Mảnh gel chứa đoạn gen có kích thước 1113 bp và vector pBI121 được thu nhận vào ống 2 ml. Bổ sung dung dịch đệm gắn (binding buffer) vào gel theo tỷ lệ: Vmẫu : Vđệm = 1 : 1, trộn đều và chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột, ly tâm 13000 v/p trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột. Bổ sung 500l dung dịch đệm rửa (washing buffer), ly tâm 13000 v/p trong 1 phút, đổ dịch chảy qua cột, ly tâm bổ sung 1 phút để loại bỏ hết dung dịch đệm rửa. Hoà tan DNA trong 30 – 50l nước cất hoặc dung dịch EB, đã được làm ấm đến 50oC, để ở nhiệt độ phòng 1 phút, sau đó ly tâm 13000 v/p trong 1 phút.
2.3.2.3. Gắn đoạn gen CoOMT 1113 bp vào vector pBI121
Sản phẩm thôi gel sau khi tinh sạch được gắn vào vector tách dòng pBI121. Thành phần phản ứng nối ghép như sau:
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng nối ghép gen STT Thành phần Thể tích (l) 1 2 3 4 5 Dung dịch đệm (10x) T4 ligase DNA (20 ng/ µl) pBI121 plasmid (20 ng/ µl) H2O 1 1 6 1 1 Tổng thể tích 10
Hỗn hợp được ủ ở 22oC trong 60 phút và sau đó được biến nạp vào tế bào khả biến E.coliDH5α.
2.3.2.4. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E. coli bằng phương pháp sốc nhiệt
+ Chuẩn bị tế bào khả biến:
Tế bào E.coli DH5α được cấy ria trên môi trường LB đặc và nuôi qua đêm ở 37oC. Chọn một khuẩn lạc nuôi cấy trong 5ml LB lỏng, lắc 200 v/p, ở 37oC, qua đêm. Hút 1% dịch khuẩn ở trên cho vào 50ml LB lỏng, lắc 200 v/p, ở 37oC, trong 2-3 giờ, đo OD600nm đạt 0,4 - 0,6 thì chuyển dịch nuôi cấy sang ống ly tâm, để 15 phút ở trong đá (hoặc ở 4oC). Ly tâm 4000 v/p, ở 4oC, trong 5 phút. Thu cặn và hoà tan trong 30ml CaCl2 0,1 M, để trong đá 15 phút, sau đó ly tâm 4000 v/p, ở 4oC, trong 5 phút (lặp lại ba lần, để trong đá lần thứ hai 30 phút, lần thứ ba 60 phút). Đổ dịch CaCl2, hòa tan trong 1ml CaCl2/100ml LB ban đầu. Bổ sung 15- 20% glycerol. Chia 50 l dịch tế bào khả biến vào mỗi ống eppendorf 1,5 ml. Bảo quản tế bào khả biến trong tủ lạnh -84oC.
+ Biến nạp:
Tế bào khả biến được lấy ra từ tủ -84oC và được làm tan trên đá. Bổ sung 5l vector đã gắn gen vào ống đựng tế bào khả biến và trộn nhẹ. Hỗn hợp được đặt trong đá 10-15 phút, rồi được chuyển sang bể ổn nhiệt có nhiệt độ 42oC trong 1 phút 30 giây. Sau đó mẫu được lấy ra và đặt ngay lên đá lạnh trong 5 phút. Bổ sung 500 l môi trường LB lỏng, hỗn hợp được nuôi ở 37oC, lắc 200 v/p trong 1 giờ. Sử dụng que cấy trải, trải 100- 200 l dịch khuẩn lên đĩa môi trường LB đặc có chứa 50mg/l carbenicillin, 100 µM IPTG, 40 mg/l X-gal. Ủ đĩa ở 37oC qua đêm.
2.3.2.5. Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR)
Các mẫu khuẩn tái tổ hợp sau biến nạp mọc trên môi trường LB đặc được chọn lọc để thực hiện phản ứng colony- PCR. Thành phần của phản ứng colony- PCR được trình bày trong bảng 2.3.
Chu kỳ nhiệt của phản ứng colony- PCR như sau: 94°C: 3min; (94°C: 30s; 58°C: 30s; 72°C: 60s) lặp lại 25 chu kỳ; 72°C: 5min; 4°C: ∞.
