Nhóm phương pháp tạo dòng gen

2.3.1.1. Thiết kế mồi colony- PCR

Dựa trên trình tự gen đăng kí trên Ngân hàng gen quốc tế NCBI mã số AB073908. Chúng tôi sử dụng phẩn mềm DNAstar thiết kế cặp mồi đặc trưng cho phản ứng colony- PCR để tạo dòng tế bào vi khuẩn tái tổ hợp mang vector pUC19_1113bp. Thông tin về cặp mồi được trình bày trong bảng 2.1.

Bảng 2.1. Cặp mồi đặc trưng của phản ứng colony- PCR

TT Tên mồi Trình tự (5' - 3') Nhiệt độ bắt cặp Kích thước gen dự kiến 1 Fw TCTAGAATGGATACTCCGAACAC 58oC 1113bp 2 Rv GAGCTCTCAGAGTTCGTCTT

2.3.1.2. Tạo vector pUC19_1113bp tái tổ hợp

Vecor pUC19 được cắt mở vòng bằng enzyme SmaI. Sản phẩm cắt được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% và tinh sạch bằng kit Jena Bioscience.

Phản ứng ghép nối gen mục tiêu CoOMT vào vector pUC19 có thành phần được trình bày ở bảng 2.2. Hỗn hợp phản ứng được trộn đều, sau đó ly tâm nhanh để bảo đảm tất cả thành phần nằm dưới đáy của tube PCR. Phản ứng được ủ ở 37oC trong 15 phút, sau đó đặt lên nước đá để chuẩn bị biến nạp.

Bảng 2.2. Thành phần phản ứng nối ghép gen Thành phần Thể tích (µl) Mạch thẳng vector (100ng) 1 DNA (300 ng/µl) 5 Dung dịch đệm eClone 1,5 Enzyme eClone 1 Nước khử ion 6,5 Tổng thể tích 15

2.3.1.3. Tạo dòng vi khuẩn tái tổ hợp mang vector pUC19_1113bp

Hỗn hợp phản ứng ligation được bổ sung vào 100µl tế bào khả biến trong tube 1.5 ml và ủ trên nước đá khoảng 30 phút. Sau đó, hỗn hợp được sốc nhiệt ở 42oC trong 60-90 giây. Tube phản ứng tiếp tục được đặt trong đá 5 phút, sau đó được thêm 1 ml môi trường giàu dinh dưỡng (SOC) và nuôi lắc ở 37oC trong 60 phút. Tiến hành ly tâm thu tế bào vi khuẩn, đổ bỏ dung dịch nổi và trải 100 µl lên đĩa môi trường thạch có chứa kháng sinh chọn lọc ampicillin (100µg/ml).

Sau 16 - 18 giờ nuôi khuẩn trên đĩa môi trường thạch, các khuẩn được chọn lọc dựa trên kiểu hình được sử dụng cho phản ứng colony- PCR. Thành phần của phản ứng được trình bày ở bảng 2.3.

Các dòng tế bào dương tính với phản ứng colony- PCR được nuôi trong môi trường LB lỏng thu sinh khối để tách chiết và tinh sạch plasmid (trong 16 giờ, ở 37oC).

Bảng 2.3. Thành phần phản ứng colony-PCR STT Thành phần Thể tích (l) 1 2 3 4 5 Nước deion, khử trùng PCR Master mix 2X Primer forward (10 pmol): Fw

Primer reverse (10 pmol): Rv Tế bào vi khuẩn 6,5 7,5 0,5 0,5 Tổng thể tích của phản ứng 15

2.3.1.4. Tách chiết và tinh sạch plasmid

Sau khi kiểm tra sản phẩm tách dòng tiến hành tách plasmid bằng dung dịch sol I, sol II, sol II (Bảng 2.4). Các bước được tiến hành như sau:

Bước 1: Chuyển 2ml dịch nuôi sang ống eppendorf. Ly tâm 6000 v/p ở 4oC trong 5 phút. Loại bỏ dịch môi trường để thu nhận cặn tế bào.

Bước 2: Làm tan cặn tế bào trong 100l dung dịch Sol I (giữ trong đá),

Bước 3: Bổ sung 200l dung dịch Sol II vào mỗi eppendorf. Đậy nắp chặt, đảo ngược eppendorf vài lần và giữ trên đá trong 1 phút

Bước 4: Bổ sung 150l dung dịch Sol III. Đậy nắp chặt, đảo ngược eppendorf vài lần và giữ trong đá trong 3-5 phút.

