3.4.1.1. Xác định môi trường dinh dưỡng tối ưu nuôi trồng thể quả nấm.
Kết quả đánh giá sinh trưởng của hệ sợi nấm sau 60 ngày nuôi cấy trên 7 công thức môi trường dinh dưỡng di ̣ch thể khác nhau được trình bày trong bảng 3.7 dưới đây:
Bảng 3.7: Xác định môi trường dinh dưỡng tối ưu nuôi trồng thể quả nấm
Isaria tenuipes Công thức Thờ i gian xuất hiện thể quả(ngày) Số lượng thể quả (thể quả/bình) Chiều dài thể quả (mm) Trọng lươ ̣ng thể quả (gam/10bình) Tươi Khô CT1 39 - 41 4 22 0,46 0,17 CT2 39 - 43 2 21 0,33 0,09 CT3 - - - - - CT4 35 - 36 10 16 3,50 0,42 CT5 32 - 34 33 50,9 40,3 3,15 CT6 37 - 42 1 12 0,22 0,03 CT7 30 - 34 17 40 15,34 2,18
Từ Bảng 3.7 cho thấy khi nuôi cấy hệ sợi nấm trên 7 công thức môi trường dinh dưỡng khác nhau thì sinh trưởng và phát triển của nấm cũng khác nhau rất rõ ràng. Sự khác nhau đó thể hiê ̣n rõ ở các chỉ tiêu như thời gian xuất hiện thể quả, chiều dài của thể quả và trọng lượng thể quả, trong đó 2 chỉ tiêu đươ ̣c xem là quan tro ̣ng nhất để đánh giá môi trường dinh dưỡng tốt nhất là số lươ ̣ng thể quả và trọng lượng khô của thể quả.
41
Trong 7 công thức môi trường thì công thức CT3 không cho thể quả, 6 công thức môi trường còn lại có xuất hiện thể quả tuy nhiên thời gian xuất hiện thể quả và số lượng thể quả lại khác nhau. Công thức CT5 cần 32 - 34 ngày đã xuất hiện thể quả còn công thức CT1, CT2 cần 39 - 41 ngày thể quả mới bắt đầu xuất hiện. Số lượng thể quả giữa các công thức có sự chênh lệch rất lớn. Công thức CT5 cho số lượng thể quả nhiều nhất với 33 thể quả trên bình, công thức CT7 cũng cho số lượng thể quả khá cao khoảng 17 thể quả/bình. Tiếp theo là công thức CT4 với 10 thể quả/bình. Các công thức còn lại như CT1, CT2, CT6 thì chỉ có từ 1 - 4 thể quả/bình (Hình 3.26 và Hình 3.27).
Nguồn: Tác giả
Ngoài ra, trọng lượng của thể quả của các công thức cũng khác nhau. Công thức CT5 đạt trọng lượng cao nhất với 40,31g/10 bình trọng lượng tươi tương đương với 3,15g/10 bình trọng lượng khô. Công thức CT6 có trọng lượng thấp nhất chỉ có 0,22g/10 bình trọng lượng tươi và 0,03g/10 bình khi sấy khô. Kết quả phân tích trên SPSS (phụ biểu 23 và phụ biểu 25) cũng cho kết quả tương tự.
42 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 CT6 CT7 T rọ ng lư ợn g tư ơi th ể qu ả
Công thức môi trường Pt = g/10bình 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 CT6 CT7 T rọ ng lư ợn g kh ô th ể qu ả
Công thức môi trường Pk = g/10bình
Sự khác nhau về trọng lượng thể quả thể hiện rõ qua Hình 3.28 và hình 3.29 dưới đây:
Hình 3.28: Trọng lượng tươi thể quả ở các môi trường dinh dưỡng khác nhau
43
Kết quả trên cho thấy: CT5 và CT7 là môi trường lỏng thích hợp để nuôi trồng thể quả nấm trong điều kiện nhân tạo.
