tumefaciens tái tổ hợp mang gen CoOMT
Sau khi xử lý vector PUC-1113 và pBI121 với enzyme giới hạn XbaI và
SacI, chúng tôi thu được cấu trúc 35S-CoOMT-Cmyc-Kdel có kích thước khoảng 1113 bp và vector pBI121 đã được loại bỏ gen gus (hình 3.5).
Các sản phẩm này được gắn với nhau bằng enzyme T4 ligase, sau đó được biến nạp vào trong E.coli để chọn dòng tế bào chủ chứa vector tái tổ hợp dựa trên kiểu hình. Kết quả chọn các dòng plasmid pBI121-1113 bằng phản ứng colony- PCR và cắt enzyme giới hạn XbaI và SacI được thể hiện ở hình 3.6.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 M 2000 bp 1000 bp 750 bp 500 bp 250 bp
Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm cắt xử lý vector pUC-1113 (A) và vector pBI121 (B) với enzyme XbaI và SacI
Hình 3.6. Kết quả chọn dòng plasmid tái tổ hợp pBI121-1113 trong E. coli
A. Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR. M: marker 1kb (Thermo), NC:
đối chứng âm (H2O), 1-5: dòng khuẩn lạc từ 1-5
B. Kết quả cắt enzyme giới hạn plasmid tái tổ hợp. 1: Đối chứng pBI121; 3:
plasmid pBI121-1113 dòng số 3.
Cấu trúc vector đã thiết kế đầy đủ các thành phần cần thiết như 35S-CoOMT-
Cmyc-Kdel được biến nạp vào vi khuẩn A. tumefaciens bằng kĩ thuật điện xung. Vi
khuẩn A.tumefaciens sau khi biến nạp được nuôi cấy trên môi trường LB đặc bổ
sung kháng sinh chọn lọc kanamycin. Chúng tôi lựa chọn những khuẩn lạc tốt, phát triển đồng đều chuyển sang môi trường LB lỏng bổ sung kháng sinh kanamycin để
14 758 bp
1113 bp
14 758 bp
nuôi cấy thu sinh khối, tách plasmid. Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen CoOMT
trên plasmid ở 2 dòng vi khuẩn được chọn bằng phản ứng colony- PCR cho thấy đều dương tính, nghĩa là mang gen đích CoOMT. Các dòng vi khuẩn A. tumefaciens
có plasmid tái tổ hợp chứa gen CoOMT được lưu giữ chủng để sử dụng cho việc biến nạp vào cây Bình vôi và cây thuốc lá.
Chúng tôi đã chọn được dòng khuẩn số 2 mang plasmid tái tổ hợp với đúng kích thước tính toán lý thuyết. Plasmid tái tổ hợp này được tinh sạch và biến nạp vào 2 chủng A.tumefacines khác nhau: K599 (phục vụ cho đánh giá nhanh sự hoạt động của cấu trúc vector chuyển gen nhờ vào sự hình thành rễ tơ sau quá trình chuyển gen trong khoảng 2 tuần) và chủng AGL1 (biến nạp tạo cây chuyển gen).
Hình 3.7. Kết quả chọn dòng plasmid tái tổ hợp pBI121-1113 trong
A.tumefaciens
A. Kết quả điện di sản phẩm PCR từ plasmid tái tổ hợp trong chủng
A.tumefaciens K599. M: marker 1kb (Thermo), NC: đối chứng âm
(H2O), 1-2: plasmid số 1,2
B. Kết quả điện di sản phẩm PCR từ plasmid tái tổ hợp chủng
A.tumefaciens AGL1. 1,2: plasmid dòng số 1,2
1113 bp
Kết quả chọn các dòng A.tumefaciens tái tổ hợp được thể hiện ở hình 3.7 cho thấy các dòng plasmid tái tổ hợp số 1 và 2 trong A.tumefaciens K599 và AGL1 đều cho kết quả dương tính trong phản ứng PCR. Như vậy, chúng tôi đã thiết kế và tạo thành công hai chủng vi khuẩn A.tumefaciens tái tổ hợp là K599 và AGL1 mang vector pBI121-1113 chứa gen chuyển CoOMT (hình 3.7) phục vụ cho biểu hiện gen và đánh giá chức năng của gen này ở cây mô hình và cây Bình vôi chuyển gen.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1.Kết luận
- Từ trình tự cDNA của gen nhân tạo CoOMT dài 1113 bp có sự tương đồng với gen 6OMT, 4’OMT và các gen OMT khác ở thực vật. Protein suy diễn có 3 motif (A, B, C) bảo thủ giống với các protein họ OMT. Sự đa dạng về trình tự protein ở vị trí liên kết cơ chất, dự kiến nằm ở đầu N-terminal của Coptis OMTs.