Bước 5: Ly tâm 12000 v/p trong 10 phút ở 4oC và hút chuyển dịch phía trên sang ống mới. Bổ sung hỗn hợp chloroform: isoamin (24:1) theo tỉ lệ 1:1, đảo đều mẫu sau đó để ở nhiệt độ phòng 15 phút.

Bước 6: Ly tâm 12000 v/p trong 10 phút ở 4oC và hút dịch phía trên chuyển sang ống mới.

Bước 7: Tủa plasmid bằng cách bổ sung 1 lần thể tích isopropanol lạnh và giữ ở -20oC trong 30 phút.

Bước 8: Thu tủa bằng cách ly tâm 12000 v/p trong 10 phút ở 4oC. Rửa sạch mẫu bằng cách bổ sung 0,5ml ethanol 70độ. Ly tâm thu tủa 12000v/p

trong 10 phút ở 4oC (lặp lại 2 lần).

Bước 10: Làm khô tủa bằng máy SpeedVac trong 2 phút hoặc để mở nắp trong 15 phút ở nhiệt độ phòng trong box bật quạt.

Bước 11: Hoà tan tủa plasmid trong 50l H2O khử vô trùng chứa 20g/ml RNase. Mẫu được lưu giữ ở -20 oC.

Bước 12: Kiểm tra DNA plasmid bằng điện di trên gel agarose 1,0 %.

Bảng 2.4. Thành phần dung dịch tách plasmid Dung dịch Hóa chất Nồng độ Thể tích Dung dịch I (Sol I) (khử trùng, giữ 4oC) Tris- HCl, 1M, pH 8,0 25 mM 2,5 ml EDTA, 0,5M, pH 8,0 10 mM 2 ml Glucose 50 mM 0,9 g Dung dịch II (Sol II)

(Pha mới trước khi sử dụng)

NaOH, 2N 0,2 N 10 ml

SDS, 10% 1% 10 ml

Dung dịch III (Sol III) (giữ 4oC)

CH3COOK, pH 5,5 5,0 M 60 ml CH3COOH 11,5% 11,5 ml

H2O 28,5 ml

(Tổng thể tích mỗi loại Sol, V= 100 ml)

Sử dụng kit tinh sạch plasmid của Jena Biociense để tinh sạch các dòng tế bào dương tính với clony- PCR trước khi tiến hành giải trình tự.

2.3.2. Nhóm phương pháp thiết kế vector biểu hiện mang gen đích

2.3.2.1. Xử lý enzyme cắt giới hạn

Vector pUC-1113 và vector pBI121 được xử lý bằng enzyme XbaI và

SacI. Thành phần phản ứng cắt được thực hiện theo sự hướng dẫn của hãng sản xuất bộ kit sử dụng enzyme.

Phản ứng được ủ trong 2 giờ ở 37oC. Sản phẩm cắt sau đó được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% dưới điều kiện 120V, 40 phút.

Bảng 2.5. Thành phần của phản ứng cắt enzyme giới hạn Thành phần Thể tích (µl) Nước deion, khử trùng 14 Buffer Tango 10X 4 DNA (50 ng/µl) 20 XbaI (5U/ µl) 1 SacI (10 U/ µl) 1 Tổng thể tích của phản ứng 40

2.3.2.2. Thôi gel và tinh sạch sản phẩm PCR

Mảnh gel chứa đoạn gen có kích thước 1113 bp và vector pBI121 được thu nhận vào ống 2 ml. Bổ sung dung dịch đệm gắn (binding buffer) vào gel theo tỷ lệ: Vmẫu : Vđệm = 1 : 1, trộn đều và chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột, ly tâm 13000 v/p trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột. Bổ sung 500l dung dịch đệm rửa (washing buffer), ly tâm 13000 v/p trong 1 phút, đổ dịch chảy qua cột, ly tâm bổ sung 1 phút để loại bỏ hết dung dịch đệm rửa. Hoà tan DNA trong 30 – 50l nước cất hoặc dung dịch EB, đã được làm ấm đến 50oC, để ở nhiệt độ phòng 1 phút, sau đó ly tâm 13000 v/p trong 1 phút.

