2.2.2.1. Phương pháp lấy mẫu
Chè búp (gồm 1 tôm và 2 lá non) được người dân thu hái trong khắp đồi chè và trộn lẫn vào nhau. Lấy mẫu chè búp tươi theo quy chuẩn kỹ thuật Quốc Gia QCVN 01 - 28 : 2010/BNNPTNT [98]. Mẫu đại diện là mẫu chè được người dân thu hái trong cả vườn chè và trộn lẫn vào nhau. Trước khi lấy mẫu phải rải chè búp vừa hái ra và trộn đều trên nền nhà thành một lớp dày không quá 30cm. Với lô chè dưới 1 tấn, lấy mẫu ở 5 vị trí và lô chè trên 1 tấn lấy mẫu ở 9 vị trí.
2.2.2.2. Sơ chế mẫu chè
Lá chè được rửa sạch 3 lần bằng nước máy và rửa lại bằng nước cất, rải ra để ở nhiệt độ phòng cho khô nước. Sau đó, lá chè được sấy trong tủ sấy UNB 400 ở nhiệt độ 90oC đến khối lượng không đổi (khoảng 24 giờ). Lá chè khô được đựng trong túi nilon và bảo quản trong tủ lạnh.
2.2.2.3. Chuẩn bị mẫu chè
Lá chè khô được nghiền nhỏ bằng máy nghiền mẫu IKA A11 basic. Sau đó mẫu chè bột được chuyển vào túi nilon và bảo quản trong tủ lạnh.
2.2.2.4. Chuẩn bị mẫu nước chè
Cân 1,0 gam lá chè khô đã nghiền nhỏ cho vào cốc thủy tinh 100 mL, thêm vào khoảng 90 mL nước cất hai lần sôi, đậy cốc bằng đĩa petri thủy tinh, mẫu được ngâm với các thời gian 5 phút, 15 phút và 30 phút. Chuyển nước chè vào bình định mức 100 mL, lọc mẫu và định mức đến 100 mL. Mẫu nước chè được bảo quản trong tủ lạnh và sử dụng không quá 24 giờ.
2.3. Khảo sát các điều kiện tối ưu phép chiết điểm mù Mn(II), Cr(III) và xây dựng quy trình CPE-AAS phân tích dạng Mn, Cr trong nước chè
2.3.1. Khảo sát các điều kiện tối ưu phép chiết điểm mù Mn(II), Cr(III)
Khảo sát sự ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình chiết điểm mù Mn(II) và Cr(III) nhằm mục đích tối ưu hoá quá trình chiết điểm mù phân tích dạng Mn, Cr
trong nước chè. Tiến hành khảo sát với mẫu chuẩn Mn, Cr trên nguyên tắc thay đổi giá trị của đại lượng khảo sát và cố định giá trị của các đại lượng còn lại.
+ Khảo sát lựa chọn chất tạo phức và nồng độ chất tạo phức tối ưu cho phản ứng tạo phức của Mn(II) và Cr(III). Tiến hành khảo sát với hai chất tạo phức PAN và 8-HQ.
+ Khảo sát sự ảnh hưởng của pH (môi trường tối ưu cho phản ứng tạo phức giữa Mn(II) và Cr(III) với chất tạo phức). Tiến hành khảo sát trong khoảng pH từ 4 đến 12.
+ Khảo sát lựa chọn chất hoạt động bề mặt và nồng độ chất hoạt động bề mặt đối với Triton X-100 và Triton X-114.
+ Nghiên cứu lựa chọn nhiệt độ ủ mẫu tối ưu. + Khảo sát thời gian chiết tối ưu.
+ Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ chất điện ly NaCl đến hiệu suất chiết, Đối với mẫu chiết Mn(II) tiến hành khảo sát trong khoảng nồng độ NaCl 0,1% – 0,6%. Đối với mẫu chiết Cr(III) tiến hành khảo sát trong khoảng nồng độ NaCl 0,05% ÷ 0,30%.
+ Trong nước chè Cr tồn tại chủ yếu ở hai dạng Cr(III) và Cr(VI). Xác định hàm lượng tổng Cr bằng cách khử Cr(VI) thành Cr(III), sau đó xác định hàm lượng tổng Cr(III) bằng phương pháp CPE-GFAAS.
