2.4.1. Ng i n c u đặc điểm sin vật ọc o i am t t g ng
*Thu mẫu và mơ tả đặ điểm hình thái: Tiến hành thu mẫu tiêu bản
cây với đầy đủ các bộ phận như thân củ, bộ rễ, lá, hoa, quả ( nếu có) để mơ tả, phân tích.
*C u t o giải phẫu lá Tam th t g ng:
Cấu tạo giải phẫu lá Tam thất gừng ở các giai đoạn phát triển khác nhau thể hiện các các giai đoạn (giai đoạn vườn ươm, cây con đem trồng, cây trồng rừng trong thời kỳ kiến thiết cơ bản, cây trồng rừng trong giai đoạn kinh doanh), được xác định bằng cách lấy 6 mẫu lá/cây từ 3 cây tiêu chuẩn/mỗi giai đoạn sinh trưởng (giai đoạn vườn ươm, cây tái sinh, cây rừng trồng, cây rừng tự nhiên ) ở các cây tiêu chuẩn. Các mẫu lá giải phẫu được chụp ảnh và các thông số được đo đếm trên kính hiển vi OLYMPUS. Các chỉ tiêu nghiên cứu cấu tạo giải phẫu lá Tam thất gừng bao gồm: chiều
dài lá, chiều dày tầng cutin trên, cutin dưới, biểu bì trên, biểu bì dưới, mơ dậu, mơ khuyết,….
*Xá định hàm ượng các sắc t quang hợp (diệp lục):
Mẫu lá được lấy tương tự như mẫu lá để nghiên cứu giải phẫu. Xác định hàm lượng diệp lục a, diệp lục b trong các mẫu lá Tam thất gừng ở các giai đoạn sinh trưởng khác nhau theo phương pháp của Grodzinxki A. M và Grodzinxki D. M (1981), bao gồm các bước sau:
- Tách chiết diệp lục bằng axeton 80% và máy ly tâm. Cụ thể: Mỗi mẫu cân chính xác 0,5g. Nghiền mẫu với 2ml dung dịch axeton 80% (ethanol 96%) trong cối chày sứ. Lọc mẫu thu dịch chiết qua phễu thủy tinh, sau đó rửa nhiều lần bằng axeton 80% (ethanol 96%) cho đến khi dịch chiết chảy ra khơng có màu. Chuyển dịch chiết sang bình định mức 50ml và dùng axeton 80% (ethanol 96%) đưa thể tích dịch chiết lên đúng vạch định mức.
- Xác định mật độ các sắc tố quang hợp tại các bước sóng 649nm, 665nm bằng máy so mầu Spectro 325.
- Định lượng hàm lượng sắc tố (Chlorophyl a [C55H72O5N4Mg] – diệp lục a và Chlorophyl b [C55H70O6N4Mg] – diệp lục b).
*Theo dõi v t h u: Chọn 15 bụi sinh trưởng phát triển bình thường
để theo dõi sự thay đổi của cây theo mùa: quá trình nảy chồi, ra lá, ra hoa...theo thời gian các tháng, mùa trong năm.
2.4.2. Ng i n c u xác địn t n p ần ỗn ợp ruột ầu p ợp
*B trí thí nghiệm
Bố trí 4 cơng thức thí nghiệm, bao gồm: + CT1: 100% đất tầng A + tầng B
+ CT3: 85% đất (tầng A + B) + 10% trấu hun + 5% phân vi sinh + CT4: 50% đất (tầng A + B) + 45% cát sạch + 5% phân lân
Trước khi tiến hành thí nghiệm, giá thể đều được xử lý nấm bằng dung dịch Ben lát C nồng độ 0,1%. Số củ giống phục vụ cho thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức x 3 lặp x 30 củ giống = 360 hom củ giống.
Phân NPK sử dụng là phân NPK (5:10:3).
Phân vi sinh sử dụng là phân vi sinh sông gianh (độ ẩm: 30%; Hữu cơ: 15%; P2O5hh: 1,5%; Acid Humic: 2,5%; Trung lượng: Ca, Mg, S; Các chủng vi sinh vật hữu ích: 3 × 106CFU/g).
