- Dung dịch chuẩn phthalate nồng độ 1000 µg/mL (chuẩn bị bằng cách pha 10 mg chất chuẩn gốc với 10 mL n-hexane sạch).
- Các dung dịch chuẩn với các mức nồng độ từ cao đến thấp (500 ng/mL, 100 ng/mL, 50 ng/mL, 25 ng/mL, 10 ng/mL, 5 ng/mL và 1 ng/mL) đƣợc pha loãng lần lƣợt với dung môi n-hexane sạch từ dung dịch chuẩn phthlate nồng độ 1000 µg/mL
- Dung dịch đồng hành có nồng độ 1000 µg/mL (chuẩn bị bằng cách đem cân 10 mg chất đồng hành phthalate rồi thêm 10 mL dung môi n-hexane).
- Dung dịch các chất đồng hành d4-phthalate với các mức nồng độ: 100 µg/mL, 10 µg/mL, 1 µg/mL, 500 ng/mL, 300 ng/mL, 100 ng/ml, 50 ng/mL đƣợc pha từ dung dịch đồng hành có nồng độ 1000 µg/mL.
- Các dung dịch đƣợc ghi rõ nhãn mác và bảo quản ở -50C trong tủ lạnh. 2.4.5.Quy trình chuẩn bị mẫu trắng
Mẫu trắng đều đƣợc thực hiện ở cả pha hơi và pha hạt.
Ở pha hơi, mẫu trắng gồm 2 PUF đã đƣợc làm sạch không cho hấp thụ mẫu không khí, thêm 100 ng chất đồng hành d4-phthalate (ngoại trừ d4-DEHP là 250 ng). Ngay sau đó, tiến hành chiết lần 1 với 100 mL, lần 2 với 80 mL hỗn hợp dichloromethane (DCM) và n-hexane (3:2, v: v), mỗi lần chiết đều đƣợc lắc trên máy Orbital Shaker-SSM1 với tốc độ 250 vòng/phút trong 20 phút, toàn bộ dịch chiết đƣợc chuyển sang bình cầu và cô cạn đến khoảng 7 mL bằng máy cô quay chân không. Phần dung dịch đƣợc chuyển sang ống nghiệm nhỏ 15 mL và đƣợc cô cạn bằng dòng N2 đến 1 mLvà chuyển sang lọ nhỏ (GC vial) để tiến hành phân tích sắc ký.
Tƣơng tự đối với pha hạt, màng lọc (filter) mới chƣa qua quá trình thu mẫu đƣợc đặt trong ống nghiệm 15 ml, thêm 100 ng chất đồng hành d4-phthalate (ngoại trừ DEHP là 250 ng). Sau đó chiết bằng cách lắc với 5 mL hỗn hợp dichloromethane (DCM) và hexane (3:2, v: v) trong 5 phút. Lặp lại quá trình chiết nhƣ vậy thêm hai lần. Toàn bộ phần dịch chiết đƣợc chuyển sang ống nghiệm nhỏ
15 mL khác và dịch chiết sau đó đƣợc cô cạn bằng dòng N2 đến 1 mL và chuyển sang lọ nhỏ (GC vial) để tiến hành phân tích sắc ký.
2.5. Xử lý mẫu
2.5.1. Phthalate trên pha hơi
Với pha hơi (thu giữ trên hai PUF). Hai PUF sau khi đƣợc hấp thụ không khí đƣợc chuyển vào lọ đựng và thêm vào 100 ng chất đồng hành d4-phthalate (ngoại trừ d4-DEHP là 250 ng). Ngay sau đó, tiến hành chiết lần 1 với 100 mL, lần 2 với 80 mL hỗn hợp dichloromethane (DCM) và n-hexane (3:2, v:v), mỗi lần chiết đều đƣợc lắc trên máy Orbital Shaker-SSM1 với tốc độ 250 vòng/phút trong 20 phút, toàn bộ dịch chiết đƣợc chuyển sang bình cầu và cô cạn đến khoảng 7 mL bằng máy cô quay chân không. Phần dung dịch đƣợc chuyển sang ống nghiệm nhỏ 15 mL và đƣợc cô cạn bằng dòng N2 đến 1 mL và chuyển sang lọ nhỏ (GC vial) để tiến hành phân tích sắc ký.
2.5.2. Phthalate trên pha hạt
Với pha hạt (đã đƣợc thu giữ trên màng lọc thạch anh) sau khi thu mẫu màng lọc đƣợc cân lại để xác định khối lƣợng hạt bụi thu đƣợc sau đó đƣợc chuyển vào ống nghiệm 15 mL và cũng tƣơng tự nhƣ pha hơi, thêm 100 ng chất đồng hành d4-phthalate (ngoại trừ DEHP là 250 ng) đƣợc thêm vào ống nghiệm chứa mẫu màng lọc. Sau đó chiết bằng cách lắc với 5 mL hỗn hợp dichloromethane (DCM) và hexane (3:2, v:v) trong 5 phút. Lặp lại quá trình chiết nhƣ vậy thêm hai lần. Toàn bộ phần dịch chiết đƣợc chuyển sang ống nghiệm nhỏ 15 mL và dịch chiết sau đó đƣợc cô cạn bằng dòng N2 đến 1 mL và chuyển sang lọ nhỏ (GC vial) để tiến hành phân tích sắc ký.
2.6. Xác định các thông số của phƣơng pháp
2.6.1. Độ thu hồi và độ lặp lại của phƣơng pháp
Đây là hai yếu tố quan trọng để đánh giá hiệu quả của phƣơng pháp. Đánh giá độ thu hồi là đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp xử lý mẫu đã chọn.