Sản phẩm colony-PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% để chọn ra các khuẩn lạc mang gen có kích thước như mong muốn.
2.3.2.6. Tách chiết plasmid từ tế bào E. coli
Sử dụng Kit QIAprep Spin Miniprep (của hãng QIAGEN) và chỉ dẫn của nhà sản xuất để tách chiết plasmid. Đây là phương pháp tách plasmid lượng bé từ 1-1,5 ml dịch khuẩn E. coli, có số bản copy plasmid cao.
Quy trình: Hút 1,5 ml dịch khuẩn E.coli đã nuôi qua đêm trong môi trường LB lỏng cho vào ống eppendorf 1,5 ml. Ly tâm 7000 v/p trong 5 phút để thu tế bào. Hòa tan tế bào trong 250 l buffer P1 (lưu ý RNase đã được bổ sung vào buffer P1). Bổ sung 250 l buffer P2, đảo ống nhẹ nhàng 4 – 6 lần để trộn đều. Không votex, vì sẽ làm lẫn với DNA genome. Cần thiết có thể đảo ống cho đến khi nhìn thấy dịch trắng sữa. Không để phản ứng phân giải quá 5 phút. Bổ sung 350 l buffer N3, đảo ống ngay lập tức nhưng nhẹ nhàng 4- 6 lần. Tránh kết tủa cục bộ, đảo đều dung dịch nhẹ nhàng nhưng liên tục ngay sau khi bổ sung buffer N3. Dung dịch trở nên có màu trắng sữa. Ly tâm ở 13000 v/p trong 10 phút. Hút dịch nổi cho vào cột QIAprep Spin Miniprep. Ly tâm ở 13000 v/p trong 30- 60 giây, loại bỏ dịch chảy qua cột. Rửa cột QIAprep Spin Miniprep bằng cách bổ sung 0,5ml buffer PB và ly tâm ở 13000 v/p trong 30- 60 giây. Loại bỏ dịch chảy qua cột. Bước này là rất cần thiết để loại bỏ hoạt tính của nuclease khi sử dụng chủng endA+ như JM, HB101 hoặc các thế hệ khác của nó cũng như các chủng dại mà có mức độ hoạt tính cao của nuclease hoặc nồng độ carbonhydrate cao. Chủng tế bào chủ như XL-1 và DH5 không cần thiết phải sử dụng bước rửa này. Rửa cột QIAprep Spin Miniprrep bằng cách bổ sung 0,75 ml buffer PE và ly tâm ở 13000 v/p trong 30- 60 giây. Loại bỏ dịch chảy qua cột, và ly tâm bổ sung ở 13000 v/p trong 1 phút để loại bỏ hết buffer
rửa. Đặt cột trong một ống eppendorf 1,5 ml. Hòa tan DNA, bổ sung 50 l EB hoặc nước cất tới tâm của mỗi cột QIAprep Spin Miniprrep, để ở nhiệt độ phòng 1 phút và ly tâm ở 13000 v/p trong 1 phút. Tiến hành điện di kiểm tra sản phẩm tich sạch plasmid trên gel agarose 1%.
2.3.2.7. Phương pháp kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn
Để kiểm tra các plasmid tái tổ hợp chứa vector pBI121, các plasmid này được kiểm tra bằng cách xử lý bằng enzyme XbaI và SacI. Thành phần phản ứng cắt được thực hiện theo sự hướng dẫn của hãng sản xuất bộ kit sử dụng enzyme (bảng 2.7).
Bảng 2.7. Thành phần của phản ứng cắt enzyme giới hạn Thành phần Thể tích (µl) Nước deion, khử trùng 8 Buffer Tango 10X 2 DNA (50 ng/µl) 10 XbaI (5U/ µl) 0.5 SacI (10 U/ µl) 0.5 Tổng thể tích 20
Phản ứng được ủ trong 2 giờ ở 37oC. Sản phẩm cắt sau đó được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% dưới điều kiện 120V, 40 phút.
