4.3.2.1. Phương pháp giâm hom
Dùng đoạn thân có chứa chồi của cây Bình vôi để nhân giống. Phần thân đƣợc lấy trên cây mẹ có thời gian sinh trƣởng trên 1 năm trở đi, khỏe mạnh và không sâu bệnh. Chọn những đoạn thân bánh tẻ (không già quá và không non quá) để cắt làm hom giống, dùng dao sắc cắt thành các đoạn hom, mỗi đoạn hom cắt khoảng 2 đốt (có 3 mắt lá), sau đó cắt sạch lá ở mắt lá phía gốc rồi cho ngay vào xô nƣớc sạch để cho hom khỏi bị héo. Chú ý nên cắt gần sát mắt gốc để hom dễ ra rễ.
Sau khi cắt ngâm vào dung dịch thuốc Benlate nồng độ 0,3% thời gian 15 phút, sau đó vớt vật liệu hom ra khay cho ráo nƣớc. Khi giâm hom chấm gốc hom vào dung dịch thuốc kích thích sao cho phủ kín mặt gốc của hom và cấy ngay vào luống, nền giâm là đất có chứa nhiều mùn. Hom giống cây Bình vôi giâm phải đƣợc để trong nhà lƣới có mái che lƣới đen 70% (cần che chắn xung quanh để tránh gió lùa vào làm cây héo), sau đó cần tƣới từ 2 - 4 lần/ngày để đảm bảo cây không bị mất nƣớc, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình ra rễ của hom giống.
4.3.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng IBA và thể nền đến kết quả giâm hom.
Giâm hom sau khoảng 45 ngày tại vƣờn ƣơm Vƣờn Quốc gia Cát Bà, thí nghiệm với chất điều hòa sinh trƣởng IBA ở các nồng độ khác nhau và 02 loại thể nền. Để đánh giá ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng tới kết quả giâm hom loài cây Bình vôi tiến hành đánh giá trên các chỉ tiêu về tỷ lệ hom ra chồi, số chồi/hom, chiều dài chôi/hom. Kết quả đƣợc tổng hợp tại biểu sau :
Kết quả theo dõi ở cả 3 lần thí nghiệm thì khả năng ra chồi, số chồi/hom, chiều dài chồi/hom không có sự chênh lệch đáng kể. Chính vì vậy chúng tôi tiến hành tính trung bình chung cho 3 lần lặp. (Với cùng một thời gian cắm hom, cùng một thời điểm quan sát chồi hom (sau 45 ngày kể từ ngày cấy hom)
a) Ảnh hưởng đến tỷ lệ hom ra chồi
Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của IBA đến khả năng ra chồi của Bình vôi đƣợc tổng hợp ở bảng sau:
Bảng 4.15: Ảnh hƣởng của IBA ở các nồng độ và thể nền khác nhau đến tỷ lệ hom ra chồi Loại thể nền Kết quả giâm hom Nồng độ Đối chứng 500ppm 1000ppm 1500ppm Số hom TN 30 30 30 30 Thể nền 1 Số hom ra chồi 18 19 12 8 Tỷ lệ (%) 60,00 63,33 40,00 26,67 Thể nền 2 Số hom ra chồi 20 24 15 10 Tỷ lệ (%) 66,67 80,00 50,00 33,33
Kết quả bảng 4.15 thấy khi xử lý Bình vôi bằng IBA và thể nền ở các nồng độ khác nhau cho tỷ lệ hom ra chồi có sự khác biệt rõ rệt. Trong đó công thức xử lý cho tỷ lệ hom ra chồi cao nhất là IBA nồng độ 500ppm ở thể nền 2 với 24/30 hom ra chồi đạt 80%. Còn ở công thức khi xử lý ở nồng độ 150ppm ở thể nền 1 cho tỷ lệ hom ra chồi thấp nhất chỉ có 8/30 hom ra chồi (26,67%)
Ảnh hƣởng của thể nền và nồng độ IBA đến tỷ lệ hom ra chồi sử dụng phƣơng pháp phân tích phƣơng sai 2 nhân tố cho kết quả nhƣ sau:
Ảnh hƣởng của nồng độ IBA, ta có FA = 62,83 > F05 =10,13 nhƣ vậy ảnh hƣởng của nồng độ thuốc kích thích sinh trƣởng đến tỉ lệ hom ra chồi là khác nhau rõ ràng. Công thức ảnh hƣởng thể nền, có FB = 18 > F05 =10,13, do vậy ảnh hƣởng
của thể nền đến tỉ lệ hom ra chồi cũng khác nhau. Điều đó có nghĩa rằng, nồng độ của IBA có ảnh hƣởng đến khả năng ra chồi của loài Bình vôi.