Sử dụng lưới che sáng 50% ánh sáng trực xạ để che sáng cho các cơng thức thí nghiệm.
Lặp 1 CT1 CT2 CT3 CT4
Lặp 2 CT2 CT3 CT4 CT1
Lặp 3 CT3 CT2 CT1 CT4
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thành phần hỗn hợp ruột bầu
* h o dõi đo đếm s liệu thí nghiệm
Định kỳ 1 tháng/lần theo dõi các chỉ tiêu: - Tỷ lệ sống.
+ Tỷ lệ cây sống được xác định thống kê tổng số cây sống trên tổng số cây của mỗi lần lặp được cấy trong bầu.
- Tình hình sinh trưởng: Chiều cao, số lá, k ch thước lá, chất lượng sinh trưởng (tốt, trung bình, xấu).
+ Chiều cao của cây được đo đếm bằng thước có khắc vạch đến mm, số lá được đếm bằng cách thơng thường, kích thức lá cũng được đo bằng thước có vạch khắc đến mm.
- Tình hình sâu bệnh hại.
Thường xuyên tưới nước đủ ẩm, làm cỏ, xới đất mặt bầu cho thấm nước. Thời gian theo dõi thí nghiệm là 2 tháng.
2.4.3. Ng i n c u xác địn p ương p áp n ân giống ằng củ p ợp ằng củ, cắt đo n củ
* Bố trí thí nghiệm
Bố trí 4 cơng thức thí nghiệm:
- CT1: Nhân giống bằng củ ngun có nhiều mắt mầm (đối chứng). - CT2: Cắt củ thành các đoạn có 1 mắt mầm.
- CT3: Cắt củ thành các đoạn có 2 mắt mầm. - CT4: Cắt củ thành các đoạn có 3 mắt mầm.
Củ sau khi ủ bắt đầu có u chồi sinh trưởng thì tiến hành cắt các đoạn có số mắt mầm theo từng cơng thức thí nghiệm, sau đó dùng tro bếp hoặc vơi bột chấm vào vị trí mới cắt để hãm nhựa và tránh vi sinh vật gây hại rồi tiếp tục ủ cho tới khi chồi sinh trưởng phát triển tốt thì đem giâm vào bầu dinh dưỡng.
Củ giống được sử dụng để phục vụ cho thí nghiệm có tuổi trên 1 năm tuổi. Củ có hình thái to, đẹp, khơng bị dập hoặc sâu bệnh. Củ giống được vùi trong cát sạch đã được xử lý nấm bằng dung dịch Benlat C nồng độ 0,1%. Thường xuyên tưới nước đủ ẩm.
Thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên đầy đủ, lặp lại 3 lần. Tổng số củ giống (nguyên củ) phục vụ cho thí nghiệm dự kiến là 4 nghiệm thức x 3 lặp x 30 củ giống = 360 củ giống. Các củ được giâm vào trong bầu dinh dưỡng k ch thước 13x18cm. Hỗn hợp ruột bầu gồm 90% đất + 9% phân chuồng hoai + 1% phân NPK.
Phân NPK sử dụng là phân NPK (5:10:3).
Sử dụng lưới che sáng 50% ánh sáng trực xạ để che sáng cho các cơng thức thí nghiệm.
Ta có sơ đồ bố tr phương pháp nhân giống bằng củ như sau:
Lặp 1 CT1 CT2 CT3 CT4
Lặp 2 CT2 CT3 CT4 CT1
Lặp 3 CT4 CT1 CT2 CT3
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm bằng phƣơng pháp nhân giống
* h o dõi đo đếm s liệu thí nghiệm
Định kỳ 1 tháng/lần theo dõi các chỉ tiêu: - Tỷ lệ sống.
+ Tỷ lệ cây sống được xác định thống kê tổng số cây sống trên tổng số cây của mỗi lần lặp được cấy trong bầu.
- Hệ số nhân giống của mỗi cơng thức thí nghiệm được xác định dựa trên tổng số cây sống được tách ra chia cho tổng số lượng củ nguyên được đưa vào tách giống.