2.3.2.8. Phương pháp biến nạp vào Agrobacterium tumefaciens bằng xung điện
Sau khi chọn được dòng plasmid tái tổ hợp, plasmid được biến nạp vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens K599 (khuẩn để kiểm tra cấu trúc chuyển gen bằng cách tạo rễ tơ trong thời gian ngắn 2 tuần) và AGL1 (dòng khuẩn để biến nạp vào cây chuyển gen mong muốn) bằng phương pháp xung điện (Sambrook và cộng sự, 1989). Sau khi xung điện xong, các dịch khuẩn được trải trên môi trường có kháng sinh chọn lọc streptomycin 100 mg/l và kanamycine 50 mg/l (với chủng K599) và môi trường có kháng sinh chọn lọc kanamycine 50mg/l, rifamycine 50 mg/l và carbenicilin 50mg/l (với chủng
AGL1). Đĩa được ủ ở 28oC, ở điều kiện tối trong 2 ngày. Các chủng vi khuẩn tái tổ hợp được lưu giữ ở điều kiện -84oC để phục vụ cho các thí nghiệm chuyển gen sau này.
2.3.2.9. Chọn dòng A.tumefacines tái tổ hợp
Để chọn A.tumefacines tái tổ hợp, chúng tôi chọn 3 khuẩn lạc riêng rẽ từ mỗi chủng, sau đó nuôi lỏng thu sinh khối và tách plasmid. Các plasmid này được sử dụng làm khuôn cho phương pháp PCR. Thành phần của phản ứng được trình bày ở bảng sau.
Bảng 2.8. Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích (l) 1 2 3 4 5 Nước deion, khử trùng PCR Master mix 2X Primer forward (10 pmol)
Primer reverse (10 pmol) Plasmid (20 ng/ul) 10.5 12,5 0,5 0,5 1 Tổng thể tích 25
Chu kỳ nhiệt của phản ứng colony- PCR như sau: 94°C: 3min; (94°C: 30s; 58°C: 30s; 72°C: 60s) lặp lại 25 chu kỳ; 72°C: 5min; 4°C: ∞.
Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% để chọn ra các dòng A.tumefacines mang gen có kích thước như mong muốn.
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu lý thuyết về đặc điểm trình tự gen và protein CoOMT
Hiện nay, sự hiện diện và chức năng của các protein tham gia con đường sinh tổng hợp rotundin nói riêng, palmatine nói chung vẫn đang được các nhà khoa học quan tâm, khám phá. Takashi và cs (2002) lần đầu tiên đã xác định được trình tự cDNA của gen CoOMT ở loài Coptis japonica và chứng minh được vai trò chuyển hóa cơ chất columbamine thành palmatine. Đồng thời, các tác giả đề xuất chức năng chuyển hóa cơ chất tetrahydro columbamine thành tetrahydropalmatine (rotundin) dựa trên những kết quả thí nghiệm thu được [77]. Do vậy, định hướng nghiên cứu của chúng tôi là xác định vai trò, chức năng của gen CoOMT trong con đường tổng hợp rotundin ở cây Bình vôi.
Từ trình tự cDNA thu được, Takashi và cs xác định được gen CoOMT có sự tương đồng với gen 6OMT, 4’OMT và các gen OMT khác ở thực vật, mức độ tương đồng cao hơn gen SMT (hình 1.3) [77].
Khi so sánh trình tự amino acid suy diễn của các enzyme OMT trong con đường tổng hợp palmatine, cấu trúc phân tử enzyme có 3 motif (A, B, C) bảo thủ (hình 3.1), có sự tương đồng với protein flavonoid 7OMT và caffeiic acid OMT (lúa mạch), 6a-hydroxymaackia 3’OMT (đậu xanh), isoflavone 7OMT (cỏ linh lăng, alfalfa), 4OMT và 6 OMT (Coptis), SMT (Coptis), caffeiic acid OMT (alfalfa), caffeiic acid OMT (Arabidopsis), O-diphenol OMT và caffeoyl CoA 3OMT (Tobacco), myo-inositol OMT (ice plant). Sự đa dạng về trình tự này ở vị trí liên kết cơ chất, dự kiến nằm ở đầu N của Coptis OMTs [75]. Từ trình tự amino acid suy diễn của các enzyme CoOMT, chúng tôi sử dụng phần mềm Tin sinh học Phyre2 để mô hình hóa cấu trúc không gian 3D của phân tử (hình 3.2, 3.3).
