- Những số liệu về điều kiện tự nhiên, dân sinh, kinh tế xã hội của khu vực nghiên cứu.
- Kế thừa các tài liệu về đặc điểm sinh vật học sinh thái học, vật hậu, đặc điểm hình thái….của một số tác giả đã nghiên cứu trƣớc đó về loài Quế.
Những tài liệu kế thừa đảm bảo chính thống và đáp ứng độ tin cậy.
2.4.1.2. Phương pháp điều tra ngoại nghiệp
Thu thập bổ sung số liệu nghiên cứu về đặc điểm hình thái Quế
Để tìm hiểu về hình thái loài Quế đề tài tiến hành phƣơng pháp quan sát thực địa, chụp ảnh, phỏng vấn ngƣời dân khu vực trồng Quế đồng thời kết hợp với việc tra cứu những tài liệu đã nghiên cứu trƣớc đây.
Đề tài lựa chọn ngẫu nhiên 15 cây trong lâm phần Quế để tiến hành quan sát, mô tả. Cụ thể nhƣ sau:
- Thân cành: Mô tả hình dạng, màu sắc, vỏ, kiểu phân cành và mức độ phát triển.
- Lá, hoa, quả: Mô tả hình dạng, kích thƣớc, màu sắc,... Kết quả ghi vào phiếu mô tả đặc điểm hình thái loài Quế:
Bảng 2.1: Phiếu mô tả đặc điểm hình thái của loài Quế
Ký hiệu cây: ………
Năm trồng: ……… Thời điểm quan sát: ………
Địa điểm: ………
Thân, cành
(Hình dạng, đƣờng kính, chiều
cao, màu săc..)
Lá (Kích thƣớc cách mọc, màu sắc…) Vỏ (Màu sắc, độ dày…) Hoa (Có hay không, màu sắc…) Quả (Có hay không, màu sắc, kích thƣớc…)
Thu thập số liệu nghiên cứu về tầng cây cao
Trên khu vực nghiên cứu tiến hành thiết lập 18 ô tiêu chuẩn điển hình tạm thời, mỗi ô tiêu chuẩn có diện tích 500 m2 (20 x 25 m), mỗi tuổi lập 6 ô
tiêu chuẩn tại các vị trí chân, sƣờn, đỉnh. OTC điển hình đƣợc lập bằng địa bàn cầm tay và thƣớc dây với sai số khép kín là 1/200 và đo đếm toàn bộ những cây trong OTC có đƣờng kính (D1.3) 6cm về các chỉ tiêu: D1.3, Hvn, Hdc, Dt.
D1.3 đƣợc đo bằng thƣớc dây đo đƣờng kính có khắc vạch tới mm. Đo Hvn và Hdc bằng thƣớc Blumenleiss ở các cây làm chuẩn rồi sau đó mục trắc các cây xung quanh, xác định chiều cao tới dm. Đo Dt bằng thƣớc dây.
Xác định tuổi rừng ở từng OTC bằng cách phỏng vấn các chủ rừng. Kết quả đo đƣợc thống kê vào biểu điều tra tầng cây cao
Bảng 2.2: Biểu điều tra tầng cây cao
OTC số:... Diện tích OTC:... Loại rừng:... Địa điểm:... Độ dốc:... Vị trí:... Ngày điều tra:... Ngƣời điều tra:... Năm trồng:...
STT D1.3(cm) Hvn(m) Hdc(m) Dt(m) Phẩm chất (T,X,TB) Ghi chú ĐT NB TB ĐT NB TB
Thu thập số liệu nghiên cứu về Quế tái sinh
Trong mỗi ô tiêu chuẩn điển hình tạm thời bố trí 5 ô dạng bản, mỗi ô có diện tích 20 m2 (54 m) 4 ô ở bốn góc và một ô ở tâm OTC 500m2. Trên mỗi ô dạng bản tiến hành đo chiều cao, chất lƣợng của cây tái sinh. Cây tái sinh đƣợc chia thành 3 cấp chiều cao: 0-50 cm, 50-100 cm, 100 - 200 cm, > 200 cm và những cây có H>100 cm đƣợc coi là những cây có triển vọng.