- Tình hình sinh trưởng: Chiều cao, số lá, k ch thước lá, chất lượng sinh trưởng (tốt, trung bình, xấu) tương tự như đối với thí nghiệm thành phần ruột bầu.
- Tình hình sâu bệnh hại.
Thường xuyên tưới nước đủ ẩm, làm cỏ, xới đất mặt bầu cho thấm nước. Thời gian theo dõi thí nghiệm là 2 tháng.
Hình 2.3. Hình ảnh đo đếm tại vƣờn ƣơm
2.4.4. Ng i n c u xác địn c ế độ c e sáng p ợp c o cây con trong vườn ươm
* B trí thí nghiệm
Sử dụng máy đo cường độ ánh sáng Lux để tiến hành bố trí 4 cơng thức thí nghiệm:
+ CT1: Che 25±5% ánh sáng trực xạ + CT2: Che 50±5% ánh sáng trực xạ + CT3: Che 75±5% ánh sáng trực xạ + CT4: Khơng che sáng (đối chứng)
Mỗi cơng thức thí nghiệm có 30 hom củ giống cắt đoạn đã nảy mầm. Tổng số hom củ giống cần thiết cho thí nghiệm là 4 nghiệm thức x 3 lặp x 30 củ giống = 360 củ. Các củ được giâm vào trong bầu dinh dưỡng kích thước 13x18cm. Hỗn hợp ruột bầu gồm 90% đất + 9% phân chuồng + 1% phân NPK.
Phân NPK sử dụng là phân NPK (5:10:3).
Sử dụng lưới che sáng theo tỷ lệ để che sáng cho các cơng thức thí nghiệm.
Ta có sơ đồ thí nghiệm bố trí thí nghiệm che sáng cho cây con trong vườn ươm sau đây:
LẶP 1 CT1 CT3 CT4 CT2
LẶP 2 CT4 CT2 CT1 CT3
LẶP 3 CT3 CT4 CT2 CT1
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm che sáng
* h o dõi đo đếm s liệu thí nghiệm
Định kỳ 1 tháng/lần theo dõi đánh giá: - Tỷ lệ sống.
Tỷ lệ cây sống được xác định thống kê tổng số cây sống, trên tổng số cây của mỗi lần lặp được cấy trong bầu.
- Tình hình sinh trưởng cây con: Đo chiều cao cây, số lá trung bình/nhánh, số nhánh, k ch thước lá, đánh giá chất lượng sinh trưởng (tốt, trung bình, xấu) tương tự các thí nghiệm nêu trên.
- Tình hình sâu bệnh hại.
Thời gian theo dõi thí nghiệm là 2 tháng.
2.4.5. P ương p áp nhập, xử lý số liệu và viết báo cáo kết quả thực hiện nội dung thí nghiệm
Tại các thí nghiệm số liệu được nhập vào Excel và được phân tích phương sai 1 nhân tố, tính tốn các trị số trung bình bằng các hàm thống kê thơng dụng dưới sự trợ giúp của máy vi tính và phần mềm SPSS, Excel.
+ T nh toán đặc trưng mẫu: X =
Trong đó: x là giá trị trung bình của đại lượng quan sát.
fixi
n. .
Phương sai: Với Qx = fi.xi - + Sai tiêu chuẩn S =
+ Hệ số biến động: S% =
+ Tính sai số tuyệt đối: = 1,96.
+ Levene test: dùng kiểm định phương sai bằng nhau hay khơng giữa
các nhóm
Ho: “Phương sai bằng nhau” Sig <= 0.05: bác bỏ Ho
Sig >0.05: chấp nhận Ho -> đủ điều kiện để phân tích tiếp anova ANOVA test: Kiểm định anova
Ho: “Trung bình bằng nhau”
Sig <=0.05: bác bỏ Ho -> đủ điều kiện để khẳng định có sự khác biệt giữa các nhóm đối với biến phụ thuộc
Sig >0.05: chấp nhận Ho -> chưa đủ điều kiện để khẳng định có sự khác biệt giữa các nhóm đối với biến phụ thuộc
Khi có sự khác biệt thì có thể phân t ch sâu hơn để tìm ra sự khác biệt như thế nào giữa các nhóm quan sát bằng các kiểm định Tukey, LSD, Bonferroni, Duncan như hình dưới.