Tìm ra công thức có ảnh hƣởng tốt nhất đến khả năng ra chồi của hom ta tiến hành kiểm tra: Đối với ảnh hƣởng của IBA :│t │tính toán = 2,5 < t05 tra bảng = 3,18 nên cả 2 công thức xử lý ở nồng độ thuốc 500ppm và công thức đối chứng đều là công thức xử lý tốt nhất; Ảnh hƣởng của thể nền :│t │tính toán = 4,24 > t05 tra bảng = 3,18 nên công thức xử lý ở thể nền 2 tốt hơn. Kết hợp kiểm tra cả 2 nhân tố trên ta có thể kết luận công thức xử lý IBA ở nồng độ 500ppm, ở thể nền 2 cho kết quả tốt nhất.
b) Ảnh hưởng đến số chồi trung bình/hom
Bảng 4.16: Ảnh hƣởng của BAP ở các nồng độ và thể nền khác nhau đến số chồi trung bình trên hom
Nồng độ Loại thể nền
Số chồi trung bình/hom
Đối chứng 500ppm 1000ppm 1500ppm
Thể nền 1 1,44 1,72 1,26 1,0
Thể nền 2 1,65 1,86 1,32 1,16
* Một số hình tạo hom và giâm hom Bình vôi
Hình 4.13: Bình vôi 12 ngày tuổi Hình 4.14: Bình vôi 25 ngày tuổi
(Nguồn ảnh: Nguyễn Văn Dinh, (2016))
Với kết quả bảng 4.16 ta thấy số lƣợng chồi trung bình trên một hom dao động từ 1,00 – 1,86 chồi/hom. Công thức có số chồi trung bình trên hom tốt nhất là công thức thí nghiệm IBA nồng độ 50ppm, thể nền 2 cho số chồi trung bình trên hom cao nhất có 1,86 chồi /hom, tiếp đó là công thức thí nghiệm IBA nồng độ 500ppm ở thể nền 1 có 1,72 chồi/hom. Công thức xử lý IBA ở nồng độ 150ppm, thể nền 1 sô chồi trung bình trên hom là thấp nhất 1,00 chồi/hom.
Kiểm tra ảnh hƣởng của thể nền và nồng độ IBA đến số lƣợng chồi trên hom, mô hình phân tích phƣơng sai 2 nhân tố, ta thấy:
- Với công thức ảnh hƣởng của nồng độ IBA ta có FA = 5,55 > F05 = 3,18. Nhƣ vậy ảnh hƣởng của nồng độ IBA đến kết quả thí nghiệm là rõ ràng. │t │tính toán = 5,55 > t05 tra bảng = 3,18, nên công thức xử lý ở nồng độ 50ppm cho kết quả tốt nhất.
- Với ảnh hƣởng của thể nền ta có FB = 4,56 > F05 = 3,18 nhƣ vậy ảnh hƣởng của công thức thể nền là rõ ràng. │t│tính toán = 4,56 > t05 tra bảng = 3,18, nên công thức xử lý ỏ thể nền 2 cho kết quả tốt hơn.
Từ việc kết hợp kiểm tra 2 nhân tố trên ta thì công thức xử lý ở nồng độ IBA 500ppm ở thể nền 2 là công thức cho số chôi/hom cao nhất.