Bảng 2.3: Biểu điều tra cây tái sinh
OTC số:... Diện tích OTC:... Loại rừng:... Địa điểm:... Độ dốc:... Vị trí:... Ngày điều tra:... Ngƣời điều tra:... Năm trồng:... TT ODB Tên cây Chất lƣợng Phẩm chất Nguồn gốc <0.5 0.5-1 1-2 >2 Tốt TB Xấu Hạt Chồi
2.4.1.3. Phương pháp điều tra nội nghiệp/phương pháp phân tích và xử lý số liệu Nghiên cứu về đặc điểm hình thái, sinh thái và vật hậu
Sau khi thu thập số liệu ngoài thực địa của 15 cây Quế và các tài liệu đã nghiên cứu trƣớc đề tài tiến hành tổng hợp, phân tích để đƣa ra kết quả mô tả đặc điểm chung về hình thái, sinh thái và vật hậu của cây Quế thanh.
Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc tầng cây cao
Việc mô hình hoá quy luật cấu trúc tần số trong thực tiễn và nghiên cứu Nông - Lâm nghiệp có ý nghĩa rất lớn, một mặt nó cho biết các quy luật phân bố vốn tồn tại khách quan trong tổng thể, mặt khác các quy luật phân bố này có thể biểu thị một cách gần đúng bằng các biểu thức toán học cho phép xác định tần số tƣơng ứng với mỗi tổ của đại lƣợng điều tra nào đó. Ngoài ra việc nghiên cứu các quy luật phân bố còn tạo tiền đề để đề xuất các biện pháp kỹ thuật lâm sinh hợp lý.
a, Quy luật phân bố số cây theo đường kính và theo chiều cao (N/D1.3, N/Hvn): Căn cứ vào phân bố thực nghiệm, tiến hành mô hình hoá quy luật cấu trúc tần số theo những phân bố lý thuyết khác nhau.
- Phân bố giảm (Meyer)
Trong Lâm nghiệp thƣờng dùng phân bố giảm dạng hàm Meyer để mô phỏng quy luật cấu trúc tần số số cây theo đƣờng kính (N/D1.3), số cây theo chiều cao (N/Hvn) ở những lâm phần hỗn giao, khác tuổi qua khai thác chọn không quy tắc nhiều lần. Hàm Meyer có dạng:
Trong đó: ft là tần số quan sát, x là cỡ kính hoặc cỡ chiều cao
, là hai tham số của hàm Meyer
Để xác định tham số của phân bố giảm dạng hàm Meyer, trƣớc hết phải tuyến tính hoá phƣơng trình m , bằng cách logarit hoá cả hai vế của phƣơng trình để đƣa về dạng phƣơng trình hồi quy tuyến tính một lớp có dạng y = a + bx.
- Phân bố Weibull: Là phân bố xác suất của biến ngẫu nhiên liên tục với miền giá trị (0,+ ), hàm mật độ có dạng: α λ.x 1 α e α.λ.x f(x) (2.2)
Trong đó: và là hai tham số của phân bố Weibull. Tham số đặc trƣng cho độ nhọn phân bố, tham số biểu thị độ lệch của phân bố.
Nếu = 1 phân bố có dạng giảm
= 3 phân bố có dạng đối xứng
> 3 phân bố có dạng lệch phải
< 3 phân bố có dạng lệch trái
Tham số đƣợc ƣớc lƣợng theo phƣơng pháp tối đa hợp lý bằng công thức:
n 1 i α fi.xi n (2.3)
- Phân bố khoảng cách: Là phân bố xác suất của biến ngẫu nhiên đứt quãng, hàm toán học có dạng: F (x) = 1 ). 1 )( 1 ( x 1 0 x x (2.4) Trong đó: =f0/n
với f0 là tần số quan sát tuyệt đối ứng với tổ đầu tiên. n là dung lƣợng mẫu
X = (xi – x1)/k với k là cự ly tổ, xi là trị số giữa cỡ đƣờng kính (chiều cao) thứ i, x1 là trị số giữa cỡ đƣờng kính (chiều cao) tổ thứ nhất. Nhƣ vậy X lấy các giá trị 0, là những số tròn.
