ADN ở từng mẫu được pha loãng về nồng độ 50 ng/µl để thực hiện PCR
3.1.2. ết quả PCR các đoạn mã vạch ADN
Từ 5 mẫu ADN tổng số đã tách được, sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho từng đoạn để tiến hành PCR nhân bản các đoạn ADN. Mẫu ADN tổng số được pha loãng 10 lần (điều chỉnh nồng độ ADN đạt 40 ng/µl). Sau khi điều chỉnh nồng độ ADN phù hợp, tiến hành nhân bản 3 đoạn gen trnH- PsbA,
trnL vàITS1 từ ADN tổng số của 5 mẫu Dây thìa canh bằng phản ứng PCR
với các cặp mồi tương ứng lần lượt là: trnH- PsbAP10F và trnH-
PsbAP10R; trnLP11F và trnLP11R; ITS1P12F và ITS1P12R. Thực hiện phản ứng PCR lặp lại 3 lần trên mỗi mẫu thí nghiệm. Sản phẩm PCR của tất cả các mẫu thí nghiệm được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,2%. Kết quả điện di sản phẩm PCR từ 5 mẫu Dây thìa canh được thể hiện trên hình 3.2, 3.3 và 3.4.
Hình 3.2. Kết quả nhân oạn genpsbA-trnH từ các mẫu Dây thìa canh thu ƣợc dùng mồi P10
Ghi chú: M: marker 1000bp; giếng từ 1-5: mẫu 1-5
Đoạn psbA-trnH có kích thước trung bình khoảng 450bp theo lý thuyết, nhưng trên thực tế có thể thay đổi từ 296 – 1120 bp tùy thuộc loài. psbA-trnH có khả năng xác định loài cao. Trong thí nghiệm này, ADN tách chiết được làm khuôn để nhân bản đoạn gen psbA-trnH bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu với trình tự mồi được nêu ở bảng 2.1. Kết quả PCR cho thấy đoạn băng sáng rõ và đồng đều, không xuất hiện băng phụ. Kích thước khoảng 500bp, đủ điều kiện để tiến hành xác định trình tự nucleotide.
500bp
Hình 3.3. Kết quả nhân oạn gentrnL từ các mẫu Dây thìa canh thu ƣợc dùng mồi p11
Ghi chú: M: marker 1000bp; giếng từ 1-5: mẫu 1-5
Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy, đoạn gen trnL khuếch đại thành công ở tất cả các mẫu. Ở các mẫu đều thu được một băng ADN sáng rõ nét, không có băng ADN phụ xuất hiện, kích thước khoảng 500 – 550bp phù hợp với kích thước lý thuyết của đoạn gen trnL dự kiến nhân bản. Kết quả này một lần nữa khẳng định chất lượng và kích thước đủ lớn cũng như không lẫn các tạp chất (polysacarit, phenol) gây ảnh hưởng đến nhân dòng PCR, điều đó cho thấy sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen trnL rất đặc hiệu, có thể sử dụng trực tiếp sản phẩm này để xác định trình tự nucleotide.
750bp
Hình 3.4. Kết quả nhân oạn gen ITS1 từ các mẫu Dây thìa canh dùng mồi p12
Ghi chú: M: marker 1000bp; giếng từ 1-5: mẫu 1-5
Qua hình 3.4 cho thấy kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy, đoạn gen ITS1 khuếch đại thành công ở tất cả các mẫu. Ở các mẫu đều thu được một băng ADN sáng rõ nét, không có băng ADN phụ xuất hiện, kích thước khoảng 700 – 750bp phù hợp với kích thước lý thuyết của đoạn gen ITS1 dự kiến nhân
bản. Kết quả này một lần nữa khẳng định chất lượng và kích thước đủ lớn cũng như không lẫn các tạp chất (polysacarit, phenol) gây ảnh hưởng đến nhân dòng PCR, điều đó cho thấy sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen ITS1 rất đặc hiệu, có thể sử dụng trực tiếp sản phẩm này để xác định trình tự nucleotide.