2.3.2.3. Gắn đoạn gen CoOMT 1113 bp vào vector pBI121

Sản phẩm thôi gel sau khi tinh sạch được gắn vào vector tách dòng pBI121. Thành phần phản ứng nối ghép như sau:

Bảng 2.6. Thành phần phản ứng nối ghép gen STT Thành phần Thể tích (l) 1 2 3 4 5 Dung dịch đệm (10x) T4 ligase DNA (20 ng/ µl) pBI121 plasmid (20 ng/ µl) H2O 1 1 6 1 1 Tổng thể tích 10

Hỗn hợp được ủ ở 22oC trong 60 phút và sau đó được biến nạp vào tế bào khả biến E.coliDH5α.

2.3.2.4. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E. coli bằng phương pháp sốc nhiệt

+ Chuẩn bị tế bào khả biến:

Tế bào E.coli DH5α được cấy ria trên môi trường LB đặc và nuôi qua đêm ở 37oC. Chọn một khuẩn lạc nuôi cấy trong 5ml LB lỏng, lắc 200 v/p, ở 37oC, qua đêm. Hút 1% dịch khuẩn ở trên cho vào 50ml LB lỏng, lắc 200 v/p, ở 37oC, trong 2-3 giờ, đo OD600nm đạt 0,4 - 0,6 thì chuyển dịch nuôi cấy sang ống ly tâm, để 15 phút ở trong đá (hoặc ở 4oC). Ly tâm 4000 v/p, ở 4oC, trong 5 phút. Thu cặn và hoà tan trong 30ml CaCl2 0,1 M, để trong đá 15 phút, sau đó ly tâm 4000 v/p, ở 4oC, trong 5 phút (lặp lại ba lần, để trong đá lần thứ hai 30 phút, lần thứ ba 60 phút). Đổ dịch CaCl2, hòa tan trong 1ml CaCl2/100ml LB ban đầu. Bổ sung 15- 20% glycerol. Chia 50 l dịch tế bào khả biến vào mỗi ống eppendorf 1,5 ml. Bảo quản tế bào khả biến trong tủ lạnh -84oC.

+ Biến nạp:

Tế bào khả biến được lấy ra từ tủ -84oC và được làm tan trên đá. Bổ sung 5l vector đã gắn gen vào ống đựng tế bào khả biến và trộn nhẹ. Hỗn hợp được đặt trong đá 10-15 phút, rồi được chuyển sang bể ổn nhiệt có nhiệt độ 42oC trong 1 phút 30 giây. Sau đó mẫu được lấy ra và đặt ngay lên đá lạnh trong 5 phút. Bổ sung 500 l môi trường LB lỏng, hỗn hợp được nuôi ở 37oC, lắc 200 v/p trong 1 giờ. Sử dụng que cấy trải, trải 100- 200 l dịch khuẩn lên đĩa môi trường LB đặc có chứa 50mg/l carbenicillin, 100 µM IPTG, 40 mg/l X-gal. Ủ đĩa ở 37oC qua đêm.

2.3.2.5. Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR)

Các mẫu khuẩn tái tổ hợp sau biến nạp mọc trên môi trường LB đặc được chọn lọc để thực hiện phản ứng colony- PCR. Thành phần của phản ứng colony- PCR được trình bày trong bảng 2.3.

Chu kỳ nhiệt của phản ứng colony- PCR như sau: 94°C: 3min; (94°C: 30s; 58°C: 30s; 72°C: 60s) lặp lại 25 chu kỳ; 72°C: 5min; 4°C: ∞.

Sản phẩm colony-PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% để chọn ra các khuẩn lạc mang gen có kích thước như mong muốn.

2.3.2.6. Tách chiết plasmid từ tế bào E. coli

Sử dụng Kit QIAprep Spin Miniprep (của hãng QIAGEN) và chỉ dẫn của nhà sản xuất để tách chiết plasmid. Đây là phương pháp tách plasmid lượng bé từ 1-1,5 ml dịch khuẩn E. coli, có số bản copy plasmid cao.