+ Khảo sát sự ảnh hưởng của các cation khác đến quá trình chiết điểm mù Mn(II) và Cr(III). Qua khảo sát mẫu chè bằng phương pháp ICP-MS, ngoài Mn, Cr trong chè chứa một số nguyên tố như: Al, Fe, Cu, Zn, Pb, Ni. Do đó, khảo sát sự ảnh hưởng của các cation: Al3+, Fe3+, Cu2+, Zn2+, Pb2+, Ni2+.
2.3.2. Phân tích hàm lượng tổng Mn, Cr trong lá chè và nước chè
Trong nhiều nghiên cứu các tác giả đã sử dụng hỗn hợp axit HNO3 và HClO4
để vô cơ hoá mẫu [99, 100]. Do đó chúng tôi sử dụng kỹ thuật vô cơ hoá ướt dùng hỗn hợp axit HNO3 đặc và HClO4 đặc để vô cơ hoá xác định hàm lượng tổng Mn, Cr trong mẫu lá chè và mẫu nước chè.
2.3.2.1. Quy trình phân tích hàm lượng tổng Mn, Cr trong lá chè
Cân 0,25 g mẫu chè đã nghiền nhỏ cho vào cốc thủy tinh 100 mL, thêm 5,0 mL dung dịch HNO3 65% và 5,0 ml dung dịch HClO4 70 - 72%, đun nhẹ trên bếp cách cát đến khi mẫu phân hủy hết thu được muối trắng ẩm. Để nguội, hòa tan, lọc
và định mức 25 mL bằng dung dịch HNO3 1%. Phân tích Mn bằng FAAS, phân tích Cr bằng GFAAS. Phân tích khảo các nguyên tố khác bằng phương pháp ICP - MS. Mẫu trắng được tiến hành tương tự, thay 0,25 g chè bằng 0,25 mL nước cất hai lần.
Quy trình phân tích hàm lượng tổng Mn, Cr được mô tả theo sơ đồ sau:
Hình 2.6. Sơ đồ phân tích hàm lượng tổng Mn, Cr trong lá chè
2.3.2.2. Quy trình phân tích hàm lượng tổng Mn, Cr trong nước chè
Lấy 10 mL nước chè cho vào cốc thủy tinh, đun nhẹ trên bếp cách cát đến gần cạn. Thêm tiếp 2,0 mL dung dịch HNO3 65% và 2,0 mL dung dịch HClO4 70 - 72%, đun nhẹ trên bếp cách cát đến khi mẫu phân hủy hết thu được muối trắng ẩm. Hòa tan mẫu bằng 8 mL dung dịch HNO3 1%, lọc mẫu và định mức đến 10 mL bằng dung dịch HNO3 1%. Mẫu trắng được tiến hành tương tự, thay 10 mL nước chè bằng 10 mL nước cất.
2.3.3. Khảo sát các điều kiện tối ưu phân tích dạng Mn trong nước chè sử dụng CPE - FAAS
2.3.3.1. Khảo sát các điều kiện phân tích hàm lượng tổng Mn trong nước chè bằng phương pháp chiết điểm mù
Nghiên cứu tối ưu hoá quy trình chiết điểm mù để phân tích hàm lượng tổng Mn trong nước chè. Quy trình thực nghiệm như sau: Hút 0,5 mL nước chè vào ống
ly tâm thủy tinh 10 mL, thêm 1,0 mL dung dịch chất tạo phức (8-HQ, PAN) Cmol/L và chất hoạt động bề mặt (TX-100, TX-114) C% (v/v), sau đó thêm 2,0 mL dung dịch đệm pH = x và 1,0 mL dung dịch NaCl C%, dung dịch được pha loãng tới 10 mL bằng nước cất. Dung dịch phân tích được ủ ở t1 oC trong bể ổn nhiệt trong thời gian t2 phút. Sau đó, ly tâm thời gian t phút ở tốc độ 3500 vòng/phút, ngâm vào nước đá 10 phút để làm đông đặc pha giàu chất hoạt động bề mặt, tách bỏ pha nước để thu được pha nhớt giàu chất hoạt động bề mặt. Hòa tan pha nhớt bằng 1,0 mL dung dịch HNO3 1%, đồng nhất mẫu bằng máy lắc. Phân tích hàm lượng Mn tổng trong nước chè bằng FAAS. Mẫu trắng được tiến hành tương tự thay 0,5 mL nước chè bằng 0,5 mL nước cất.