Bảng 3.1. Đánh giá ba vùng ADN ề xuất
Chỉ tiêu phân tích psbA-
trnH trnL ITS1 Các mã số trình tự nucleotide trên GenBan ƣợc lựa chọn ể so sánh Tỷ lệ PCR thành công (%) 100 100 100 MF064898.1; KF953920.1; MG730191.1 Tỷ lệ đọc trình tự thành công (%) 100 100 100 Chiều dài trình tự (bp) 565 567 767 Vị trí sai khác 319 201 376 Số nucleotide sai khác 1 1 1
Sự phân biệt mức độ loài (%) 0,18 0,18 0,13
Thành công của khuyếch đại PCR cùng xác định được trình tự là một tiêu chí quan trong để đánh giá tính hữu ích của mã vạch ADN. Trong nghiên cứu này, ba đoạn mã vạch đề xuất trnH- PsbA, trnL vàITS1 được khuyếch đại bằng việc sử dụng các cặp mồi phổ quát cùng các thành phần và quy trình PCR được tối ưu hóa cho từng đoạn mã vạch. Tất cả các đoạn mã vạch ADN thuộc vùng ADN lục lạp đều được khuyếch đại thành công ở tất cả 05 mẫu nghiên cứu (hình 3.2, 3.3 và 3.4). Tỷ lệ thành công cho khuyếch đại PCR cho ba đoạn mã vạch là 100%. Tỷ lệ thành công trình tự hai chiều đạt được từ sản phẩm PCR là 100% cho ba đoạn mã vạch ADN. Kết quả này một lần nữa khẳng định chất lượng của ADN được tách chiết, hàm lượng và kích thước đủ lớn cũng như không lẫn các tạp chất (polysaccharide, phenol) gây ảnh hưởng đến nhân dòng PCR. Hơn nữa, sản phẩm PCR đặc hiệu của cả ba đoạn mã vạch ở tất cả các mẫu nghiên cứu chứng tỏ sự hiệu quả trong tối ưu hóa thiết kế mồi và quy trình PCR.
3.1.3. Phân tích trình tự các đoạn mã vạch ADN với các đoạn mồi khác nhau
Với cách lựa chọn ba mẫu Dây thìa canh cùng ba lần lặp lại ở mỗi mẫu, tổng cộng thu được 15 trình tự nucleotide cho một đoạn mã vạch ADN đề xuất. Chất lượng trình tự nucleotide là cao ở tất cả các mẫu, tỷ lệ đọc thành công là 100%. Các trình tự này sau đó được chỉnh sửa và ghép nối bằng tay và phần mềm Bioedit version 7.2.5. Kết quả trình tự nucleotide phân tích thuộc 3 vùng ADN là 565bp, 567bp và 767bp cho psbA-trnH, trnL và ITS1 (bảng 3.1). Tiếp theo, trình tự nucleotide của từng đoạn mã vạch được so sánh trực tiếp với cùng loại mã vạch ADN ở cùng loài Dây thìa canh (Gymnema sylvestre) hoặc cùng chi Gymnema
trên Cơ sở dữ liệu mã vạch ADN (BOLD- Barcode of Life Data Systems), Trung tâm thông tin Công nghệ sinh học Hoa Kỳ (NCBI-National Center for Biotechnology Information) bằng công cụ BLAST (có sẵn tài địa chỉ website: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) và phần mềm ClustalW2 (có sẵn tại địa chỉ website: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/).
3.1.3.1. Kết quả phân tích trình tự nucleotide của đoạn gen psbA-trnH
Với đoạn mã vạch psbA-trnH, hiện chi Gymnema có 03 trình tự trên NCBI: MF064898.1; MF064896.1; MF064897.1; Bằng phần mềm Bioedit, trình tự nucleotide của psbA-trnH từ loài Dây thìa canh được so sánh với cùng loại mã vạch psbA-trnH mã số MF064898.1 từ 01 loài thuộc chi
Gymnema. Điểm bắt đầu so sánh ở vị trí nucleotide thứ 1, kết quả chỉ ra 01 nucleotide sai khác (bảng 3.1, hình 3.5), trong đó 01 vị trí (nucleotide thứ 319 thay A bằng T).
Hình 3.5. Vị trí nucleotide sai khác so sánh trên vùng psbA-trnH
3.1.3.2. Kết quả phân tích trình tự nucleotide của đoạn gen trnL
Với đoạn mã vạch trnL, có 06 trình tự trên NCBI: HE805512.1, HG530575.1, AJ402142.2, KE953920.1, AJ402137.1, AJ431750.1. So sánh trình tự nucleotide của trnL của Dây thìa canh được so sánh với mã vạch trnL
mã số KE953920.1 của một loài thuộc chi Gymnema, kết quả chỉ ra 01 nucleotide sai khác (bảng 3.1, hình 3.6), trong đó 01 vị trí (nucleotide thứ 201 thay T bằng A).