Hình 3.1. So sánh trình tự amino acid suy diễn của các enzyme OMT trong con
đường tổng hợp palmatine (CJEST64: trình tự amino acid suy diễn của CoOMT)
Hình 3.2. Mô hình cấu trúc không gian 3D của protein CoOMT
Hình 3.3. Cấu trúc thứ cấp của protein CoOMT
3.2. Kết quả tạo dòng tế bào vi khuẩn tái tổ hợp mang gen nhân tạo CoOMT
Phân tử cDNA tổng hợp nhân tạo của gen CoOMT được gắn vào vector tách dòng. Trên môi trường nuôi dưỡng, chúng tôi chọn ra 15 dòng tế bào để thực hiện phản ứng clony- PCR với cặp primer trên pUC19. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra kích thước trên gel agarose 2% (90V/40 phút), sử dụng PSA Loading buffer 6X. Kết quả được trình bày ở hình 3.4.
Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm colony- PCR nhân gen CoOMT
(M: PSA DNA Ladder. Giếng 1->15: sản phẩm PCR của 15 khuẩn lạc)
Chúng tôi tiếp tục chọn 4 dòng 1, 2, 3 và 15 để nuôi tăng sinh khối phục vụ cho việc tách chiết, tinh sạch và giải trình tự plasmid tái tổ hợp thu được. Bộ kit tinh sạch plasmid của Jena Biociense được sử dụng để tinh sạch 4 dòng nuôi lắc ủ qua đêm (sau 16 giờ, 37oC).
Hai mồi trên vector được sử dụng để xác định trình tự như sau: pUC19 Fwd.A: CAAGGCGATTAAGTTGGGTAAC
pUC19 Rv.A3: ATTTCACACAGGAAACAGCTATGA
Phân tích kết quả giải trình tự cDNA CoOMT cho thấy dòng 2 cho kết quả đúng 100%, còn 3 dòng còn lại đều mang các đột biến điểm.
3.3. Kết quả thiết kế vector pBI121-1113 và tạo chủng Agrobacterium
tumefaciens tái tổ hợp mang gen CoOMT
Sau khi xử lý vector PUC-1113 và pBI121 với enzyme giới hạn XbaI và
SacI, chúng tôi thu được cấu trúc 35S-CoOMT-Cmyc-Kdel có kích thước khoảng 1113 bp và vector pBI121 đã được loại bỏ gen gus (hình 3.5).
Các sản phẩm này được gắn với nhau bằng enzyme T4 ligase, sau đó được biến nạp vào trong E.coli để chọn dòng tế bào chủ chứa vector tái tổ hợp dựa trên kiểu hình. Kết quả chọn các dòng plasmid pBI121-1113 bằng phản ứng colony- PCR và cắt enzyme giới hạn XbaI và SacI được thể hiện ở hình 3.6.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 M 2000 bp 1000 bp 750 bp 500 bp 250 bp
Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm cắt xử lý vector pUC-1113 (A) và vector pBI121 (B) với enzyme XbaI và SacI
Hình 3.6. Kết quả chọn dòng plasmid tái tổ hợp pBI121-1113 trong E. coli
A. Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR. M: marker 1kb (Thermo), NC:
đối chứng âm (H2O), 1-5: dòng khuẩn lạc từ 1-5
B. Kết quả cắt enzyme giới hạn plasmid tái tổ hợp. 1: Đối chứng pBI121; 3:
plasmid pBI121-1113 dòng số 3.
Cấu trúc vector đã thiết kế đầy đủ các thành phần cần thiết như 35S-CoOMT-
Cmyc-Kdel được biến nạp vào vi khuẩn A. tumefaciens bằng kĩ thuật điện xung. Vi
khuẩn A.tumefaciens sau khi biến nạp được nuôi cấy trên môi trường LB đặc bổ
sung kháng sinh chọn lọc kanamycin. Chúng tôi lựa chọn những khuẩn lạc tốt, phát triển đồng đều chuyển sang môi trường LB lỏng bổ sung kháng sinh kanamycin để
14 758 bp
1113 bp
14 758 bp
nuôi cấy thu sinh khối, tách plasmid. Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen CoOMT
trên plasmid ở 2 dòng vi khuẩn được chọn bằng phản ứng colony- PCR cho thấy đều dương tính, nghĩa là mang gen đích CoOMT. Các dòng vi khuẩn A. tumefaciens
có plasmid tái tổ hợp chứa gen CoOMT được lưu giữ chủng để sử dụng cho việc biến nạp vào cây Bình vôi và cây thuốc lá.