* Kiểm tra giả thuyết về luật phân bố:
Cho giả thuyết H0: Fx(x) = F0(x), trong đó F0(x) là một hàm phân bố hoàn toàn xác định. Để kiểm tra giả thuyết H0, ngƣời ta dùng tiêu chuẩn phù hợp khi bình phƣơng của Pearson:
flt flt) (ft χ 2 2 (2.5) Trong đó: ft là trị số thực nghiệm flt là trị số lý thuyết
Nếu 2 tính 052 tra bảng với bậc tự do k = m - r - 1 (r là tham số của phân bố lý thuyết cần ƣớc lƣợng, m là số tổ sau khi gộp) thì phân bố lý thuyết phù hợp với phân bố thực nghiệm (Ho+).
Nếu 2 tính 052 tra bảng với bậc tự do k = m - r -1 thì phân bố lý thuyết không phù hợp với phân bố thực nghiệm (Ho-).
b, Nghiên cứu tương quan Hvn/D1.3 và Dt/D1.3
* Quy luật tƣơng quan giữa Hvn/D1.3
Tƣơng quan giữa Hvn/D1.3 đã đƣợc nhiều tác giả nghiên cứu và mô phỏng bằng các dạng phƣơng trình toán học khác nhau nhƣ hàm logarit, hàm parabol, hàm m … Hầu hết các nhà khoa học nhƣ: Đồng Sỹ Hiền (1974), V Đình Phƣơng (1985), V Nhâm (1988)…đều cho rằng dạng phƣơng trình: Hvn=a+b*logD1.3 tỏ ra thích hợp để mô phỏng quy luật này vì có hệ số tƣơng quan chặt, độ chính xác cao và thuận tiện về mặt tính toán. Vì vậy, trong đề tài này mối tƣơng quan giữa Hvn/D1.3 đƣợc mô phỏng bằng phƣơng trình:
Hvn=a+b*logD1.3 (2.6)
* Quy luật tƣơng quan giữa Dt/D1.3
Đƣờng kính tán cây (Dt) là bộ phận quyết định đến sinh trƣởng, tăng trƣởng cây rừng. Nó c ng là chỉ tiêu quan trọng để xác định không gian dinh dƣỡng của từng cây cá biệt. Từ kết quả xác định không gian dinh dƣỡng có thể xác định hệ số khép tán cho từng loài, từng giai đoạn tuổi của lâm phần.
Quan hệ Dt/D1.3 đã đƣợc nhiều tác giả trong và ngoài nƣớc nghiên cứu, nhìn chung các kết quả đều chỉ ra rằng dạng hàm tuyến tính 1 lớp mô phỏng tốt mối quan hệ này:
Dt = a+b*D1.3 (2.7)
* Kiểm tra sự tồn tại của hệ số tƣơng quan r: Việc kiểm tra sự tồn tại của hệ số tƣơng quan là để khẳng định các phƣơng trình thử nghiệm có thực sự tồn tại trong tổng thể rừng hay không. Sau khi kiểm tra, tiến hành loại ra những phƣơng trình có hệ số tƣơng quan không tồn tại.
Để kiểm tra sự tồn tại của phƣơng trình, tác giả dùng trắc nghiệm T (trắc nghiệm Student) với k = n – 2 bậc tự do ở mức ý nghĩa α = 0.05 và α = 0.01 với giá trị Ttính theo công thức: 2 * 1 2 n r r Ttính (2.8)
Trong đó: r: hệ số tƣơng quan n: dung lƣợng mẫu
Nếu: Ttính > Tbảng => hệ số tƣơng quan là đáng tin cậy
Ttính < Tbảng => hệ số tƣơng quan là không đáng tin cậy
* Kiểm tra mức ý nghĩa của phƣơng trình hồi quy bằng trắc nghiệm F qua việc so sánh trị số Ftính = MShồi quy/MSsai số và trị số Fbảng với hai bậc tự do df1 = 1 và df2 = n – 2. Nếu Ftính > Fbảng thì giả thuyết H0 bị bác bỏ; ngƣợc lại, nếu Ftính < Fbảng thì giả thuyết H0 đƣợc chấp nhận, hàm hồi quy không tồn tại.
