Từ các tài liệu tham khảo trong nƣớc và thế giới cho thấy nghiên cứu về các loài cây thuốc trên thế giới khá phong phú, với nhiều công trình nghiên cứu từ thời cổ đại đến thời đại ngày nay. Tuy nhiên có rất ít những nghiên cứu về Củ Bình vôi, trong nƣớc tuy đã có một số ít đề tài nghiên cứu về loài cây này nhƣng mới dừng lại ở mức độ nhất định. Các nghiên cứu đó chƣa tập trung đi sâu vào việc mô tả đặc điểm sinh vật học, phân bố, khai thác sử dụng cũng nhƣ thử nghiệm nhân giống, trồng loài Củ Bình vôi. Đây là vấn đề tồn tại cần triển khai nghiên cứu tiếp theo để góp phần bảo tồn và phát triển nguồn gen loài cây thuốc quý Bình vôi.
Chƣơng 2
MỤC TIÊU, NỘI DUNG, ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Mục tiêu
2.1.1. Mục tiêu chung
Góp phần bảo tồn và phát triển đƣợc loài cây thuốc quý Bình vôi tại VQG Cát Bà và từng bƣớc đáp ứng nhu cầu sử dụng làm thuốc bảo vệ sức khỏe của ngƣời dân.
2.1.2. Mục tiêu cụ thể
- Xác định đƣợc đặc điểm sinh vật học và sinh thái của loài Bình vôi tại Cát Bà làm cơ sở cho công tác bảo tồn.
- Đánh giá đƣợc thực trạng khai thác, sử dụng và các tác động ảnh hƣởng tới bảo tồn loài, đề xuất giải pháp bảo tồn loài Bình vôi tại Cát Bà.
2.2. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu:
* Đối tƣợng: Loài Bình vôi phân bố tự nhiên tại Vƣờn Quốc gia Cát Bà * Phạm vi nghiên cứu:
- Đề tài chỉ tiến hành điều tra tại vùng lõi của Vƣờn Quốc gia Cát Bà;
- Thử nghiệm nhân giống hạt và hom tại Vƣờn ƣơm Vƣờn Quốc gia Cát Bà; nuôi cây mô tại Trung tâm ứng dụng công nghệ cao tại Hải Phòng.
- Thời gian nghiên cứu: Tháng 2/2016-10/2016
2.3. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu một số đặc điểm sinh vật học và sinh thái học tại khu vực nghiên cứu.
+ Đặc điểm vật hậu của loài.
+ Đặc điểm tái sinh tự nhiên của loài
+ Đặc điểm cấu trúc rừng nơi có Bình vôi phân bố + Đặc điểm đất rừng nơi có Bình vôi phân bố
+ Xác định khả năng thích nghi của loài với ánh sáng.
- Nghiên cứu đặc điểm phân bố của Bình vôi tại khu vực nghiên cứu
- Thử nghiệm nhân giống loài Bình vôi tại Vƣờn Quốc gia Cát Bà - Đề xuất giải pháp bảo tồn loài Bình vôi tại Cát Bà.
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp điều tra ngoại nghiệp
2.4.1.1. Phương pháp xác định phân bố loài Bình vôi tại khu vực nghiên cứu
* Phương pháp kế thừa số liệu và phỏng vấn
+ Kế thừa các nguồn tài liệu, các kết quả nghiên cứu có liên quan đến loài nghiên cứu về phân bố của loài.
+ Tham vấn, phỏng vấn 10 cán bộ VQG Cát Bà và 18 ngƣời dân địa phƣơng về các vị trí từng ghi nhận sự xuất hiện của loài làm cơ sở xây dựng các tuyến điều tra để xác định vùng phân bố của loài.
*Phương pháp điều tra thực địa
- Dụng cụ chuẩn bị: Máy định vị GPS; La bàn; Máy ảnh, bút, giấy ghi chép; Bản đồ giấy
- Phƣơng pháp điều tra theo tuyến và ô tiêu chuẩn
+ Số lƣợng tuyến điều tra dự kiến: 05 tuyến đại diện cho khu vực nghiên cứu; Ô tiêu chuẩn lập tại khu vực có Bình vôi phân bố, 25 OTC ( vì là địa hình núi đá vôi nên chọn diện tích 500m2
/OTC các tuyến điều tra (5 OTC/tuyến).