- Tạo được thành công 01 dòng tế bào chủ mang gen CoOMT nhân tạo có trình tự nucleotid cho kết quả đúng 100%, 03 dòng còn lại đều mang các đột biến điểm.
- Thiết kế và tạo thành công chủng vi khuẩn A.tumefacines K599 và AGL1 mang vector pBI121-1113 chứa gen chuyển CoOMT, phục vụ cho biểu hiện gen ở cây mô hình và cây Bình vôi.
2.Kiến nghị
Biểu hiện gen CoOMT ở cây mô hình và cây Bình vôi để đánh giá vai trò của gen chuyển trong quá trình sinh tổng hợp rotundin.
CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÔNG BỐ
1. Tangmany SYSOMEPHONE, Ngô Diễm Quỳnh, PHANTHAHAK
Santhana, Nongkhan MANISOK, Phạm Thị Thanh Nhàn (2020), Nghiên cứu công thức khử trùng mẫu và môi trường nuôi cấy in vitro cây bình vôi vàng (stephania spp.), TNU Journal of Science and Technology 225(08): 239 – 244.
2.Pham Thi Thanh Nhan, Thongkham LAPHASY, Tangmany SYSOMEPHONE (2020), Sterilization of sterilizing plant materials and effect of cytokinin on shoot formation of Orthosiphon aristatus plantlets,
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
[1]. Bùi Văn Thắng, Đỗ Xuân Đồng, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2013),
“Quy trình chuyển gen vào cây xoan ta (Melia azedazach L.) đạt hiệu suất cao”, Tạp chí Sinh học, 35(2), tr. 227 - 233.
[2]. Dược điển Việt Nam V tập 2 (2007), NXB Y học. Hà nội – 2017. Tr. 1084. [3]. Dược điển Việt Nam IV, NXB Y học, Hà nội – 2009. Tr. 697.
[4]. Dương Hữu Lợi (1996), “Nghiên cứu hoạt chất từ củ Bình vôi’, Tạp chí y học Việt Nam, số 1, trang 14 – 23.
[5]. Đỗ Xuân Đồng, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình (2007), “Nghiên cứu quy trình tái sinh và hệ thống chuyển gen cà chua của Việt Nam”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 5(2), tr. 217- 223.
[6]. Đỗ Tất lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nxb Y Học, Hà nội. [7]. Đỗ Xuân Đồng, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình (2007), “Nghiên cứu quy trình tái sinh và hệ thống chuyển gen cà chua của Việt Nam”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 5(2), tr. 217- 223.
[8]. Lã Đình Mỡi, Trần Minh Hợi, Dương Đức Huyến, Trần Huy Thái, Ninh Khắc Bản (2005), Tài nguyên thực vật Việt Nam những cây chứa các hợp chất có hoạt tinh sinh học, Tập I, NXB nông nghiệp, Hà Nội, tr. 58-82. [9]. Lê Trần Bình, Cao Huyền Trang (2005) Nghiên cứu và phát triển vaccine
ăn được trong thực vật. Tạp chí công nghệ sinh học 3: 133-142.
[10].Ngô Quang Đại (1999), Sản xuất thuốc giảm đau từ củ Bình vôi, Tạp chí công nghiệp hóa chất, số 2-1999.
[11].Nguyễn Quốc Huy (2010), Nghiên cứu về thực vật, thành phần hóa học, một số tác dụng sinh học của một số loài thuộc chi Stephania Lour. ở Việt Nam, Luận án tiến sĩ dược học, Trường đại học Dược Hà nội.
[12].Nguyễn Tiến Bân (2007), Sách đỏ Việt Nam- phần thực vật, NXB khoa học tự nhiên và công nghệ, tr285.