Tính toán dựa trên phần mềm Excel và SPPS
Nghiên cứu đặc điểm Quế tái sinh
a. Mật độ Quế tái sinh
Là chỉ tiêu biểu thị số lƣợng cây tái sinh trên một đơn vị diện tích, đƣợc xác định theo công thức sau:
S n 10.000
N/ha
với S là tổng diện tích các ODB điều tra tái sinh (m2) và n là số lƣợng cây tái sinh điều tra đƣợc.
b. Chất lƣợng Quế tái sinh
Nghiên cứu tái sinh theo cấp chất lƣợng tốt, trung bình và xấu đồng thời xác định tỷ lệ cây tái sinh có triển vọng.
Tính tỷ lệ % cây tái sinh tốt, trung bình, xấu theo công thức:
100 N n
N%
Trong đó: N%: tỷ lệ phần trăm cây tốt, trung bình, xấu n: tổng số cây tốt, trung bình, xấu
N: tổng số cây tái sinh c. Phân bố Quế tái sinh theo cấp chiều cao
Thống kê số lƣợng cây tái sinh theo 5 cấp chiều cao: Cấp I: Chiều cao < 0.5m
Cấp II: Chiều cao từ 0.5-1 m Cấp III: Chiều cao từ 1-2m Cấp IV: Chiều cao từ >2m
d. Phân bố Quế tái sinh theo mặt phẳng ngang
Phân bố cây tái sinh trên mặt đất đƣợc xác định trên cơ sở phân bố Poison. Các bƣớc tiến hành nhƣ sau:
+ Xác định số cây trung bình ODB: Xtb = Trong đó:
N là tổng số cây trong OTC a là số ODB trong OTC
+ Xác định về phƣơng sai về số cây giữa các ODB theo công thức:
∑( )
Trong đó: Xi là số lƣợng cá thể của ODB thứ i là phƣơng sai số cây giữa các ODB
a N
Sx
+ Xác định tỷ số: K =
K< 1 phân bố cây tái sinh trên mặt đất là phân bố đều K = 1 phân bố tái sinh trên mặt đất là phân bố ngẫu nhiên K > 1 phân bố tái sinh trên mặt đất là phân bố cụm
2.4.2. Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền Quế
2.4.2.1. Thu thập vật liệu để phân tích, đánh giá đa dạng di truyền
Vật liệu đƣợc sử dụng trong nghiên cứu là 32 mẫu bao gồm các mẫu giống Quế đƣợc thu thập ở huyện Thƣờng Xuân - Thanh Hóa, và một số mẫu để kiểm tra sự khác biệt đƣợc thu thập từ một số huyện khác trong tỉnh Thanh Hóa, Nghệ An và Yên Bái.
Mẫu đƣợc lấy là những lá Quế ngẫu nhiên trong lâm phần Quế bao gồm cả lá cây trội dự tuyển và không phải cây trội dự tuyển, sau đó đƣợc nghiền nhỏ.
Kết quả ghi vào biểu số liệu:
Bảng 2.4: Danh sách 32 mẫu giống Quế nghiên cứu
STT Ký
hiệu Ghi chú Xã Huyện Tỉnh
2.4.2.2. Hóa chất
Một số hóa chất thông dụng dùng trong sinh học phân tử của các hãng Sigma, Merck,...CTAB, Tris base, Boric acid, NaCl, dNTPs, EDTA, 6X orange loading dye solution, Taq Polymeraza, Ethanol, 2-propanol, Acetic acid glacial, Phenol, Chloroform, isoamyalcohol, Ribonuclease A, Agarose, các mồi RAPD. (cụ thể tại phụ biểu)
2.4.2.3. Phương pháp thực hiện
Phƣơng pháp này tham gia thực hiện cùng đề tài “Khai thác và phát triển nguồn gen giống Quế thanh hóa (Cinnamomum cassia BL) có năng suất và chất lượng tinh dầu cao” tại phòng thí nghiệm của Viện Di truyền Nông Nghiệp.
a.Tách chiết ADN tổng số
tb x
X S2
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng phƣơng pháp tách CTAB có cải tiến của của Asif and Cannon (2005) để tiến hành tách chiết ADN từ các mẫu nghiên cứu [5], [21].