3.4.1.2. Xác định nhiêt độ không khí tối ưu cho nuôi trồng thể quả
Theo kết quả phần 3.2.2. ở hai thang nhiệt độ là 30oC và 35oC nấm không có khả năng sinh trưởng và ở nhiệt độ 10oC nấm sinh trương và phát triển rất chậm. Vì vậy thí nghiệm chỉ thực hiện trên 3 thang nhiệt độ: 15oC, 20oC và 25oC. Kết quả sinh trưởng đươ ̣c đánh giá như trình bày trong Bảng 3.8.
Bảng 3.8: Kết quả xác định nhiệt độ không khí tối ưu cho nuôi trồng thể quả Môi trường Nhiệt độ không khí Thờ i gian xuất hiện thể quả Chiều dài tb thể quả (mm) Số lượng thể quả Trọng lượng (gam/10 bình) Pt Pk CT5 15oC 28 - 30 40,0 53 37,42 3,57 20oC 31 - 33 44,0 39 26,99 2,54 25oC 33 - 34 53,1 30 23,50 2,68 CT7 15oC 25 - 27 55,0 33 25,07 2,88 20oC 30 - 33 38,0 19 14,22 1,40 25oC 32 - 35 33,0 11 10,08 0,99
Bảng 3.8 cho thấy: Ở 3 thang nhiê ̣t đô ̣ này nấm đều xuất hiê ̣n thể quả và số lươ ̣ng trung bình thể quả trong mô ̣t bình tương đối cao, ở CT7 thể quả dao đô ̣ng từ 11 - 33 thể quả/bình còn CT5 có trung bình thể quả /bình còn lớn hơn từ 30 - 53 thể quả/bình. Nhưng mô ̣t điều hết sức chú ý là ở nhiê ̣t đô ̣ thấp 15oC củ a cả hai công thức môi trường CT5 và CT7 đều cho số lượng và trọng lượng thể quả cao, CT7 là 33 thể quả/bình. Đă ̣c biê ̣t, CT5 có trung bình thể quả lên tới 53 thể quả/bình. Nhiê ̣t đô ̣ 25oC số lượng thể quả ít nhưng thể quả
44
lại mâ ̣p hơn so với thể quả khi nuôi ở nhiê ̣t đô ̣ thấp 15oC, thể quả ở 15oC mảnh và thường phân nhánh nhiều hơn. Ở CT7 có ít thể quả hơn so với CT5 nhưng thể quả nấm to hơn, trên thể quả có nhiều bô ̣t bào tử hơn (Hình 3.30).
Hình 3.30: Thể quả nấm ở các thang nhiệt độ khác nhau
Nguồn: Tác giả
Trọng lượng thể quả của hai công thức môi trường ở các thang nhiệt độ này cũng có sự khác nhau rõ rệt. Theo bảng 3.8 ở trên thì trọng lượng thể quả của CT5 ở các thang nhiệt độ này vào khoảng 23,50 - 37,42g/10bình trọng lượng tươi tương đương với 2,54 - 3,57g/10bình trọng lượng khô. Môi trường CT7 có trọng lượng thấp hơn vào khoảng 10,08 - 25,07g/10 bình trọng lượng tươi tương đương với 0,99 - 2,88g/10bình trọng lượng khô thể quả.
Theo tiêu chuẩn Ducan (phụ biểu 37 và phụ biểu 39) ta thấy: ở 150C trọng lượng tươi và trọng lượng khô trung bình của hai công thức môi trường đạt cao nhất lần lượt là 31,2417g/10bình và 3,2267g/10bình. Còn ở 250C thì trọng lượng tươi và trọng lượng khô đạt thấp nhất là 16,7883g/10bình trọng lượng tươi và 1,8367g/10bình trọng lượng khô.
Sự khác nhau về trọng lượng tươi và khô của thể quả nấm được thể hiện trong các Hình 3.31 và hình 3.32 dưới đây:
25oC 20oC
45
Hình 3.31: Trọng lượng tươi thể quả ở các nhiệt độ không khí khác nhau
46
Kết quả trên cho thấy: nhiệt độ thích hợp nhất để nuôi trồng thể quả nấm Isaria tenuipes là 150C.