2.3.3.2. Khảo sát các điều kiện phân tích dạng Mn(II)- flavonoid trong nước chè bằng phương pháp chiết điểm mù
Trong nước chè Mn tồn tại ở hai dạng chủ yếu là dạng Mn(II)-flavonoid và dạng Mn(II)-tự do và phức yếu. Khi chiết dạng Mn(II)-flavonoid trong nước chè chỉ thêm chất hoạt động bề mặt, không thêm tác nhân tạo phức. Như vậy dạng Mn(II) - flavonoid sẽ bị chiết vào pha hữu cơ, còn dạng Mn(II) - tự do và phức yếu không bị chiết, vẫn tồn tại trong pha nước.
Việc lựa chọn chất hoạt động bề mặt, nồng độ chất hoạt động bề mặt, nhiệt độ ủ, thời gian chiết tối ưu, ảnh hưởng của nồng độ chất điện ly NaCl đến hiệu suất chiết sẽ được tối ưu hoá trong quá trình thực nghiệm.
2.3.4. Khảo sát các điều kiện tối ưu phân tích dạng Cr trong nước chè sử dụng CPE - GFAAS
2.3.4.1. Khảo sát các điều kiện phân tích tổng Cr trong nước chè bằng phương pháp chiết điểm mù
Crom trong lá chè được chiết xuất vào pha nước và tồn tại ở hai dạng Cr(III) và Cr(VI). Dạng Cr(III) tạo phức và bị chiết vào pha chất hoạt động bề mặt, dạng Cr(VI) không tạo phức nên không bị chiết. Do đó, muốn xác định hàm lượng tổng Cr trong nước chè cần phải khử Cr(VI) thành Cr(III). Quy trình thực nghiệm như sau:
Hút 2,0 mL nước chè vào ống ly tâm thuỷ tinh 10 mL, thêm chất khử để khử Cr(VI) thành Cr(III), thêm 1,0 mL dung dịch chất tạo phức (8-HQ, PAN) C mol/L để
tạo phức với Cr(III), thêm 1,0 mL dung dịch đệm pH = x. Tiếp theo, thêm chất hoạt động bề mặt (TX – 100, TX-114) C % và dung dịch NaCl C%. Dung dịch cuối cùng được pha loãng thành 10 mL bằng nước cất và ủ thời gian t phút trong bể ổn nhiệt ở toC. Mẫu được ly tâm t phút ở tốc độ 3500 vòng/phút, làm lạnh bằng cách ngâm vào nước đá 10 phút, tách bỏ pha nước, pha nhớt giàu chất hoạt động bề mặt được hòa tan bằng 1,0 mL dung dịch HNO30,1M trong CH3OH. Phân tích hàm lượng tổng Cr bằng GFAAS. Hàm lượng Cr(VI) trong nước chè được tính bằng hiệu số giữa hàm lượng tổng Cr và hàm lượng Cr(III).
2.3.4.2. Khảo sát các điều kiện phân tích dạng Cr(III) trong nước chè
Quy trình phân tích hàm lượng dạng Cr(III) tương tự quy trình phân tích hàm lượng tổng Cr trong nước chè nhưng không thêm chất khử Cr(VI). Do đó dạng Cr(III) bị chiết vào pha hữu cơ chất hoạt động bề mặt, dạng Cr(VI) không tạo phức với chất tạo phức sử dụng nên vẫn tồn tại trong pha nước.
Việc lựa chọn chất hoạt động bề mặt, nồng độ chất hoạt động bề mặt, nhiệt độ ủ, thời gian chiết tối ưu, ảnh hưởng của nồng độ chất điện ly NaCl đến hiệu suất chiết sẽ được tối ưu hoá trong quá trình thực nghiệm.