Chúng tôi đã chọn được dòng khuẩn số 2 mang plasmid tái tổ hợp với đúng kích thước tính toán lý thuyết. Plasmid tái tổ hợp này được tinh sạch và biến nạp vào 2 chủng A.tumefacines khác nhau: K599 (phục vụ cho đánh giá nhanh sự hoạt động của cấu trúc vector chuyển gen nhờ vào sự hình thành rễ tơ sau quá trình chuyển gen trong khoảng 2 tuần) và chủng AGL1 (biến nạp tạo cây chuyển gen).
Hình 3.7. Kết quả chọn dòng plasmid tái tổ hợp pBI121-1113 trong
A.tumefaciens
A. Kết quả điện di sản phẩm PCR từ plasmid tái tổ hợp trong chủng
A.tumefaciens K599. M: marker 1kb (Thermo), NC: đối chứng âm
(H2O), 1-2: plasmid số 1,2
B. Kết quả điện di sản phẩm PCR từ plasmid tái tổ hợp chủng
A.tumefaciens AGL1. 1,2: plasmid dòng số 1,2
1113 bp
Kết quả chọn các dòng A.tumefaciens tái tổ hợp được thể hiện ở hình 3.7 cho thấy các dòng plasmid tái tổ hợp số 1 và 2 trong A.tumefaciens K599 và AGL1 đều cho kết quả dương tính trong phản ứng PCR. Như vậy, chúng tôi đã thiết kế và tạo thành công hai chủng vi khuẩn A.tumefaciens tái tổ hợp là K599 và AGL1 mang vector pBI121-1113 chứa gen chuyển CoOMT (hình 3.7) phục vụ cho biểu hiện gen và đánh giá chức năng của gen này ở cây mô hình và cây Bình vôi chuyển gen.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1.Kết luận
- Từ trình tự cDNA của gen nhân tạo CoOMT dài 1113 bp có sự tương đồng với gen 6OMT, 4’OMT và các gen OMT khác ở thực vật. Protein suy diễn có 3 motif (A, B, C) bảo thủ giống với các protein họ OMT. Sự đa dạng về trình tự protein ở vị trí liên kết cơ chất, dự kiến nằm ở đầu N-terminal của Coptis OMTs.
- Tạo được thành công 01 dòng tế bào chủ mang gen CoOMT nhân tạo có trình tự nucleotid cho kết quả đúng 100%, 03 dòng còn lại đều mang các đột biến điểm.
- Thiết kế và tạo thành công chủng vi khuẩn A.tumefacines K599 và AGL1 mang vector pBI121-1113 chứa gen chuyển CoOMT, phục vụ cho biểu hiện gen ở cây mô hình và cây Bình vôi.
2.Kiến nghị
Biểu hiện gen CoOMT ở cây mô hình và cây Bình vôi để đánh giá vai trò của gen chuyển trong quá trình sinh tổng hợp rotundin.
CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÔNG BỐ
1. Tangmany SYSOMEPHONE, Ngô Diễm Quỳnh, PHANTHAHAK
Santhana, Nongkhan MANISOK, Phạm Thị Thanh Nhàn (2020), Nghiên cứu công thức khử trùng mẫu và môi trường nuôi cấy in vitro cây bình vôi vàng (stephania spp.), TNU Journal of Science and Technology 225(08): 239 – 244.
2.Pham Thi Thanh Nhan, Thongkham LAPHASY, Tangmany SYSOMEPHONE (2020), Sterilization of sterilizing plant materials and effect of cytokinin on shoot formation of Orthosiphon aristatus plantlets,
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
[1]. Bùi Văn Thắng, Đỗ Xuân Đồng, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2013),
“Quy trình chuyển gen vào cây xoan ta (Melia azedazach L.) đạt hiệu suất cao”, Tạp chí Sinh học, 35(2), tr. 227 - 233.
[2]. Dược điển Việt Nam V tập 2 (2007), NXB Y học. Hà nội – 2017. Tr. 1084. [3]. Dược điển Việt Nam IV, NXB Y học, Hà nội – 2009. Tr. 697.
[4]. Dương Hữu Lợi (1996), “Nghiên cứu hoạt chất từ củ Bình vôi’, Tạp chí