+ Tuyến điều tra đƣợc thiết kế qua các kiểu thảm thực vật rừng, trạng thái rừng và dạng địa hình, độ cao... khác nhau.
+ Trên các tuyến điều tra, lựa chọn những vị trí có trạng thái rừng điển hình có loài Bình vôi phân bố để đặt các ô tiêu chuẩn; số lƣợng các ô tiêu chuẩn phụ thuộc vào chiều dài tuyến điều tra, nhƣng phải đảm bảo độ tin cậy. Ô tiêu chuẩn đƣợc đặt sao cho chiều dài ô song song với đƣờng đồng mức và diện tích ô không vắt qua đƣờng mòn hoặc các vị trí bị tác động khác biệt trong khu vực lập ô.
+ Sử dụng bản đồ hiện trạng rừng kết hợp với máy GPS điều tra theo từng tuyến một nhằm xác định sự phân bố của loài Bình vôi, khi thấy có sự phân bố của loài Bình vôi dùng máy GPS định vị tọa độ vị trí đó. Cứ tiến hành nhƣ vậy qua nhiều tuyến khác nhau, tổng hợp nhiều tuyến ta sẽ có đƣợc khu vực phân bố của loài Bình vôi trong khu vực điều tra.
Kết quả điều tra đƣợc ghi chép theo biểu 01
Biểu 01: Điều tra Bình vôi theo tuyến
Số hiệu tuyến: ...Chiều dài tuyến:... Địa điểm: ... Ngày điều tra: ... Ngƣời điều tra:... Tọa độ điểm đầu:... Tọa độ điểm cuối: ...
STT Tọa độ bắt gặp Bình vôi Chiều dài tuyến Số lƣợng Kích thƣớc củ Ghi chú 1 2 3
Cấp tuổi của cây: Do đặc thù của đối tƣợng nghiên cứu là dây leo sống lâu năm nên chúng tôi tạm thời phân cấp tuổi của Bình vôi nhƣ sau:
Cây mạ: Cây nhỏ.
Cây con: Cây nhỏ thân, chƣa ra hoa, kết quả.
Cây trƣởng thành: Cây trƣởng thành, đã ra hoa, kết quả, sức sống trung bình đến tốt.
Cây già, sắp chết: Cây già cỗi hoặc cây có sức sống kém nguy cơ chết cao.
Kích thƣớc củ đƣợc nhƣ sau nhƣ sau: Đƣợc đo đƣờng kính thân củ, chiều dài thân củ và cân nặng.
2.4.1.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh vật học và sinh thái của Bình vôi.
*. Phương pháp kế thừa số liệu và phỏng vấn
+ Kế thừa các nguồn tài liệu, các kết quả nghiên cứu có liên quan đến loài nghiên cứu về đặc tính sinh vật học và sinh thái học của loài.
+ Tham vấn, phỏng vấn 10 cán bộ VQG Cát Bà và 18 ngƣời dân địa phƣơng và chuyên gia về đặc điểm hình thái cây Bình vôi, mùa ra hoa, kết quả…
*. Phương pháp điều tra thực địa
a. Đặc điểm sinh vật học của loài
Quan sát, đo đếm và ghi chép các thông tin về đặc điểm hình thái và vật hậu của 30 cá thể phân bố ở các kiểu rừng khác nhau, các đai cao khác nhau và các cấp tuổi khác nhau.
Các chỉ tiêu đo đếm hình thái gồm: Củ (kích thƣớc, cân nặng); Thân (chiều dài thân, đƣờng kính của thân và các đặc điểm đặc trƣng của thân); Lá (kích thƣớc, hình dạng, hệ gân, cuống); đặc điểm hình thái hoa; đặc điểm hình thái quả.
Vật hậu: Quan sát ghi chép tất cả các đặc điểm vật hậu của loài khi gặp ngoài thực địa (thời gian ra hoa, kết quả, quả chín, hạt nảy mầm, ra chồi non, lá non...).