Viết báo cáo phân t ch, đánh giá kết quả thực hiện nội dung nghiên cứu.
n xi fi . ) ) ( 2 2 S . 100 . X S n 3
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU, THẢO LUẬN
3.1. Đặc điểm sinh vật học lồi Tam thất rừng
3.1.1. Đặc điểm hình thái, giải phẫu
3.1.1.1. Đặ điểm inh t họ
Tam thất gừng là cây thân thảo, sống nhiều năm, thân ngầm còn gọi là thân củ (căn hành) mọc ngầm dưới đất và phân thành nhiều nhánh như củ gừng ta, mỗi nhánh gồm nhiều đốt do bẹ lá rụng đi tạo thành.
Thân khí sinh (thân giả) do các bẹ lá tạo thành chiều cao đến vút đầu lá tới 40-50cm, bình quân cao khoảng 30cm. Phía gốc thân ngầm mang nhiều rễ dạng rễ chùm. Thân củ phình to có dự trữ nhiều tinh bột và chứa tinh dầu thơm, vỏ phía ngoài màu nâu nhạt.
Lá bao gồm bẹ lá dài từ 10-15cm ốp sát nhau tạo thành thân giả, khi khô chuyển sang màu nâu và sớm rụng. Phiến lá thn dài 20-25cm; rộng 3-5cm có một gân chính ở giữa gân thứ cấp hơi chếch hoặc gần song song với gân chính. Các gân lõm ở mặt trên và nổi rõ ở mặt dưới, đỉnh lá nhọn, gốc lá hình nêm, mặt lá hơi gợn sóng. Mỗi cây có từ 3-5 lá.
Các hoa dạng gié khơng có cuống và đ nh trực tiếp vào cuống chung, phía ngồi cuống chung có 2 lá ốp lấy cuống chung tạo thành gần giống hình chng ngược, các hoa ở trong cuống chung nở từng chiếc một. Mỗi cuống chung mang từ 2-6 hoa, mỗi hoa có một lá bắc to và một lá bắc con dài và hẹp, đài hợp gốc tạo thành ống dài khoảng 2cm chia thành 2 môi, trên đỉnh có 3 răng nhỏ. Tràng hoa hợp thành ống dài khoảng 3cm màu trắng mang 3-5 cánh hẹp hình mũi mác. Trong hoa mang các nhị màu trắng và chỉ nhị ngắn, nhụy xẻ 3 thùy, vòi nhụy dạng mảnh. Bầu nỗn hạ có 3 buồng do 3 tâm bì tạo thành. Quả dạng hình trứng dài khoảng 1,5cm; rộng
0,8cm. Hạt (chưa rõ).
(1) (2)
Hình 3.1. (1) Hình thái phiến lá Tam thất gừng; (2) Hình thái thân, rễ và củ Tam thất gừng 1 năm tuổi
3.1.1.2. Đặ điểm giải phẫ , diệp ụ
* Đặc điểm giải phẫu
- Kết quả phân tích giải phẫu lá:
Dưới đây là số liệu giải phẫu của lồi Tam thất gừng được đo ở vật kính 10:
Bảng 3.1. Kết quả phân tích giải phẫu lá Tam thất gừng
(Đơn vị: µM) BDL CTT BBT MG MK MDH BBD CTD L1 230,81 7,55 46,54 0 0 82,61 88,45 5,66 L2 229,7 7,55 46,65 89,96 79,25 6,29 L3 234,92 8,18 47,17 90,72 82,88 5,97 TB 231,81 7,76 46,79 87,76 83,53 5,97
Chú thích: CCT: cutin trên; BBT: biểu bì trên; MD: mơ d u; MK: mơ khuyết; BBD: biể bì dưới; C D: tin dưới; BDL: bề dày lá.