Quy trình:
Chuẩn bị sẵn dung dịch đệm chiết CTAB ở 60C (100mM Tris HCl, pH 8.0; 20 mM EDTA, pH 8.0; 3M NaCl; 2% CTAB; 1% PVP).
Cân 0,3 gam mẫu lá quế đã làm khô và nghiền trong nitơ lỏng đến khi thành dạng bột mịn (mẫu quế, chày, cối đƣợc giữ trƣớc ở - 80C).
Hoà tan mẫu đã nghiền nhỏ trong 800l CTAB buffer và 60l SDS 10%. Ủ mẫu ở 65C trong bể ổn nhiệt, thời gian 60 phút.
Bổ sung chloroform: isoamyl alcohol (24: 1), lắc nhẹ cho tới khi thành dạng nh sữa. Ly tâm 11000 vòng/phút trong 15 phút ở nhiệt độ 4C.
Hút dung dịch phía trên chuyển sang ống mới và bổ sung 1/3 thể tích 3M sodium acetate (pH 5,2) và 2/3 thể tích chloroform: isoamyl alcohol (24: 1). Ly tâm 11000 vòng/phút trong 15 phút thu đƣợc dịch chiết chứa ADN.
Tủa ADN bằng isopropanol đã làm lạnh. Để ở -20C trong 1 giờ. Ly tâm thu tủa 11000 vòng/phút trong 20 phút ở 4C.
Rửa tủa bằng ethanol 70%, ly tâm thu tủa, làm khô và hoà tan trong đệm TE. b. Chƣơng trình chạy PCR
Thành phần của một phản ứng PCR
Mỗi phản ứng PCR bao gồm các thành phần đƣợc trình bày ở bảng 2.5
Bảng 2.5: Thành phần phản ứng PCR-RAPD
STT Thành phần Thể tích (µl)
1 Nƣớc cất hai lần khử ion 9,9
2 Buffer Mg+ 25Mm 1,5
3 dNTPs 10Mm 0,3
4 Taq ADN polymerase 5U/µl 0,8
5 Mồi 10µM 1,5
6 ADN 1
Chương trình chạy PCR
Phản ứng PCR đƣợc tiến hành trong ống eppendorf 0,2 ml và thực hiện trên máy Mastercycler epgradient S theo chu trình sau (Bảng 2.6).
Bảng 2.6: Chu trình chạy PCR-RAPD
Các bƣớc Nhiệt độ(C) Thời gian
1 94 5 phút 2 94 1 phút 3 32-36 1 phút 10 giây 4 72 1 phút 55 giây 5 Lặp lại từ bƣớc 2, 35 lần 6 72 7 phút 7 4 ∞
Sau khi hoàn thành chƣơng trình chạy PCR, sản phẩm PCR đƣợc bổ sung 4 µl ADN Sequencing Stop Solution (Bao gồm: 10 mM NaOH + 95% formamide + 0,05% Bromophenol + 0,05% Xylene cyanol).
c. Phƣơng pháp điện di trên gel agarose
Cân 0,4g agarose cho vào 40 ml TAE 1X, đun đến sôi để agarose tan hoàn toàn. Để nguội 45-50C bổ sung 2,5l Ethidium Bromide, đổ vào khuôn gel đã đƣợc chuẩn bị sẵn. Sau 30-60 phút, khi gel đã nguội và đông cứng thì chuyển khay chứa bản gel vào máy điện di và cho đệm chạy TAE 1X vào buồng điện di sao cho đệm ngập bản gel khoảng 0,5-1 cm.
Tra mẫu: Sản phẩm PCR đƣợc trộn với 4l loading dye và tra vào các giếng trên gel.
Chạy điện di: Sau khi tra mẫu điện di xong, máy điện di đƣợc kết nối với bộ nguồn. Đặt 130V.
Quan sát: gel đƣợc soi dƣới đèn tử ngoại, ADN sẽ đƣợc phát sáng nhờ liên kết với EtBr.
Các số liệu thu thập đƣợc xử lý theo phƣơng pháp thống kê sinh học trên nền Excel
Các băng ADN đƣợc ghi nhận dựa trên sự có mặt hay vắng mặt của chúng ở