Hình 3.6. Vị trí nucleotide sai khác so sánh trên vùng trnL
3.1.3.3. Kết quả phân tích trình tự nucleotide của đoạn gen ITS1
Cũng như thế, với đoạn mã vạch ITS1, có 07 trình tự trên NCBI: MF409652.1, MG730191.1, MG730189.1, MG730190.1, MG818139.1, MF063778.1, MF063777.1. So sánh trình tự nucleotide của ITS1 của Dây thìa canh được so sánh với mã vạch ITS1 mã số MG730191.1 của một loài thuộc chi Gymnema, kết quả chỉ ra 01 nucleotide sai khác (bảng 3.1, hình 3.7), trong đó 01 vị trí (nucleotide thứ 376 thay C bằng G).
Hình 3.7. Vị trí nucleotide sai khác so sánh trên vùng ITS1
Như vậy, với ba vùng ADN được lựa chọn, psbA-trnH, trnL và ITS1 đại diện cho sự tiến hóa dẫn đến sai khác nucleotide đủ để đảm bảo cho sự phân định loài. Kết quả phân tích từ ba vùng trên đều cho sự khác biệt nucleotide giữa hai hệ gen nghiên cứu là không nhiều nên có thể sử dụng 3 trình tự thuộc ba vùng gen trên làm cơ sở cho giám định loài.
3.2. Kết quả nhân giống Dây thìa canh bằng phƣơng pháp nuôi cấy in vitro 3.2.1. ết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% tỷ lệ tạo mẫu sạch và tái sinh chồi
Nghiên cứu quy trình nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro.Việc tạo được mẫu sạch có khả năng tái sinh chồi tốt là một trong những chỉ tiêu có ý nghĩa then chốt đến việc thành bại của kỹ thuật này.Trong quá trình khử trùng sử dụng cồn 70% để sát khuẩn bề mặt mẫu cấy trong thời gian ngắn nhất (1-2 phút), sau đó dùng dung dịch HgCl2 0,1% để khử trùng mẫu cấy trong khoảng thời gian nhất định sẽ đạt hiệu quả mẫu sạch in vitro. Dung dịch khử trùng trên có độc tính mạnh đối với tế bào sống, do vậy trong quá trình khử trùng tạo mẫu sạch in vitro nếu kéo dài thời gian khử trùng thì sẽ thu được tỷ lệ mẫu sạch cao nhưng hầu hết mẫu sẽ chết hoặc giảm khả năng tái sinh chồi nên ít có ý nghĩa. Ngược lại, nếu khử trùng khử trùng trong thời gian ngắn sẽ cho tỉ lệ mẫu sạch thấp, do thời gian chưa đủ để tiêu diệt hết các vi sinh vật. Vì vậy, cần nghiên cứu để tìm ra công thức khử trùng tối ưu để nâng cao hiệu quả của việc tạo mẫu sạch in vitro và khả năng tái sinh chồi của mẫu sạch.
Trong nghiên cứu này tôi đã sử dụng mẫu vật là phần đoạn thân của Dây thìa canh để tạo mẫu sạch in vitro. Sau thời gian nghiên cứu 4 tuần, thu được kết quả được trình bày trong bảng 3.
Bảng 3.2. Kết quả ảnh hƣởng thời gian khử trùng ến tỷ lệ mẫu sạch và tái sinh chồi
CTTN Loại hóa chất Thời gian khử trùng (phút) Tỉ lệ mẫu sạch (%) Tỉ lệ tái sinh (%) CT1 HgCl2 0,1% 5 58,89a 51,44ac CT2 7 72,15bc 68,25ba CT3 9 84,44cb 48,89ca
Ghi chú: Chữ cái khác nhau trong các bảng số liệu thể hiện sự sai khác c ý nghĩa thống kê α = 0,05 trong phép phân tích SPSS
Biểu ồ 3.1. Ảnh hƣởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% ến tỷ lệ tạo mẫu sạch và tái sinh chồi
Qua kết quả ở bảng 3.2 và biểu đồ 3.1 cho thấy khi sử dụng cùng một loại hóa chất nhưng với thời gian khử trùng khác nhau cũng cho hiệu quả khác nhau với các chỉ tiêu: Mẫu sạch và mẫu tái sinh .
Hình 3.8. Mẫu sạch tái sinh chồi tại môi trƣờng dinh dƣỡng MS
Mẫu cành bánh tẻ Dây thìa canh sau khi rửa sạch được khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% với 3 công thức thí nghiệm, khác nhau về thời gian.