2.4. Xây dựng và đánh giá các đường chuẩn phân tích Mn, Cr
2.4.1. Đánh giá giới hạn chấp nhận của các đường chuẩn và tính giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
2.4.1.1. Đánh giá giới hạn chấp nhận của các đường chuẩn
Để đánh giá giới hạn chấp nhận của đường chuẩn cần dựa vào 2 tiêu chí: a. Tiêu chí 1 - Hệ số tương quan R2
Hệ số tương quan phải thỏa mãn tiêu chuẩn 0,99 ≤ R2 ≤ 1 .
b. Tiêu chí 2 - Độ chệch các điểm nồng độ khi xây dựng đường chuẩn
- Áp dụng phương trình đường chuẩn A = a + b.C, tính lại nồng độ Cti dựa vào độ hấp thụ quang Ai theo công thức (2.1)
( ) i ti A a 2. C b 1 − =
Trong đó: Ai : độ hấp thụ quang của dung dịch chuẩn thứ i - Tính độ chệch các điểm nồng độ theo công thức (2.2) [101]:
( ) ti ci i ci C C Δ = .100 C 2.2 −
Trong đó:
∆i : Độ chệch của điểm nồng độ thứ i dùng xây dựng đường chuẩn. Cti : Nồng độ tính ngược theo phương trình đường chuẩn của điểm thứ i. Cci : Nồng độ chuẩn của điểm nồng độ thứ i.
Theo quy định của nhiều tổ chức của Mỹ, Canada, châu Âu, giá trị độ chệch Δ không được vượt quá ± 15% cho tất cả các nồng độ, riêng ở nồng độ LOQ có thể chấp nhận giới hạn ± 20%.
2.4.1.2. Tính giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
Tính độ lệch chuẩn (Standard Deviation: SD) bằng công thức (2.3)
( ) n 2 i i =1 (x - x) SD = n - 1 2.3
Giới hạn phát hiện (Limit of detection : LOD) được tính bằng 3 lần độ lệch chuẩn theo công thức (2.4):
( )
LOD = 3.SD 2.4
Giới hạn định lượng (Limit of quantitation) được tính bằng 10 lần độ lệch chuẩn theo công thức (2.5):
( )
LOQ = 10.SD 2.5
2.4.2. Xây dựng và đánh giá các đường chuẩn phân tích tổng Mn, Cr
2.4.2.1. Xây dựng các đường chuẩn phân tích tổng Mn, Cr
Chuẩn bị dãy gồm 08 dung dịch chuẩn Mn (từ dung dịch chuẩn Mn 1000 mg/L) với các nồng độ: 0,1; 0,25; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 và 5,0 mg/L trong dung dịch HNO3
1%.
Chuẩn bị dãy gồm 08 dung dịch chuẩn Cr (từ dung dịch chuẩn Cr 1000 mg/L) với các nồng độ: 5; 10; 15; 20; 25; 30; 35 và 40 µg/L trong môi trường HNO3 0,5%. Đo độ hấp thụ A của dãy các dung dịch Mn bằng kỹ thuật FAAS và đo độ hấp thụ A của dãy các dung dịch Cr bằng kỹ thuật GFAAS trên máy ZEEnit 700 ở các điều kiện tối ưu.
2.4.2.2. Đánh giá giới hạn chấp nhận của đường chuẩn và tính giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
* Tính các giá trị nồng độ Cti theo công thức (2.1) và độ chệch các điểm nồng độ khi xây dựng đường chuẩn theo công thức (2.2), từ kết quả tính đánh giá đường chuẩn phân tích tổng Mn và đường chuẩn phân tích tổng Cr.
* Để xác định giá trị LOD, LOQ của đường chuẩn phân tích tổng Mn trong lá chè, chuẩn bị song song 14 dung dịch Mn 0,1 mg/L trong HNO3 1%. Đối với phân tích tổng Cr trong lá chè, chuẩn bị song song 14 dung dịch Cr 2,0 µg/L trong môi trường HNO3 0,5%. Phân tích nồng độ Mn, Cr trong 14 mẫu trên sử dụng đường chuẩn phân tích tổng Mn, tổng Cr đã xây dựng. Tính giá độ lệch chuẩn theo công thức (2.3), LOD theo công thức (2.4) và LOQ theo công thức (2.5).
2.4.3. Xây dựng và đánh giá đường chuẩn CPE phân tích dạng Mn, Cr
2.4.3.1. Xây dựng đường chuẩn CPE phân tích dạng Mn, Cr
Chiết điểm mù các dung dịch chuẩn Mn nồng độ lần lượt là: 0,1; 0,5; 1,0; 2,0 mg/L; 3,0; 4,0 và 5,0 mg/L trong điều kiện tối ưu đã khảo sát. Mẫu trắng được tiến hành tương tự như mẫu chuẩn nhưng thay dung dịch chuẩn Mn bằng nước cất.