đồng thời kết hợp giữa tham khảo tài liệu và phỏng vấn ngƣời dân và cán bộ VQG thu thập các thông tin về vật hậu nhƣ: Ra lá non, lá vàng, mầm hoa…
Đặc điểm tái sinh, cấu trúc tuổi của quần thể, đƣợc tổng hợp trên các tuyến điều tra và ô tiêu chuẩn.
Biểu 02: Điều tra vật hậu loài cây Bình vôi
Bộ phận quan sát
Đặc điểm quan sát
Thời điểm quan sát
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 Nảy chồi Lá Ra lá non Lá vàng, rơi rụng Hoa Mầm hoa Hoa bắt đầu nở Hoa nở rộ Hoa tàn Quả Quả non Quả già Quả rụng
Chú thích: Đánh dấu x xuất hiện vật hậu
Nghiên cứu cấu tạo giải phẫu lá cây Bình vôi.
- Dựa vào kết quả điều tra ngoài thực địa tiến hành tổng hợp đặc tính sinh học của loài (vật hậu: mùa hoa quả, ra lá non, nảy chồi, rụng lá, tình hình tái sinh…thể, đánh giá xu hƣớng biển đổi của quần thể) tổng hợp, xử lý tính toán và phân tích.
b. Đặc điểm điều kiện nơi sống của loài
Do hạn chế về mặt thời gian, nhân lực, địa hình rộng và phức tạp, chỉ tiến hành điều tra đặc điểm rừng, thổ nhƣỡng và độ tàn che nơi có Bình vôi phân bố.
- Đặc điểm rừng nơi loài Bình vôi phân bố.
Nội dung này đƣợc xác định chủ yếu thông qua kết quả điều tra, tổng hợp trong các ô tiêu chuẩn có Bình vôi phân bố. Nội dung điều tra ngoại nghiệp trong các ô tiêu chuẩn theo các biểu 03,04,05.
Biểu 03: Điều tra tầng cây cao
ÔTC:...Diện tích OTC: ... Độ cao:...Địa điểm: ... Độ dốc:...Hƣớng dốc: ... Vị trí: ...Tọa độ: ... Kiểu rừng:………..Trạng thái rừng:………. Độ che phủ...Độ tàn che... STT Tên cây D1.3 (cm) Dt (m) Hvn (m) Hdc (m) Phẩm chất Ghi chú 1 2
Biểu 04: Điều tra cây tái sinh TT
ÔDB Tên loài
Nguồn gốc TS Chiều cao (cm) Chất lƣợng Hạt Chồi <50 50-100 >100 Tốt TTB Xấu
1 2 3
Biểu 05: Điều tra tầng cây bụi, thảm tƣơi ÔDB Trạng thái rừng Vị trí Độ cao Độ dốc
(%) Tên cây Số bụi Số cây % CP Htb
(m)
Ghi chú
* Điều tra cây bụi dây leo thực vật ngoại tầng và cây tái sinh đƣợc tiến hành trong 5 ô dạng bản 25m2 (5x5m) đƣợc bố trí đều trong các ô tiêu chuẩn
c. Phƣơng pháp điều tra đất nơi Bình vôi phân bố
Tiến hành lấy mẫu đất tại ODB nơi có loài phân bố. Trọng lƣợng đất lấy khoảng 0,5kg/tầng cho vào túi nilong có phiếu ghi rõ số hiệu ODB, tầng đất, độ sâu tầng, vị trí, ngày lấy mẫu...
* Xử lý phân tích mẫu đất:
Mẫu đất thu vè và phơi khô nhặt bỏ chất lẫn vào: Đá, sỏi, rễ cây, … rồi tiến hành dã nhỏ bằng cối đồng và chày có đầu bọc bằng cao su, sau đó sàng qua rây lƣới có đƣờng kính mắt lƣới 0,25mm. Tiếp theo tiến hành phân tích các chỉ tiêu trong phòng thí nghiệm theo các phƣơng pháp:
+ Hàm lƣợng mùn phân tích bằng phƣơng pháp Tiurin. + Độ pHklc : Bằng máy đo pH metter
+ Mùn tổng số phân tích theo phƣơng phápTiurin
+ Thành phần cơ giới phân tích theo phƣơng pháp ống dung trọng + Xác định N (NH4+), phân tích theo phƣơng pháp Kjeldahl + Xác định P (P2O5) dễvtiêu phân tích theo phƣơng pháp Onianai + Xác địnhK (K2O5) dễvtiêu phân tích theo phƣơng pháp Matlova + Độ chua phân tích theo phƣơng pháp Kappen, Xôcôlốp
+ Xác định độ ẩm bằng phƣơng pháp cân sấy ở 1050C đến khi trọng lƣợng không đổi.