Kết quả phân tích kết quả giâm hom ảnh hƣởng của IBA ở các nồng độ và thể nền khác nhau đến số chồi trên hom của Bình vôi. Thấy trong cùng một loại thuốc nhƣng ở các nồng độ, thể nền khác nhau là có ảnh hƣởng rõ rệt tới số lƣợng chồi của hom Bình vôi.
c) Ảnh hưởng đến chiều dài trung bình của chồi/hom
Bảng 4.17: Ảnh hƣởng của IBA ở các nồng độ và thể nền khác nhau đến chiều dài chồi trung bình trên hom Bình vôi
Nồng độ Loại thể nền
Số chồi trung bình/hom
Đối chứng 500ppm 1000ppm 1500ppm
Thể nền 1 2,35 3,18 1,67 1,24
Thể nền 2 2,76 3,52 1,98 1,56
Qua bảng 4.17 chiều dài chồi trung bình trên một hom dao động từ 1,24 – 3,52 cm chồi/hom. Công thức có chiều dài chồi trung bình trên hom tốt nhất là công thức thí nghiệm IBA nồng độ 500ppm, thể nền 2 cho chiều dài chồi trung bình trên hom cao nhất là 3,52 cm chồi/hom, tiếp đó là công thức thí nghiệm IBA nồng độ 1000ppm ở thể nền 1 có chiều dài chồi/hom thấp có 1,26cm chồi/hom.
Sử dụng phƣơng pháp phân tích phƣơng sai 2 nhân tố để kiểm tra ảnh hƣởng của thể nền và nồng độ BAP đến chiều dài chồi trên hom. Kết quả nhƣ sau:
- Với công thức ảnh hƣởng của nồng độ IBA ta có FA = 1.443,89 > F05 = 9,28 nhƣ vậy ảnh hƣởng của nồng độ IBA đến kết quả giâm hom là rõ ràng.│t │tính toán = 24,93 > t05 tra bảng = 3,18, nên công thức xử lý ở nồng độ 500ppm cho kết quả tốt nhất.
- Với công thức thể nền ta có FB = 234.15 > F05 = 10,13 nhƣ vậy ảnh hƣởng của thể nền đến kết quả thí nghiệm là rõ rệt. │t│tính toán = 15,30 > t05 tra bảng = 3,18, nên công thức xử lý ở thể nền 2 tốt hơn
Nhƣ vậy, qua phân tích kết quả giâm hom ảnh hƣởng của IBA ở các nồng độ và thể nền khác nhau đến chiều dài chồi của Bình vôi. Thấy trong cùng một loại
thuốc nhƣng ở các nồng độ, thể nền khác nhau là có ảnh hƣởng khác nhau không rõ rệt tới chiều dài chồi trung bình trên hom của Bình vôi. Các công thức thí nghiệm chọn công thức thí nghiệm tốt nhất có chiều dài chồi trên hom cao nhất là IBA 500ppm ở thể nền 2 làm công thức thí nghiệm tốt nhất.
* Sau khi thử nghiệm phân tích số liệu ta thu đƣợc kết quả nhƣ sau: Kết quả cho thấy ở nồng độ thuốc 500 PPM, thể nền 2 sau đó là công thức không xử lý thuốc kích thích, xử lý với nồng độ thuốc càng cao thì tỉ lê hom ra chồi, số chồi trên hom, chiều dại chồi trên hom lại giảm đi, nhƣ vây khi xử lý ở nồng độ thuốc càng cao sẽ ức chế sinh trƣởng của hom Bình vôi.
* Một số hình ảnh nhân giống Bình vôi từ hom:
Hình 4.15: Hom đƣợc đƣa vào bầu Hình 4.16: Cây đã quấn quanh giá thể
(Nguồn ảnh: Nguyễn Văn Dinh, (2016))
4.3.3. Thử nghiệm nhân giống Củ Bình vôi bằng phương pháp Nuôi cấy mô.
4.3.3. 1. Kết quả giai đoạn vào mẫu, tạo nguồn nguyên liệu khởi đầu
Đây là giai đoạn tối quan trọng, thậm chí quyết định toàn bộ quy trình nhân giống invitro. Mục đích của giai đoạn này là tạo đƣợc vật liệu thực vật vô trùng vào nuôi cấy in vitro.
Hình 4.17: Nuôi ấy mô loài Bình vôi trong phòng nghiệm tại Trung tâm Công nghệ Hải Phòng.