3.4.1.3 Xác định pH môi trường tối ưu nuôi trồng thể quả nấm.
Nấm Isaria tenuipes sau khi mọc kín bề mặt thì chuyển sang tủ 15oC có 12h chiếu sáng để nghiên cứu ảnh hưởng pH của môi trường đến nuôi trồng thể quả nhân tạo môi trường dinh dưỡng di ̣ch thể CT5 và CT7. Kết quả sinh trưởng được đánh giá như trình bày trong Bảng 3.9 sau:
Bảng 3.9: Kết quả xác định nhiệt độ không khí tối ưu cho nuôi trồng thể quả Môi trường pH môi trường Số lượng thể quả Chiều dài thể quả (mm)
Trọng lươ ̣ng thể quả (gam/10 bình) Pt Pk CT5 3 30 49.8 23.34 1.47 4 37 54.2 25.52 3.89 5 31 48.1 30.64 3.99 6 43 50.7 40.41 5.28 7 51 56.6 40.03 5.21 8 44 46.7 38.85 4.85 9 45 47.4 40.61 5.09 CT7 3 11 48.6 8.83 1.14 4 21 43.2 10.97 1.41 5 24 42.1 13.10 2.21 6 18 39.7 15.49 2.13 7 27 43.8 14.81 2.87 8 25 46.1 18.27 3.51 9 22 52.9 35.19 4.31
Nấm được cấy trên môi trường có 7 mức pH khác nhau là từ 3.0; 4.0… 9.0 đều có khả năng hình thành thể quả (Hình 3.33).
47
Ở CT5 thì số lươ ̣ng thể quả đạt từ 43 - 51 thể quả/bình đă ̣c biê ̣t ở môi trường pH = 7 thì số lượng thể quả đạt cao nhất là 51 thể quả/bình, còn ở môi trường pH = 3 đạt thấp nhất là 30 thể quả/bình. Còn ở CT7 thì pH = 7 cũng cho số lượng thể quả lớn nhất 27 thể quả/bình, pH = 3 cũng cho số lượng thể quả là thấp nhất (11 thể quả/bình).
Tiêu chuẩn Ducan (phụ biểu 43) cũng cho ta thấy: Ở cả hai môi trường CT5 và CT7 thì số lượng thể quả đạt lớn nhất ở môi trường có pH = 7 (trung bình là 38,83 thể quả/bình) và thấp nhất là môi trường có pH = 3 (trung bình đạt 20,5 thể quả/bình). Tiếp đó là các môi trường có pH = 8, 9, …
Hình 3.33: Thể quả nấm I. tenuipes trên các pH môi trường khác nhau
Nguồn: Tác giả
Xét về trọng lượng thì: Ở CT5 thì môi trường pH cho trọng lượng thể quả lớn là môi trường có pH = 6 với tro ̣ng lươ ̣ng tươi là 40,41 g/10bình trọng lượng tươi tương đương với 5,28 g/10bình khi sấy khô. Các môi trường pH còn la ̣i có trọng lượng thấp hơn, dao đô ̣ng trong khoảng từ 23,34 - 40,61 g/10bình trọng lượng tươi và 1,47 - 5,09 g/10bình.
Đối với chủng nấm cấy trên công thức CT7 thì môi trường pH cho trọng lượng thể quả lớn là môi trường pH = 9.0 với tro ̣ng lươ ̣ng tươi là 35,19g/10bình trọng lượng tuơi tương đương với 4,31g/10bình khi sấy khô.
48
Môi trường có pH = 3 là môi trường cho trọng lượng tươi cũng như trọng lượng khô là thấp nhất lần lượt là 8,83g/10bình và 1,14g/10bình.