Biểu 06: Phiếu mô tả đặc điểm lấy mẫu đất
OTC: Loại đá mẹ: Địa điểm khảo sát: Vị trí mẫu đất Ngày tả: Độ dốc: Ngƣời điều tra:
Kí hiệu mẫu Độ sâu tầng đất (cm) Tên tầng đất Màu sắc Độ ẩm(%) Mùn (%) Sa cấu đất Rễ cây (%) Kết cấu đất Cấu trúc Độ chặt Độ chua Thành phần cơ giới
d. Phƣơng pháp điều tra độ tàn che tại khu vực nơi Bình vôi phân bố
Độ tàn che có thể đƣợc xác định bằng nhiều cách. Một trong những cách dễ áp dụng, nhanh và cho kết quả chính xác là ƣớc đoán bằng mắt, trong đó một thang các giá trị phù hợp đƣợc đƣa ra áp dụng bảng 07. Mỗi ô mẫu nghiên cứu đƣợc áp một thang giá trị phù hợp, lấy giá trị điểm giữa, sau đó tính giá trị trung bình cho tất cả các ô nghiên cứu. Các ô không có cá thể loài xuất hiện đƣợc tính giá trị 0.
Biểu 07: Xác định độ tàn che
Thang giá trị Khoảng tàn che (%)
2.4.1.3. Phương pháp nghiên cứu các tác động ảnh hưởng đến loài Bình vôi tại khu vực nghiên cứu.
Phương pháp kế thừa số liệu và phỏng vấn
- Kế thừa các số liệu đã nghiên cứu, thống kê tình hình sinh trƣởng, phát triển, biến động số lƣợng cá thể loài trƣớc đây so với hiện nay.
- Phỏng vấn cán bộ VQG Cát Bà, ngƣời dân địa phƣơng về tác động các ảnh hƣởng làm tăng hoặc giảm số lƣợng loài Bình vôi.
Phương pháp điều tra tuyến
Trên các tuyến điều tra tiến hành thu thập các thông tin tác động đến loài Bình vôi theo các nội dung biểu 08 dƣới đây:
Biểu 08: Điều tra tác trên tuyến
Số hiệu tuyến: Thứ tự tác động: GPS: Đối tƣợng gây tác động: Thời gian Mức độ tác động: Ghi chú
2.4.2. Phương pháp nội nghiệp
a. Phương pháp xác định phân bố Loài Bình vôi tại khu vực nghiên cứu
- Sử dụng phần mềm Mapinfo 10.5 và nền bản đồ số của Vƣờn Quốc gia Cát Bà để xây dựng các bản đồ sau:
+ Bản đồ các tuyến điều tra và vị trí các OTC trên tuyến điều tra. + Bản đồ phân bố của cây Bình vôi
- Sử dụng phần mềm MapSoure 4.0 để chuyển dữ liệu từ máy GPS vào phần mềm Mapinfo.
Từ kết quả ghi nhận các tọa độ bắt gặp cây Bình vôi trên các tuyến điều tra và OTC, sử dụng phần mềm Mapinfo 10.5 chồng ghép các lớp bản đồ để thể hiện các tuyến điều tra, OTC, vị trí phân bố của Bình vôi tại Vƣờn Quốc gia Cát Bà trên nền bản đồ số.
b. Phương pháp nghiên cứu cấu tạo giải phẫu lá cây Phương pháp:
Lấy 10 mẫu lá bánh tẻ của các cá thể khác nhau đƣợc lấy ngẫu nhiên, trên mỗi phiến lá, chọn 3 vị trí của phần thịt lá để giải phẫu. Giải phẫu theo chiều dày lá để đo đếm độ dày các mô bên trong thịt lá. Các mẫu giải phẫu đƣợc chụp ảnh, các thông số đƣợc đo đếm trên kính hiển vi OPTIKA microscopes, M-699 có gắn Optikam PRO 3 Digital Camera.