(Nguồn ảnh: Nguyễn Văn Dinh, (2016))
Vật liệu sử dụng cho quá trình vào mẫu là đoạn thân mang mắt ngủ dài khoảng 2-3cm của cây Bình vôi. Mẫu cấy đƣợc rửa dƣới vòi nƣớc chảy, lắc đều
trong dung dịch xà phòng loãng khoảng 1 phút và rửa lại dƣới vòi nƣớc chảy. Sau đó, mẫu cấy đƣa vào thao tác trong tủ cấy vô trùng.
Dung dịch khử trùng đƣợc sử dụng trong thí nghiệm là viên khử trùng Preset 5g/l (thành phần của Presep: Natri Dichloroisocyanutrale khan 50%, Adipic Acid 22.5%, các thành phần khác 27,5%)và HgCl2 0,2%.
Mẫu vô trùng đƣợc cấy trên môi trƣờng cơ bản MS có bổ sung 30g/l sucrose, 100mg/l inositol, 6g/l agar
Kết quả thí nghiệm đƣợc trình bày trong bảng sau:
Bảng 4.18: Ảnh hƣởng của dung dịch khử trùng đến mẫu cấy (sau 3 tuần) Chỉ tiêu theo dõi Công thức Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) CT1: Presept (5g/l): 5 phút 65,33 34,67 CT2: Presept (5g/l): 7 phút 83,33 16,67 CT3: HgCl2 0,2 %: 5 phút 75,00 25,00 CT4: HgCl2 0,2 %: 7 phút 50,67 49,33
Kết quả mẫu biểu trên cho thấy:
- Kết quả khử trùng mẫu đạt cao nhất ở CT2 là 83,33% trong 7 phút và tiếp đó là CT3 đạt 75% trong 5 phút. Mức độ sát khuẩn của HgCl2 mạnh hơn so với viên khử trùng Preset
- Tuy nhiên, trong thí nghiệm này chúng tôi lựa chọn chất khử trùng là viên khử trùng Preset vì: Thủy ngân là chất độc có khả năng tích lũy và tồn tại dai dẳng gây tác hại kéo dài đối với sức khỏe con ngƣời. Viên khử trùng Preset không gây nguy hiểm gì khi tiếp xúc với da và niêm mạc; thời gian duy trì khả năng diệt khuẩn cao của viên khử trùng Preset tƣơng đối ngắn (dƣới năm ngày) không gây ảnh hƣởng đến mẫu cấy và môi trƣờng nuôi cấy
4.4.3 2. Kết quả giai đoạn tái sinh và nhân nhanh chồi
Sau khi tạo đƣợc nguồn vật liệu khởi đầu, các mẫu cấy đƣợc chuyển sang môi trƣờng có bổ sung chất điều tiết sinh trƣởng thuộc nhóm cytokinin là BA để tái sinh và nhân nhanh chồi. Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, BA là một cytokinin
tổng hợp có tác động kích thích sự phân chia tế bào, phân hoá chồi và kích thích nảy mầm chồi ngủ, tạo nên sự trẻ hoá của các bộ phận và toàn cây, nên đƣợc sử dụng rộng rãi. Trong nhiều trƣờng hợp BA là hợp chất không thể thay thế đƣợc trong quá trình nuôi cấy in vitro.
Ở giai đoạn này chúng tôi đã bổ sung BA vào môi trƣờng MS với các nồng độ 0mg/l; 0,1mg/l; 0,2mg/l và 0,3mg/l.