Theo tiêu chuẩn Ducan (phụ biểu 47 và phụ biểu 49) thì trọng lượng tươi và trọng lượng khô đạt trung bình cao nhất của cả hai CT5 và CT7 là môi trường có độ pH = 9. Theo đó thì, trung bình trọng lượng tươi và khô được chia ra làm 07 nhóm, nhóm thấp nhất là môi trường pH = 3 có trung bình là 16,085g/10bình trọng lượng tươi tương đương 1,3067g/10bình trọng lượng khô, nhóm cao nhất là môi trường pH = 9 đạt trọng lượng tươi là 37,8967g/10bình tương đương 4,6983g/10bình.
Hình 3.34: Trọng lượng tươi thể quả ở các môi trường khác nhau
49
Hai hình 4.34 và hình 4.35 trên đây thể hiện rõ sự khác nhau về mặt trọng lượng thể quả giữa các môi trường có độ pH khác nhau.
Như vậy, môi trường có độ pH = 6 - 9 là môi trường thích hợp để nuôi trồng nấm đông trùng hạ thảo tuyết Isaria tenuipes. Với những môi trường có độ pH này thì nấm đạt trọng lượng tươi và khô là lớn hơn cả.
Thể quả ở hai môi trường CT5 và công thức CT7 được nuôi cấy ở trên đều có hình da ̣ng gần giống với thể quả ngoài tự nhiên. Nó cũng gồm có 2 phần: phần cuố ng có màu vàng nha ̣t và phần đỉnh sinh trưởng sinh bào tử đươ ̣c phủ mô ̣t lớp bô ̣t màu trắng và bông dễ ru ̣ng khỏi thể quả. Lấy bô ̣t bào tử soi trên kính hiển vi cho kết quả bào tử nấm giống với ngoài tự nhiên.
Như vâ ̣y kết quả bước đầu có thể thấy rằng chúng ta hoàn toàn có thể nuôi nhân ta ̣o nấm Isaria tenuipes trên môi trường dịch thể. Sản phẩm nấm sau khi nuôi trồ ng trên giá thể lỏng được thu hoạch và sấy khô có quạt gió ở nhiệt độ 35oC. Sau đó đóng gói và bảo quản ở nhiệt độ mát. Sản phẩm thu hoạch được thể hiện qua Hình 3.36 và 3.37 dưới đây:
50
3.4.2. Nghiên cứu nuôi trồng thể quả nấm Isaria tenuipes trên nhộng tằm - Sản xuất giống:
Giá thể gồm 150g gạo + 15g bột nhộng tằm + 80 - 100ml H2O. Hỗn hợp trên cho vào bình 500ml rồi đem hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C trong vòng 20 phút. Sau đó để nguội và cấy đĩa nấm I. tenuipes dày 5mm, nuôi nấm trong điều kiện nhiệt độ 250C trong vòng 30 ngày. Cứ 03 ngày lại lắc bình 01 lần, tránh chạm vào nút bình để tránh nhiễm khuẩn. Sau 30 ngày thì thu bào tử và trộn với 0.2ml dung dịch Tween 20 với nồng độ 0.02%.
- Nhiễm giống nấm vào nhộng tằm:
Pha bào tử ở trên với nước cất tới nồng độ 108 bào tử/ml. Sau đó cho dung dịch bào tử trên vào bình xịt, phun vào sâu tằm ở tuổi 5. Phun dung dịch bào tử trên vào sâu tằm 3 lần, mỗi lần cách nhau 12 giờ.
- Giai đoạn nuôi pha sợi:
Tiếp tục nuôi tằm cho tới khi tằm vào kén. Sau khi kén được 11 ngày thì dùng dao cắt đầu kén, lấy nhộng ra.
- Giai đoạn nuôi thể quả:
Đặt miếng vải bông ướt dưới đáy hộp nhựa trong suốt. Sau đó, đặt nhộng bị nhiễm nấm vào hộp nhựa đó, mỗi nhộng cách nhau 01cm. Sau đó, để các hộp nhựa ở phòng có nhiệt độ 20 - 220C và độ ẩm không khí là 95% trong điều kiện tối. Các hộp nhựa chứa nhộng nhiễm nấm phải được cung cấp nước định kỳ bằng cách nhỏ giọt để miếng vải tránh bị khô quá mức.