Biểu 09: Các chỉ tiêu giải phẫu lá cây Bình vôi
TT
Mẫu Vị trí
Các chỉ tiêu giải phẫu lá tại trong rừng tự nhiên (đơn vị)
CTT BBT MDH KK BBD CTD BDL KK/BDL
1 2
Ghi chú: - CTT: Cu tin trên; BBT: Biểu bì trên; MDH: Mô đồng hóa - KK: Khí khổng; BBD: Biểu bì dưới; CTD: Cu tin dưới - BDL: Bề dày lá; KK/BDL: Khí khổng/ bề dày lá
- Phân tích hàm lƣợng diệp lục.
c. Phương pháp xác định hàm lượng diệp lục a, b
Cân chính xác 0,5 gam lá cân phân tích, cho lá vào cối sứ cùng 2ml cồn tuyệt đối, them một ít CaCO3 và bông thủy tinh, rồi nghiền mẫu đến khi tạo thành một thể đồng nhất. Dùng giấy lọc, phễu thủy tinh lọc thu dịch chiết, dịch nghiền đƣợc rửa nhiều lần bằng dung dịch cồn tuyệt đối đến khi dịch chiết chảy ra không màu. Chuyển dịch chiết chảy sang bình định mức 50 ml, thêm cồn tuyệt đối đƣa thể tích dịch chiết lên đúng vạch đinh mức (có thể pha loãng dịch chiết tiếp). Đo mật đọ quang học của dịch chiết tại các bƣớc sóng 665 nm và 649 nm trên máy đo màu. Nồng độ diệp lục a, b đƣợc tính theo công thức sau:
Ca = 13,7.E – 5,76.E649(mg/l) Cb = 25,8.E649 - 7,6.E665(mg/l)
Ca+ b= 6,10.E665 + 20,04.E649 (mg/l)
Hàm lƣợng diệp lục a, b là hàm lƣợng diệp lục tính theo đơn vị mg/g lá cây.
Trong đó: A là hàm lƣợng diệp lục tính theo đơn vị mg/l C: Nồng độ diệp lục (mg/l)
V: Thể tích dịch rút đƣợc (ml) n: Số lần pha loãng
p: Khối lƣợng mẫu lá dung để rút dịch (gam)
Nguyên lý của phương pháp là: Các sắc tố xanh là yếu tố quan trọng trong quá
trình quang hợp của cây. Trong đó quan trọng nhất là nhóm diệp lục chlorophyll gồm: chlorophyll a và chlorophyll b. Trong vùng ánh sáng nhìn thấy ( λ = 400 – 700 nm), các phân tử hấp thụ mạnh nhất 2 vùng: Ánh sáng đỏ (λ = 662 nm) và ánh sáng tím (λ = 430 nm). Căn cứ vào sự hấp thụ các bƣớc sóng khác nhau của diệp lục trên máy đo màu mà ta có thể tính đƣợc hàm lƣợng của chúng.
Biểu 10: Hàm lƣợng diệp lục ở các vị trí
Ca(mg/l) Cb(mg/l) Ca+b(mg/l) DLa+b(mg/lá tƣơi) a/b
d. Từ các bảng điều tra tổng hợp đặc điểm sinh thái học của loài gồm:
+ Đặc điểm rừng nơi loài phân bố (kiểu rừng, tổ thành); đặc điểm tái sinh. Tính toán xác định công thức tổ thành rừng:
* Tổ thành tầng cây cao
Để xác định tổ thành tầng cây cao, tác giả sử dụng phƣơng pháp tính tỷ lệ tổ thành theo phƣơng pháp của Daniel Marmillod:
IVi =
Ni% + Gi% 2
Trong đó: IVi% là tỷ lệ tổ thành (chỉ số quan trọng: Important Value) của loài i
Ni% là % theo số cây của loài i trong quần xã thực vật rừng
Gi% là % theo tổng tiết diện ngang của loài i trong quần xã thực