Sau 4 tuần nuôi cấy, kết quả cho thấy (bảng 3.2), tỷ lệ mẫu sạch cao nhất đạt 84,44%, thời gian khử trùng tăng thì tỷ lệ mẫu sạch được tăng lên (58,89 đối với 5 phút và 84,44% đối với 9 phút). Tuy nhiên, tỷ lệ mẫu tái sinh cao nhất lại từ mẫu xử lý theo CT2 đạt đến 68,25%. Nguyên nhân có thể do thời gian khử trùng dài (9 phút) thì tỷ lệ mẫu sạch cao nhưng gây độc, làm giảm tỷ lệ tái sinh chồi xuống 48,89%. Điều này tương đối phù hợp, bởi dung dịch HgCl2 là một loại hóa chất có tính độc đối với tế bào và mô, nếu thời gian khử trùng lâu, hóa chất sẽ ngấm vào mô và có thể làm chết tế bào thực vật (Nguyễn Văn Việt và CS, 2016).
Như vậy, công thức khử trùng tốt nhất đối với mẫu cành Dây thìa canh là công thức CT2 với thời gian khử trùng 7 phút, cho tỷ lệ mẫu sạch là 72,15%, tỷ lệ mẫu sạch tái sinh 68,25%. Kết quả phân tích thống kê cho thấy, công thức khử trùng khác nhau có ảnh hưởng rõ rệt đến tỷ lệ mẫu sạch và khả năng tái sinh chồi.
3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng nhân nhanh chồi nhân nhanh chồi
Môi trường dinh dưỡng là nhân tố quan trọng ảnh hưởng rất nhiều đến hiệu quả nhân giống. Trong thí nghiệm nhân giống Dây thìa canh đã dùng một số loại môi trường MS, 1/2MS, WPM các loại bổ sung 0,5 mg/l BAP; 6 g/l agrar; 30g/l sucrose để nuôi cấy thăm dò nhằm xác định môi tốt nhất cho tái sinh chồi. Số liệu thu thập sau 5 tuần nuôi cấy .
Bảng 3.3. Kết quả ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng ến khả năng nhân nhanh chồi
CTTN Môi trƣờng dinh dƣỡng Tỉ lệ tạo cụm chồi (%) số chồi TB/mẫu MT1 1/2MS 57,79a 0,67c MT2 MS 74,62b 1,84b MT3 WPM 82,27c 1,52a
Ghi chú: chữ cái khác nhau trong các bảng số liệu thể hiện sự sai khác c ý nghĩa thống kê α = 0,05 trong phép phân tích SPSS
Biểu đồ 3.2 a. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến tỷ lệ tạo cụm chồi
Biểu đồ 3.2 b. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến nhân nhanh chồi
Sau thời gian 6 tuần, phản ứng của chồi nuôi cấy trên 3 loại môi trường có sự khác nhau rõ rệt về tỷ lệ tạo cụm chồi và số chồi hình thành trên một mẫu (bảng 3.3 và biểu đồ 3.2a,b). Tỷ lệ tạo mẫu tạo cụm chồi cao nhất là 82,27% trên môi trường WPM. Tuy nhiên số chồi/mẫu cao nhất lại của mẫu được nuôi cấy trên môi trường MS. Kết quả của sự khác biệt này do giữa 3 loại môi trường có hàm lượng cacbon, khoáng đa lượng, vi lượng và vitamin khác nhau. Thành phần các chất dinh dưỡng sẽ ảnh hưởng trực tiếp tới các quá trình sinh lý, sinh hóa của thực vật từ đó cụm chồi sẽ phát triển khác biệt.
0 20 40 60 80 100 MT1 MT2 MT3 57,79 74,62 82,27 % Tỉ lệ tạo cụm chồi %) Tỉ lệ tạo cụm chồi (%) 0 0,5 1 1,5 2 MT1 MT2 MT3 0,67 1,84 1,52 Số chồi TB/mẫu số chồi TB/mẫu download by : skknchat@gmail.com
Trong thí nghiệm này, môi trường MS là thích hợp nhất cho tái sinh chồi, chồi mập, khỏe tròn đều có màu xanh thẫm, tỷ lệ mẫu tái sinh chồi đạt 74,62% và số chồi trung bình/mẫu đạt 1,84 chồi.
3.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP đến nhân nhanh chồi