Quy trình: Hút 1,5 ml dịch khuẩn E.coli đã nuôi qua đêm trong môi trường LB lỏng cho vào ống eppendorf 1,5 ml. Ly tâm 7000 v/p trong 5 phút để thu tế bào. Hòa tan tế bào trong 250 l buffer P1 (lưu ý RNase đã được bổ sung vào buffer P1). Bổ sung 250 l buffer P2, đảo ống nhẹ nhàng 4 – 6 lần để trộn đều. Không votex, vì sẽ làm lẫn với DNA genome. Cần thiết có thể đảo ống cho đến khi nhìn thấy dịch trắng sữa. Không để phản ứng phân giải quá 5 phút. Bổ sung 350 l buffer N3, đảo ống ngay lập tức nhưng nhẹ nhàng 4- 6 lần. Tránh kết tủa cục bộ, đảo đều dung dịch nhẹ nhàng nhưng liên tục ngay sau khi bổ sung buffer N3. Dung dịch trở nên có màu trắng sữa. Ly tâm ở 13000 v/p trong 10 phút. Hút dịch nổi cho vào cột QIAprep Spin Miniprep. Ly tâm ở 13000 v/p trong 30- 60 giây, loại bỏ dịch chảy qua cột. Rửa cột QIAprep Spin Miniprep bằng cách bổ sung 0,5ml buffer PB và ly tâm ở 13000 v/p trong 30- 60 giây. Loại bỏ dịch chảy qua cột. Bước này là rất cần thiết để loại bỏ hoạt tính của nuclease khi sử dụng chủng endA+ như JM, HB101 hoặc các thế hệ khác của nó cũng như các chủng dại mà có mức độ hoạt tính cao của nuclease hoặc nồng độ carbonhydrate cao. Chủng tế bào chủ như XL-1 và DH5 không cần thiết phải sử dụng bước rửa này. Rửa cột QIAprep Spin Miniprrep bằng cách bổ sung 0,75 ml buffer PE và ly tâm ở 13000 v/p trong 30- 60 giây. Loại bỏ dịch chảy qua cột, và ly tâm bổ sung ở 13000 v/p trong 1 phút để loại bỏ hết buffer

rửa. Đặt cột trong một ống eppendorf 1,5 ml. Hòa tan DNA, bổ sung 50 l EB hoặc nước cất tới tâm của mỗi cột QIAprep Spin Miniprrep, để ở nhiệt độ phòng 1 phút và ly tâm ở 13000 v/p trong 1 phút. Tiến hành điện di kiểm tra sản phẩm tich sạch plasmid trên gel agarose 1%.

2.3.2.7. Phương pháp kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn

Để kiểm tra các plasmid tái tổ hợp chứa vector pBI121, các plasmid này được kiểm tra bằng cách xử lý bằng enzyme XbaI và SacI. Thành phần phản ứng cắt được thực hiện theo sự hướng dẫn của hãng sản xuất bộ kit sử dụng enzyme (bảng 2.7).

Bảng 2.7. Thành phần của phản ứng cắt enzyme giới hạn Thành phần Thể tích (µl) Nước deion, khử trùng 8 Buffer Tango 10X 2 DNA (50 ng/µl) 10 XbaI (5U/ µl) 0.5 SacI (10 U/ µl) 0.5 Tổng thể tích 20

Phản ứng được ủ trong 2 giờ ở 37oC. Sản phẩm cắt sau đó được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% dưới điều kiện 120V, 40 phút.

2.3.2.8. Phương pháp biến nạp vào Agrobacterium tumefaciens bằng xung điện

Sau khi chọn được dòng plasmid tái tổ hợp, plasmid được biến nạp vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens K599 (khuẩn để kiểm tra cấu trúc chuyển gen bằng cách tạo rễ tơ trong thời gian ngắn 2 tuần) và AGL1 (dòng khuẩn để biến nạp vào cây chuyển gen mong muốn) bằng phương pháp xung điện (Sambrook và cộng sự, 1989). Sau khi xung điện xong, các dịch khuẩn được trải trên môi trường có kháng sinh chọn lọc streptomycin 100 mg/l và kanamycine 50 mg/l (với chủng K599) và môi trường có kháng sinh chọn lọc kanamycine 50mg/l, rifamycine 50 mg/l và carbenicilin 50mg/l (với chủng

AGL1). Đĩa được ủ ở 28oC, ở điều kiện tối trong 2 ngày. Các chủng vi khuẩn tái tổ hợp được lưu giữ ở điều kiện -84oC để phục vụ cho các thí nghiệm chuyển gen sau này.

2.3.2.9. Chọn dòng A.tumefacines tái tổ hợp

Để chọn A.tumefacines tái tổ hợp, chúng tôi chọn 3 khuẩn lạc riêng rẽ từ mỗi chủng, sau đó nuôi lỏng thu sinh khối và tách plasmid. Các plasmid này được sử dụng làm khuôn cho phương pháp PCR. Thành phần của phản ứng được trình bày ở bảng sau.