[13].Nguyễn Tiến Vân (1997), Cẩm nang tra cứu và nhận biết các họ thực vật hạt kín ở Việt Nam, NXB Nông Nghiệp Hà Nội
[14].Nguễn Tiến Vững, Phạm Thanh Kỳ, Bùi Kim Liên, Chu Đình Kính, Trịnh Văn Bảo (1998), Tác dụng của L-tetrahydropalmatin chiết suất từ củ loài bình vôi Stephania glaba (Roxb) Miers lên điện tim và điện não thỏ, Tạp chí dược học, 269, tr. 21-23.
[15].Nguyễn Quang Thạch (chủ biên), Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương Thảo (2005), Giáo trình công nghệ sinh học nông nghiệp, Nxb Nông Nghiệp - Hà Nội.
[16].Nguyễn Minh Chính (2001), Nghiên cứu chiết tách Rotundin từ củ một số loài Bình vôi (thuộc chi Stephania Lour.), điều chế Rotundin Sulfat để bào chế thuốc tiêm, Luận án Tiến sĩ dược học, Hà nội
[17].Phan Thanh Kỳ, Nguyễn Thị Tâm, Trần Văn Thanh (1997), Bài giảng dược liệu, tập 2, Trường Đại học Dược Hà Nội
[18].Phạm Duy Mai, Phan Đức Thuận (1986), Tác dụng Dược lý của Bình vôi, Công trình NCKH Viện Dược liệu 1972 -1986, NXB Y học, Hà nội, 55-57 [19].Nguyễn Minh Chính (2001), Nghiên cứu chiết tách rotundin từ củ một số
loài Bình vôi (thuộc chi Stephania Lour.), điều chế rotundin sulfat để bào chế thuốc tiêm, NXB Đại học Cần Thơ, trang 3 - 4.
[20].Nguyễn Thị Thanh Nga, Hồ Mạnh Tường, Phạm Thị Vân, Nguyễn Tường Vân, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình (2012), “Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào cây dưa hấu (Citrullus lanatus Thumb)”, Tạp chí Sinh học, 34(3), tr. 389 - 396.
[21].The Asia Foundation (2012), Cây thuốc người Dao Ba Vì, tr.32.
[22].Trần Lê Lưu Li, Nguyễn Hữu Hoàng, Bùi Lan Anh (2008), “Thử nghiệm chuyển gen trên lan hồ điệp (Phalaenopsis amabilis) bằng phương pháp bắn gen và Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí phát triển KH&CN- ĐH Quốc gia TP.HCM, 11(10), tr. 109 - 113.
[23].Võ Thị Thúy Huệ, Mã Yến Thanh (2011), “Thiết lập quy trình tái sinh in vitro và đánh giá bước đầu chuyển nạp gen vào cây dầu mè (Jatropha curcas L.) thông qua Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí KHKT Nông Lâm Nghiệp, số 1, tr. 6 - 10.
[24].Vũ Đức Thắng (2014), Điều tra, thu nhập mẫu củ bình vôi ở một số tỉnh Việt Nam và xây dựng phương pháp định lượng Rotundin bằng sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang (TLC-Scanning), luận văn thạc sĩ sinh học, Hà Nội.
[25].Vương Đình Tuấn, Nguyễn Xuân Cường, Phan Thị Mỵ Lan (2012),
“Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến chuyển gen gus vào phôi trưởng thành 6 gia đình Thông nhựa bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”,
Kết quả nghiên cứu Khoa học công nghệ lâm nghiệp giai đoạn 2006-2010,
NXB Nông nghiệp, tr. 60 - 66.
Tiếng Anh
[26].Angerhofer, C.K., Guinaudeau, H., Wongpanich, V., Pezzuto, J.M., Cordell, G.A., 1999. Antiplasmodial and cytotoxic activity of natural bisbenzylisoquinoline alkaloids. Journal of Natural Products 62, 59–66. [27].Aogi K., Nishiyama M. (1997), Overcoming CPT-11 resistance by using
abiscoclaurine alkaloid, cepharanthine, to modulate plasma trans- membrane potential, Int-J-Cancer, vol. 72, pp. 295-300.
[28].Bako L, Umeda M, Tiburcio AF, Schell J, Koncz C (2003) The VirD2 pilot protein of Agrobacterium-transferred DNA interacts with the TATA box - binding protein and a nuclear protein kinase in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America
100: 10108-10113.
