Sau khi kiểm tra sản phẩm tách dòng tiến hành tách plasmid bằng dung dịch sol I, sol II, sol II (Bảng 2.4). Các bước được tiến hành như sau:
Bước 1: Chuyển 2ml dịch nuôi sang ống eppendorf. Ly tâm 6000 v/p ở 4oC trong 5 phút. Loại bỏ dịch môi trường để thu nhận cặn tế bào.
Bước 2: Làm tan cặn tế bào trong 100l dung dịch Sol I (giữ trong đá),
Bước 3: Bổ sung 200l dung dịch Sol II vào mỗi eppendorf. Đậy nắp chặt, đảo ngược eppendorf vài lần và giữ trên đá trong 1 phút
Bước 4: Bổ sung 150l dung dịch Sol III. Đậy nắp chặt, đảo ngược eppendorf vài lần và giữ trong đá trong 3-5 phút.
Bước 5: Ly tâm 12000 v/p trong 10 phút ở 4oC và hút chuyển dịch phía trên sang ống mới. Bổ sung hỗn hợp chloroform: isoamin (24:1) theo tỉ lệ 1:1, đảo đều mẫu sau đó để ở nhiệt độ phòng 15 phút.
Bước 6: Ly tâm 12000 v/p trong 10 phút ở 4oC và hút dịch phía trên chuyển sang ống mới.
Bước 7: Tủa plasmid bằng cách bổ sung 1 lần thể tích isopropanol lạnh và giữ ở -20oC trong 30 phút.
Bước 8: Thu tủa bằng cách ly tâm 12000 v/p trong 10 phút ở 4oC. Rửa sạch mẫu bằng cách bổ sung 0,5ml ethanol 70độ. Ly tâm thu tủa 12000v/p
trong 10 phút ở 4oC (lặp lại 2 lần).
Bước 10: Làm khô tủa bằng máy SpeedVac trong 2 phút hoặc để mở nắp trong 15 phút ở nhiệt độ phòng trong box bật quạt.
Bước 11: Hoà tan tủa plasmid trong 50l H2O khử vô trùng chứa 20g/ml RNase. Mẫu được lưu giữ ở -20 oC.
Bước 12: Kiểm tra DNA plasmid bằng điện di trên gel agarose 1,0 %.
Bảng 2.4. Thành phần dung dịch tách plasmid Dung dịch Hóa chất Nồng độ Thể tích Dung dịch I (Sol I) (khử trùng, giữ 4oC) Tris- HCl, 1M, pH 8,0 25 mM 2,5 ml EDTA, 0,5M, pH 8,0 10 mM 2 ml Glucose 50 mM 0,9 g Dung dịch II (Sol II)
(Pha mới trước khi sử dụng)
NaOH, 2N 0,2 N 10 ml
SDS, 10% 1% 10 ml
Dung dịch III (Sol III) (giữ 4oC)
CH3COOK, pH 5,5 5,0 M 60 ml CH3COOH 11,5% 11,5 ml
H2O 28,5 ml
(Tổng thể tích mỗi loại Sol, V= 100 ml)
Sử dụng kit tinh sạch plasmid của Jena Biociense để tinh sạch các dòng tế bào dương tính với clony- PCR trước khi tiến hành giải trình tự.