Bảng 2.8. Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích (l) 1 2 3 4 5 Nước deion, khử trùng PCR Master mix 2X Primer forward (10 pmol)

Primer reverse (10 pmol) Plasmid (20 ng/ul) 10.5 12,5 0,5 0,5 1 Tổng thể tích 25

Chu kỳ nhiệt của phản ứng colony- PCR như sau: 94°C: 3min; (94°C: 30s; 58°C: 30s; 72°C: 60s) lặp lại 25 chu kỳ; 72°C: 5min; 4°C: ∞.

Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% để chọn ra các dòng A.tumefacines mang gen có kích thước như mong muốn.

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Nghiên cứu lý thuyết về đặc điểm trình tự gen và protein CoOMT

Hiện nay, sự hiện diện và chức năng của các protein tham gia con đường sinh tổng hợp rotundin nói riêng, palmatine nói chung vẫn đang được các nhà khoa học quan tâm, khám phá. Takashi và cs (2002) lần đầu tiên đã xác định được trình tự cDNA của gen CoOMT ở loài Coptis japonica và chứng minh được vai trò chuyển hóa cơ chất columbamine thành palmatine. Đồng thời, các tác giả đề xuất chức năng chuyển hóa cơ chất tetrahydro columbamine thành tetrahydropalmatine (rotundin) dựa trên những kết quả thí nghiệm thu được [77]. Do vậy, định hướng nghiên cứu của chúng tôi là xác định vai trò, chức năng của gen CoOMT trong con đường tổng hợp rotundin ở cây Bình vôi.

Từ trình tự cDNA thu được, Takashi và cs xác định được gen CoOMT có sự tương đồng với gen 6OMT, 4’OMT và các gen OMT khác ở thực vật, mức độ tương đồng cao hơn gen SMT (hình 1.3) [77].

Khi so sánh trình tự amino acid suy diễn của các enzyme OMT trong con đường tổng hợp palmatine, cấu trúc phân tử enzyme có 3 motif (A, B, C) bảo thủ (hình 3.1), có sự tương đồng với protein flavonoid 7OMT và caffeiic acid OMT (lúa mạch), 6a-hydroxymaackia 3’OMT (đậu xanh), isoflavone 7OMT (cỏ linh lăng, alfalfa), 4OMT và 6 OMT (Coptis), SMT (Coptis), caffeiic acid OMT (alfalfa), caffeiic acid OMT (Arabidopsis), O-diphenol OMT và caffeoyl CoA 3OMT (Tobacco), myo-inositol OMT (ice plant). Sự đa dạng về trình tự này ở vị trí liên kết cơ chất, dự kiến nằm ở đầu N của Coptis OMTs [75]. Từ trình tự amino acid suy diễn của các enzyme CoOMT, chúng tôi sử dụng phần mềm Tin sinh học Phyre2 để mô hình hóa cấu trúc không gian 3D của phân tử (hình 3.2, 3.3).

Hình 3.1. So sánh trình tự amino acid suy diễn của các enzyme OMT trong con

đường tổng hợp palmatine (CJEST64: trình tự amino acid suy diễn của CoOMT)

Hình 3.2. Mô hình cấu trúc không gian 3D của protein CoOMT

Hình 3.3. Cấu trúc thứ cấp của protein CoOMT

3.2. Kết quả tạo dòng tế bào vi khuẩn tái tổ hợp mang gen nhân tạo CoOMT

Phân tử cDNA tổng hợp nhân tạo của gen CoOMT được gắn vào vector tách dòng. Trên môi trường nuôi dưỡng, chúng tôi chọn ra 15 dòng tế bào để thực hiện phản ứng clony- PCR với cặp primer trên pUC19. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra kích thước trên gel agarose 2% (90V/40 phút), sử dụng PSA Loading buffer 6X. Kết quả được trình bày ở hình 3.4.

Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm colony- PCR nhân gen CoOMT

(M: PSA DNA Ladder. Giếng 1->15: sản phẩm PCR của 15 khuẩn lạc)

Chúng tôi tiếp tục chọn 4 dòng 1, 2, 3 và 15 để nuôi tăng sinh khối phục vụ cho việc tách chiết, tinh sạch và giải trình tự plasmid tái tổ hợp thu được. Bộ kit tinh sạch plasmid của Jena Biociense được sử dụng để tinh sạch 4 dòng nuôi lắc