[29].Bun Sok-Siya, Michele Laget, Aun Chea, Hot Bun, Evelyne Ollivier and Riad Elias (2009), Cytotoxic activity of alkaloids isolated from Stephania
rotunda in vitro cytotoxic activity of cepharanthine, Phytother. Res., 23, pp.587-590.
[30].Camacho, M.R., Kirby, G.C., Warhurst, D.C., Croft, S.L., Phillipson, J.D., 2000. Oxoaporphine alkaloids and quinines from Stephania dinklagei and evalution of their antiprotozoal activity. Planta Medica 66, 478–480. [31].Chen Y. J., Tu M.L. (1997), Protective effect of tetrandrine on normal
human mononuclear cells against ionizing irradiation, Biol-PharmBull, 20, pp. 1160-1164.
[32].Cardarelli M., Mariotti D., Pomponi M., Spano L., Capone I., Costantino P. (1987), “Agrobacterium rhizogenes T-DNA genes capable of inducing hairy root phenotype”, Mol Gen Genet, 209: 475- 480.
[33].Choi K.B., Morishige T. and Sato F. (2001), “Purification and characterization of coclaurine N-methyltransferase from cultured Coptis japonica cells”, Phytochemistry, 56: 649–655.
[34].Choi K.B., Morishige T., Shitan N., Yazaki K. and Sato F. (2002), “Molecular cloning and characterization of coclaurine N-methyltransferase from cultured cells of Coptis japonica”, J. Biol. Chem., 277: 830–835. [35].Chu, H., Jin, G., Friedman, E. et al (2008), Recent Development in
Studies of Tetrahydroprotoberberines: Mechanism in Antinociception and Drug Addiction. Cell Mol Neurobiol 28, 491–499.
[36].Croteau R., Kutchan T.M. and Lewis N. (2000), Biochemistry and Molecular Biology of Plants, Buchanan, B., Gruissem, W. & Jones, R., eds, American Society of Plant Physiologists, Rockville, Maryland, pp. 1250–1318.
[37].Cunha, N.B., A.M.Murad, T.M. Cipriano, A.C.G. Araújo, F.J.L. Aragão, A.Leite, G.R.Vianna, T.R.McPhee, G.H.M.F.Souza, M.J. Waters (2011), “Expression of functional recombinant human growth hormone in transgenic soybean seeds”, Transgenic res, 20: 811-826.
[38].Diof M. F., Hehn A., Ptak A., Chrétien F., Doerper S., Gontier E., Bourgaud F., Henry M., Chapleur Y., Laurain-Mattar D. (2006), “Hairy root and tissue cultures of Leucojum aestivum L. - Relationships to galanthamine content”, Phytochem.Rev., 6 (2006): 137-141.
[39].Ding ZS, Zhao M, Jing YX, Li LB and Kuang TY (2006) Efficient agrobacterium mediated transformation of rice by phosphomannose isomerase mannose selection. Plant Molecular Biology Reporter 24: 295-303. [40].Das, B., Pal, P., Tandon, V., Lyndem, L.M., Kar, P.K., Rao, H.S.P., 2004.
Anthelmintic efficacy of extract of Stephania glabra and aerial root extract of Trichosanthes multiloba in vitro: two indigenous plants in Shillong, India. Journal of Parasitic Diseases 28, 37–44.
[41].Ellenbroek, B.A., Zhang, X.X., Jin, G.Z., 2006. Effects of (−)stepholidine in animal models for schizophrenia. Acta Pharmacologica Sinica 27, 1111–1118.
[42].Furusawa Shinobu, Wu Jianghong (2007), The effects of biscoclaurine alkaloid cepharanthine on mammalian cells: Implications for cancer, shock, and inflammatory diseases, Life Sciences, Volume 80, pp. 1073– 1079.
[43].Frenzel T. and Zenk M.H. (1990), “Purification and characterization of three isoforms of S-adenosyl-L-methionine: (R,S)-tetrahydrobenzylisoquinoline- N-methyltransferase from Berberis koetineana cell cultures”,
Phytochemistry, 29: 3491–3497.
[44].Gelvin SB (2003) Agrobacterium and plant transformation: the biology behind the “gene - jockeying” tool. Microbiology and Molecular Biology 67: 16-37.