Theo dõi sinh trưởng của nấm và sự hình thành mầm thể quả cũng như thể quả, chỉ tiêu đánh giá là số lượng thể quả, hình dáng và màu sắc thể quả. Sau 11 - 12 ngày thì nấm bắt đầu mọc thể quả. Sau 50 - 55 ngày thì nấm bắt đầu cho thu hoạch. Kết quả thí nghiệm nuôi trồng thể quả nấm Đông trùng hạ thuyết trên nhộng tằm được trình bày ở bảng 3.10 dưới đây:
51
Bảng 3.10: Kết quả nghiên cứu khả năng hình thành thể quả của nấm
Isaria tenuipes trên giá thể nhộng tằm
STT Số lượng thể quả (Thể quả/ nhộng) Trọng lượng tươi (gam/nhộng) Trọng lượng khô (gam/nhộng) 1 47 0,924 0,300 2 55 1,156 0,315 3 37 0,795 0,282 4 50 0,953 0,302 5 41 0,825 0,289 6 37 0,786 0,278 7 37 0,792 0,280 8 35 0,763 0,270 9 48 0,928 0,285 10 51 0,975 0,306 11 54 1,125 0,311 12 52 0,998 0,307 13 54 1,129 0,312 14 44 0,895 0,299 15 50 0,956 0,302 16 27 0,688 0,257 17 40 0,809 0,286 18 50 0,966 0,305 19 43 0,891 0,299 20 36 0,782 0,275 21 51 0,968 0,305 22 42 0,849 0,291
52 23 38 0,796 0,283 24 43 0,897 0,299 25 48 0,935 0,301 26 53 1,095 0,310 27 34 0,754 0,268 28 42 0,835 0,290 29 45 0,920 0,300 30 36 0,789 0,278 TB 44 0,899 0,293
Quan sát lúc nấm bắt đầu mọc thấy: khi nấm bắt đầu mọc thể quả thì mọc từng cụm thể quả. Sau đó mọc nhiều thể quả hơn, số lượng thể quả trên nhộng cũng khác nhau, có khoảng 27 - 55 thể quả/nhộng . Thể quả nấm phân nhánh nhiều trông rất giống rạn san hô. Càng về già nấm càng phân nhánh nhiều hơn lúc nấm còn non. Những nhộng có nấm mọc mà có số lượng thể quả ít và phân nhánh ít thì thể quả mập hơn.
Khi tiến hành đo đếm trọng lượng 30 con tằm nhiễm nấm mọc thể quả thì thấy: Trọng lượng của nấm cũng rất khác nhau trên từng nhộng. Nhộng nào có nhiều thể quả và thể quả phân nhánh càng nhiều thì nhộng đó có trọng lượng tươi và trọng lượng khô lớn và ngược lại. Theo bảng 3.10 thì ta có thể thấy: số lượng thể quả trung bình trên một nhộng là 44 thể quả/nhộng. Kết quả này cho thấy số lượng thể quả trên một nhộng là tương đối nhiều. Trọng lượng tươi trung bình trên một nhộng là 0,899 g/nhộng tương đương với 0,293g/nhộng trọng lượng khô.
Thể quả nấm có màu vàng chanh, bao xung quanh nhộng và phần cuống thể quả là sợi nấm màu trắng. Chiều dài của thể quả nấm khoảng 7 - 45 mm. Thể quả nấm gồm có hai phần: Cuống nấm và tế bào sinh bào tử vô tính.
53
Trên đỉnh sinh bào tử vô tính này phân thành nhiều nhánh và chứa bào tử màu trắng, những bào tử này giống như những hạt bụi, rất dễ rơi rụng và khô (Hình 3.38, Hình 3.39, Hình 3.40 và Hình 3.41).
Ta có thể kết luận rằng: Chúng ta có thể nuôi trồng thể quả nấm Isaria tenuipes trong điều kiện nhân tạo.
Hình 3.38. Thể quả nấm sau 20 ngày Hình 3.39. Thể quả nấm sau 30 ngày