Ở Tam thất gừng, khơng thấy có sự xuất hiện của biểu bì nhiều lớp ở cả mặt trên và mặt dưới của lá. Tuy nhiên, độ dày của lớn biểu bì trên khá lớn (46,79 µM), khơng có chứa lục lạp, màu sáng vì vậy có khả năng phản
xạ ánh sáng cao. Lớp cutin trên khá dày (7,76 µM) chứng tỏ tính chống chịu các điều kiện bất lợi từ mơi trường ngồi là khá cao. Các chỉ số về tỷ lệ chiều dày của biểu bì trên và biểu bì dưới (46,79/83,53) và cutin trên với cutin dưới (7,76/5,97) là chênh lệch phản ánh sự tiếp nhận không đồng đều các điều kiện ngoại cảnh (ánh sáng) đến hai mặt của lá. Điều đó thể hiện Tam thất gừng có khả năng chống chịu được với các mơi trường nắng nóng nhất định (bảng 3.1 và hình 3.2).
Nằm giữa hai lớp biểu bì trên và dưới là lớp mô đồng hóa. Ở lồi Tam thất gừng lớp mô này chỉ có mơ khuyết, chiếm phần lớn bề dày lá, gồm các tế bào xếp lỏng lẻo và chứa nhiều khoảng gian bào, phục vụ quá trình quang hợp.
Theo Nguyễn Như Khanh (1996) tỷ lệ giữa mơ đồng hóa và bề dày lá của loài cây ưa sáng phải đạt trên 80% trong khi đó ở lồi Tam thất gừng tỷ lệ này chỉ đạt 35,79 – 38,62% bình quân đạt 37,86%. Đây là cơ sở ban đầu cho thấy Tam thất gừng là lồi chịu bóng.
Hình ảnh giải phẫu
Cutin trên Biểu bì trên
Mơ đồng hóa
*Kết quả phân t ch hàm lượng diệp lục a,b
Trong các tác dụng do ánh sáng gây ra thì những phản ứng sinh học do diệp lục thực hiện là lớn nhất. Diệp lục là sắc tố quang hợp, chúng tạo ra sản phẩm hữu cơ cho cây. Những cây ưa sáng là những cây có hàm lượng diệp lục thấp, tỷ lệ diệp lục a/b cao; cây chịu bóng có hàm lượng diệp lục cao, tỷ lệ diệp lục a/b thấp. Hàm lượng diệp lục, đặc biệt là tỷ lệ diệp lục a b được xem là chỉ tiêu quan trọng trong việc đánh giá nhu cầu ánh sáng của cây.
Bảng 3.2. Kết quả xác định hàm lƣợng diệp lục a, b của loài Tam thất gừng
D649 D665 X Chla (mg/l) Y Chlb (mg/l) a/b A L1 0,409 0,798 8,46789 4,56287 1,8558 1,303 L2 0,407 0,789 L3 0,413 0,784 TB 0,40967 0,79033 Chú thích: L1, L2, L3: s lần lặp D649:bước sóng 649 nm
D665:bước sóng 665 nm (thí nghiệm sử dụng dịch chiết ethanol 96%) X Ch , Y Ch b: hàm ượng các sắc t quang hợp (mg/l)
A: hàm ượng diệp lụ mg/g m á tươi
Kết quả phân tích cho thấy hàm lượng diệp lục a,b ở Tam thất gừng là không cao, đặc biệt tỷ lệ a/b (1,8558) là thấp (bảng 3.2) (cây chịu bóng có tỷ lệ diệp lục a b < 2,3). Điều này hoàn toàn phù hợp cho thấy nhu cầu ánh sáng của Tam thất gừng là không cao, tương ứng với sự dày lên của lớp biểu bì và lớp sáp ở bề mặt trên để phản xạ lại lượng ánh sáng tự nhiên. Từ phân tích cấu tạo giải phẫu lá và phân t ch hàm lượng diệp lục có thể nhận định Tam thất gừng là lồi cây chịu bóng, có nhu cầu ánh sáng
không cao. Đây là cơ sở khoa học để lựa chọn hoàn cảnh phù hợp để trồng và nên trồng loài cây này dưới tán rừng hoặc vườn cây ăn quả, vườn rừng để tăng thu nhập và tận dụng đất đai.
3.1.2. Đặc điểm vật hậu
Tại khu vực nghiên cứu, thời điểm ra chồi từ thân khí sinh (thân giả)