[45].Gulcin, I., Elias, R., Gepdiremen, A., Chea, A., Topal, F., 2010.
rotunda: cepharanthine and fangchinoline. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry 25, 44–53.
[46].Hall, A.M., Chang, C.J., 1997. Multidrug resistance modulators from tephania japonica. Journal of Natural Products 60, 1193–1195.
[47].Ho, L.J., Chang, D.M., Lee, T.C., Chang, M.L., Lai, J.H., 1999. Plant alkaloid tetrandrine down reg ulates protein kinase C-dependent signaling pathway in T cells. European Journal of Pharmacology 367, 389–398.
[48].Hullatti, K.K., Sharada, M.S., 2007. Antimicrobial activity of Cissampelos pareira. Cyclea peltata and Stephania japonica methanolic root extracts.
Advances in Pharmacology and Toxicology 8, 105–108.
[49].Hara M., Yazaki K., Tanaka S. and Tabata M. (1995), “S-adenosyl-L- methionine: norcoclaurine 6-O-methyltransferase from Thalictrum minus cell cultures”, Phytochemistry, 38: 1131–1135.
[50].Hotta T., Tanimura H. (1997), “Modulation of multidrug resistance by cepharanthin in fresh human gastrointestinal tumor cells”, Oncology, 54, pp. 153-157.
[51].Liu, X.J., Wang, Y.F., Zhang, M.Y., 2004. Study on the inhibitory effect of cepharanthine on herpes simplex type 1 virus (HSV-1) in vitro. Journal of Chinese Medicinal Materials (Chin) 27, 107–110.
[52].Lodhi A., Charlwood B. (1996), “Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of Rubia peregrina L: invitro accumulation of anthraquinones”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 46:103- 108. [53].Muregi, F.W., Chhabra, S.C., Njagi, E.N.M., Lang at-Thoruwa, C.C.,
Njue, W.M., Orago, A.S.S., 2004. Anti-plasmodial activity of some Kenyan medicinal plant extracts singly and in combination with chloroquine. Phytotherapy Research 18, 379–384.
[54].Magnotta M., Murata J., Chen J., De Luca V. (2007), “Expression of deacetylvindoline-4-O-acetyltransferase in Catharanthus roseus hairy roots”, Phytochemistry 68: 1922- 1931.
[55].Manske R.H.F. (1973), The alkaloid- chemistry and Physiology, volume XIV, Academic Press- New York- London.
[56].Mantsch JR, Li SJ, Risinger R, Awad S, Katz E, Baker DA, Yang Z (2007), “Levo-tetrahydropalmatine attenuates cocaine selfadministration and cocaine-induced reinstatement in rats”, Psychopharmacology (Berl), 192, pp. 581-591.
[57].Morishige T., Tsujita T., Yamada Y. and Sato F. (2000), “Molecular characterization of the S-adenosyl-L-methionine: 3’-hydroxyroxy-N- methylcoclaurine 4’-O-methyltransferase involved in isoquinoline alkaloid biosynthesis in Coptis japonica”, J. Biol. Chem., 275: 23398–23405.
[58].Muemmler S., Rueffer M. and Zenk M.H. (1985), “S-adenosylL- methionine: (S)-scoulerine 9-O-methyltransferase, a highly stereo- and regio-specific enzyme in tetrahydroprotoberberine biosynthesis”, Plant Cell Reports, 4: 36–39.
[59].Muller M.J. and Zenk M.H. (1992), “The norcoclaurine pathway is operative inberberine biosynthesis in Coptis japonica”, Planta Med., 58: 524–527.
[60].Matthews P.R., Wang M.B., Waterhouse P.M., Thornton S., Fieg S.J., Gubler F., Jacobsen J.V. (2001), “Marker gene elimination from transgenic barley, using co-transformation with adjacent ‘twin T-DNAs’ on stDNAard Agrobacterium transformation vector”, Mol Breed, 7: pp. 195 - 202.
[61].Nawawi, A., Nakamura, N., Meselhy, M.R., Hattori, M., Kurokawa, M., Shiraki, K., Kashiwaba, N., Ono, M., 2001. In vivo antiviral activity of Stephania cepharantha against herpes simplex virus type-1. Phytotherapy Research 15, 497–500.