Đo độ hấp thụ của Mn bằng phương pháp FAAS ở bước sóng 279,5nm. Kết quả xây dựng đường chuẩn CPE phân tích dạng Mn trong nước chè được trình bày trong 3.2.3.
Chiết điểm mù các dung dịch chuẩn Cr với các nồng độ lần lượt là: 6, 12, 18, 24 và 36 µg/L trong điều kiện tối ưu đã khảo sát. Mẫu chuẩn được tiến hành trong điều kiện tương tự nhưng thay dung dịch chuẩn Cr bằng nước cất 2 lần.
Đo độ hấp thụ của Cr bằng phương pháp GFAAS ở bước sóng 357,9nm. Kết quả xây dựng đường chuẩn CPE phân tích dạng Cr trong nước chè được trình bày trong 3.2.4.
2.4.3.2. Đánh giá giới hạn chấp nhận của đường chuẩn và tính giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
* Tính các giá trị nồng độ Cti theo công thức (2.1) và độ chệch các điểm nồng độ khi xây dựng đường chuẩn theo công thức (2.2), từ kết quả tính đánh giá đường chuẩn phân tích dạng Mn, Cr bằng chiết điểm mù.
* Xác định giá trị LOD và LOQ của đường chuẩn CPE phân tích dạng Mn trong nước chè bằng cách CPE song song 14 dung dịch Mn 0,1mg/L. Đo độ hấp thụ của Mn bằng kỹ thuật FAAS. Đối với đường chuẩn CPE phân tích dạng Cr, tiến hành CPE song song 14 dung dịch Cr(III) 2,0 µg/L, phân tích Cr trong mẫu chiết bằng kỹ thuật GFAAS. Tính giá độ lệch chuẩn theo công thức (2.3), LOD theo công thức (2.4) và LOQ theo công thức (2.5).
2.5. Các điều kiện đo Mn, Cr trên máy AAS ZEEnit 700
2.5.1. Điều kiện đo FAAS đối với Mn
Lựa chọn phân tích hàm lượng Mn trong mẫu chè bằng kỹ thuật FAAS vì qua khảo sát mẫu bằng phương pháp ICP-MS hàm lượng Mn trong chè Mn cao. Mặt khác, Mn có nhiệt độ bay hơi không cao nên nhiệt độ ngọn lửa khi đốt hỗn hợp axetilen/không khí phù hợp cho quá trình nguyên tử hóa. Các điều kiện phân tích mẫu đã được khảo sát để tối ưu hóa đối với phép phân tích Mn, tiến hành đối với dung dịch mẫu chuẩn Mn(II) 1,0 mg/L thu được kết quả trình bày trong bảng 2.3.
Bảng 2.3. Các điều kiện tối ưu phép đo FAAS đối với Mn
STT Thông số Đơn vị Giá trị
1 Vạch phổ nm 279,5 2 Độ rộng khe đo nm 0,2 3 Cường độ đèn HCL Mn mA 7,0 4 Cường độ đèn HCL D2 mA 5,0 5 Chiều cao đầu đốt mm 6 6 Tốc độ C2H2/không khí L/giờ 90 7 Tốc độ hút mẫu mL/phút 4,0
2.5.2. Các điều kiện đo GFAAS đối với Cr
Theo kết quả khảo sát sơ bộ mẫu chè bằng phương pháp ICP-MS, hàm lượng Cr cỡ µg/kg do đó chọn kỹ thuật GFAAS có độ nhạy cao để định lượng Cr. Mặt khác, Cr là nguyên tố có nhiệt độ nóng chảy và bay hơi cao nên phân tích bằng kỹ thuật GFAAS đảm bảo yêu cầu nhiệt độ để nguyên tử hóa mẫu phân tích. Khảo sát các điều
kiện đo phổ Cr bằng kỹ thuật GFAAS, tiến hành với dung dịch Cr(III) 20 µg/L theo nguyên tắc thay đổi từng thông số và cố định các thông số còn lại. Các điều kiện tối ưu của phép đo GFAAS đối với Cr được trình bày trong bảng 2.4.