Kết quả thí nghiệm đƣợc trình bày trong bảng sau:
Bảng 4.19: Ảnh hƣởng của BA đến chất lƣợng chồi tạo thành và hệ số nhân nhanh của cây Bình vôi (sau 7 tuần )
Chỉ tiêu theo dõi Công thức Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) Hệ số nhân chồi (lần) Chiều cao TB của chồi (cm) CT1 (đ/c) + 0 BA 0,00 0,00 1,51 CT2 + 0,1 mg/l BA 45,21 3,07 2,29 CT3 + 0,2 mg/l BA 87,13 4,13 2,88 CT4 + 0,3 mg/l BA 72,30 3,23 1,24 CV% - - 4,00 2,60 LSD0,05 - - 0,17 0,56
Kết quả bảng 4.19 cho thấy:
- Việc bổ sung chất điều tiết sinh trƣởng BA trong giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy, có tác dụng tăng cƣờng sự sinh trƣởng và khởi động sự tạo chồi của cây Bình vôi. Khi bổ sung BA vào môi trƣờng nuôi cấy, tỷ lệ mẫu cảm ứng tạo chồi từ 45,21-90,13%, cao hơn công thức đối chứng (0%). Tỷ lệ mẫu cảm ứng tạo chồi đạt cao nhất ở CT3 là 87,13%. Khi tăng nồng độ BA ở CT4 tỷ lệ mẫu cảm ứng tạo chồi lại có xu hƣớng giảm, đạt 72,30%
- Chất điều tiết sinh trƣởng BA ngoài tác dụng đẩy mạnh sự phân chia tế bào còn có tác dụng kích thích sự tạo nhánh bên. Hệ số nhân chồi và chiều cao chồi tăng khi bổ sung BA vào môi trƣờng nuôi cấy. CT3 cho hệ số nhân chồi cao nhất là 4,13 lần và chiều cao chồi trung bình đạt 2,88cm. Tuy nhiên, khi bổ sung BA với nồng
độ 0,3mg/l, chỉ tiêu về hệ số nhân và chiều cao chồi giảm; chất lƣợng chồi kém, chồi mảnh, ngắn, lá có màu vàng.
Qua bảng 4.19 có thể thấy, sự sai khác giữa các công thức ở cả hai chỉ tiêu hệ số nhân chồi và chiều cao chồi đều có ý nghĩa ở mức 5%.
4.3.3.3. Kết quả giai đoạn ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh
Cây giống invitro sẽ hấp thu nƣớc và dinh dƣỡng thông qua bộ rễ. Do đó cây giống sẽ sinh trƣởng tốt ở vƣờn ƣơm nếu có đƣợc bộ rễ khỏe. Môi trƣờng ra rễ thƣờng đƣợc bổ sung các auxin để thích thích và nâng cao khả năng ra rễ cũng nhƣ chất lƣợng rễ. α- NAA là một auxin điển hình và có hiệu quả rất tốt ở nhiều đối tƣợng cây trồng.
Các chồi phát triển bình thƣờng và có chiều cao 3-3,5cm sẽ đƣợc tách riêng rẽ và cấy chuyển sang môi trƣờng kích thích ra rễ
Chúng tôi bố trí thí nghiệm với môi trƣờng có bổ sung thêm 0,1 mg/l; 0,2mg/l và 0,3mg/l α- NAA nhằm khảo sát ảnh hƣởng của α- NAA đến sự ra rễ của chồi cây Bình vôi
Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 4.20:
Bảng 4.20: Ảnh hƣởng của than hoạt tính đến quá trình ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của cây Bình vôi (sau 4 tuần )
Chỉ tiêu theo dõi
Công thức Tỷ lệ ra rễ (%) Số rễ TB/cây (cái) Số lá TB/cây (lá) Chiều cao TB của cây (cm) CT1 (đ/c) + 0 α- NAA 0,00 0,00 1,34 3,85 CT2 + 0,1 mg/l α- NAA 100 5,15 2,95 5,66 CT3 + 0,2 mg/l α- NAA 100 4,35 2,71 5,46 CT4 + 0,3 mg/l α- NAA 100 2,22 3,42 4,83 CV% - - 1,30 3,10 4,30 LSD0,05 - - 0,14 0,24 0,26
- Hiệu quả của α- NAA bổ sung vào môi trƣờng thể hiện rõ ở tỷ lệ ra rễ của chồi cây Bình vôi, các công thức CT2, CT3 và CT4 đều có tỷ lệ ra rễ đạt 100%
- Ngoài ra, việc bổ sung thêm α- NAA còn có hiệu quả tăng số cao số lƣợng rễ trung bình/chồi và chiều cao chồi. Tất cả công thức có bổ sung α- NAA đều có số