[62].Okamoto M., Ono M. (2001), Suppression of cytokine production and neural cell death by the anti-inflammatory alkaloid cepharanthine: a potential agent against HIV-1 encephalopathy, Biochem Pharmacol, 747-753.
[63].Pang, L., Hoult, J.R., 1997. Cytotoxicity to macrophages of tetrandrine, an antisili cosis alkaloid, accompanied by an overproduction of prostaglandins. Biochemical Pharmacology 53, 773–782.
[64].Pan Q., Wang Q., Yuan F., Xing S., Zhao J., Choi Y.H., Verpoorte R., Tian Y., Wang G. and Tang K. (2012), “Overexpression of ORCA3 and G10H in Catharanthus roseus plants regulated alkaloid biosynthesis and metabolism revealed by NMR-Metabolomics”, PLoS One 7: e43038. [65].Pham N.B. 2009, Production and secretion of recombinant sweet- tasting
thaumatin from suspension cells and hairy roots of Nicotiana tabacum, phD Thesis, University of Heidelberg.2.
[66].Poulton J.E. (1981), The Biochemistry of Plants, Conn, E.E., ed., Vol. 7, Academic Press, New York, pp. 667–723.
[67].Qian, J.Q., 2002. Cardiovascular pharmacological effects of bisbenzylisoquinoline alkaloid derivatives. Acta Pharmacologica Sinica 23, 1086–1092.
[68].Rueffer M., Nagakura N. and Zenk M.H. (1983), “Partial purification and properties of S-adenosylmethionine:(R), (S)-norlaudanosolin-6- O-methyltransferase from Argemone platyceras cell cultures”, Planta Med., 49: 131–137.
[69].Sato F., Tsujita T., Katagiri Y., Yoshida S. And Yamada Y. (1994), “Purification and characterization of S-adenosyl-L-methionine: norcoclaurine 6-O-methyltransferase from cultured Coptis japonica cells”, Eur. J. Biochem., 225: 125–131.
[70].Simoens C., Alliotte T., Mendel R., Muller A., Schiemannm J. Van Lijsebettens M., Schell J., van Montagu M., DNA inze D. (1986), “A binary
vector for transferring genomic libraries to plants”, Nucl. Acids Res, 14, pp. 8073 - 8090.
[71].Semwal, D.K., Rawat, U., 2009a. Antimicrobial hasubanalactam alkaloid from Stephania glabra. Planta Medica 75, 378–380.
[72].Semwal, D.K., Rawat, U., 2009. Gindarudine, a novel morphine alkaloid from Stephania glabra. Chinese Chemical Letters 20, 823– 826.
[73].Semwal, D.K., Rawat, U., Bamola, A., Semwal, R., 2009. Antimicrobial activity of Phoebe lanceolata and Stephania glabra; preliminary screening studies. Journal of Scientific Research 1, 662– 666.
[74].Sharma, U, Sahu, R.K., Roy, A., Golwala, D.K., 2010. In vivo antidiabetic and antioxidant potential of Stephania hernandifolia in streptozotocin- induced-diabetic rats. Journal of Young Pharmacists 2, 255–260.
[75].Shaghai-Maroof M.A., Soliman K.M., Jorgensen R.A., Allard R.W. (1984), “Ribosomal DNA sepacerlength polymorphism in barley: mendelian inheritance, chromosomal location, and population dynamics”,
Proc Natl Acad Sci, 81 (1984): 8014-8019.
[76].SunY., Moore M.J., Zhang S., Soltis P.S., Soltis D.E., Zhao T., Meng A., Li X., Li J. and Wang H. (2016), “Stephania japonica chloroplast, complete genome”, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_029432.1.
[77].Takashi Morishige, Emilyn Dubouzet, Kum‐Boo Choi, Kazufumi Yazaki, Fumihiko Sato (2002), “Molecular cloning of columbamine O‐ methyltransferase from cultured Coptis japonica cells”, Eur J Biochem., 269(22):5659-67.
[78].Takeshita N., Fujiwara H., Mimura H., Fitchen J.H., Yamada Y. and Sato F. (1995), “Molecular cloning and characterization of S-adenosyl-L- methionine: scoulerine-9-O-methyltransferase from cultured cells of
[79].Takemura, H., Imoto, K., Ohshika, H., Kwan, C.Y., 1996. Tetrandrine as a calcium antagonist. Clinical and Experimental Pharmacology and