Để đánh giá độ thu hồi của phƣơng pháp, chúng tôi tiến hành thêm chất đồng hành d4-phthalate với ba mức nồng độ 100, 300, 500 ng/mL đã đƣợc chuẩn
bị ở phần 2.4 trên nền mẫu trắng ở cả pha hạt (trên màng lọc thạch anh ) và pha hơi (trên PUF), tiến hành xử lý mẫu và phân tích nhƣ phần 2.5.
Mỗi mức nồng độ đều đƣợc tiến hành lặp lại 7 lần.
Độ thu hồi đƣợc tính toán theo công thức đã đƣợc trình bày ở phần 1.5.4. Độ lặp lại đƣợc thể hiện trên độ lệch chuẩn tƣơng đối đƣợc tính theo công thức đã nêu ở phần 1.5.3
2.6.2. Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp Để xác định MDL, trƣớc tiên cần phân tích mẫu (mẫu thực, mẫu thêm Để xác định MDL, trƣớc tiên cần phân tích mẫu (mẫu thực, mẫu thêm chuẩn hoặc mẫu chuẩn). MDL chính là nồng độ nhỏ nhất trong mẫu ban đầu để sau khi trải qua quá trình xử lí mẫu và tiến hành đo sắc ký cho tín hiệu nhiễu cao gấp 3 lần tín hiệu đƣờng nền. Dựa vào giá trị IDL, độ thu hồi cùng với lƣợng bụi (pha hạt), thể tích khí (pha hơi) ta tính đƣợc MDL thông qua công thức:
MDL =
V R
IDL
(%) (ng/m3) (đối với pha hơi) MDL =
m R
IDL
(%) (ng/mg) (đối với pha hạt)
Trong đó: m là khối lƣợng bụi thu đƣợc trên filter (mg) V là thể tích mẫu khí thu đƣợc (m3)
R (%) là độ thu hồi
MQL là nồng độ nhỏ nhất trong mẫu ban đầu mà khi sử dụng phƣơng pháp để phân tích có thể định lƣợng đƣợc. MDL đƣợc xác định: MQL = 3 × MDL.
2.6.3. Khoảng tuyến tính
Để xác định đồng thời mƣời phthalate trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đƣờng chuẩn bằng cách: Pha một dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ từ 1 ng/mL đến 1000 ng/mL nhƣ ở phần 2.3. Sau đó đem đo trong điều kiện đã tối ƣu hóa trƣớc đó.
2.7. Đánh giá sự thay đổi nồng độ phthalate theo nhiệt độ
Để đánh giá sự thay đổi nồng độ phthalate theo nhiệt độ môi trƣờng. Chúng tôi tiến hành thu mẫu không khí trong 8 ngày khác nhau tại cùng một vị trí trong
đều giữ nguyên. Mƣời phthalate đƣợc tiến hành phân tích theo quy trình đã đƣợc khảo sát trƣớc đó.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tối ƣu điều kiện chiết tách và phân tích sắc ký phthalate
3.1.1. Lựa chọn cột tách sắc ký
Trong điều kiện hiện có chúng tôi đã sử dụng cột cột mao quản BD-5MS của hãng Agilent, 5% diphenyl 95% dimethylpolysiloxane, dài 30 m, đƣờng kính trong 0.25 mm và độ dày màng pha tĩnh 0.25 µm, nhiệt độ tối đa là 325 o
C. mẫu đƣợc bơm ở chế độ không chia dòng với thể tích 2 µL để tách và định lƣợng các phthalate
3.1.2. Khảo sát chu trình nhiệt độ
Chƣơng trình nhiệt độ của buồng cột đƣợc thay đổi sao cho khả năng tách là tối ƣu. Chúng tôi đã khảo sát với hai chƣơng trình nhiệt độ nhƣ đã nêu ở phần 2.4.2. Kết quả cho thấy chƣơng trình 1 cho kết quả tốt hơn.
Hình 3.1. Chƣơng trình nhiệt độ buồng cột
Từ các kết quả khảo sát chúng tôi đƣa ra kết luận điều kiện tối ƣu cho phân tích phthalate nhƣ sau:
Sắc ký khí (GC-7890B) ghép nối detector khối phổ (MS-5977A) của hãng Agilent Technologies. Quá trình phân tách sắc ký đƣợc thực hiện trên cột mao
m, đƣờng kính trong 0.25 mm và độ dày màng pha tĩnh 0.25 µm). Mẫu đƣợc bơm ở chế độ không chia dòng với thể tích 2 µL. Nhiệt độ buồng cột: 80 ºC (giữ 1.0 phút) đến 180 ºC với tốc độ 12 ºC/phút (giữ 1.0 phút), tăng lên 230 ºC với tốc độ 6 ºC/phút, sau đó tăng lên 270 ºC với tốc độ 8 ºC/phút (giữ 2.0 phút), và cuối cùng tăng lên 280 ºC với tốc độ 30 ºC/phút (giữ 12.0 phút).
Sau khi khảo sát các điều kiện sắc ký, 10 chất chuẩn phthalate đƣợc tiến hành phân tích với mảnh ion nhƣ trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Các mảnh ion dùng để định lƣợng của các chất chuẩn
Chất Mảnh ion (m/z) Chất chuẩn DMP 163 DEP 149, (177) DPP 149 DiBP 149, (233) DBP 149, (233) DnHP 149, (279) BzBP 149, (206, 233) DCHP 149, (167) DEHP 149, (167, 279) DnOP 149, 279 Chất đồng hành d4-DEP, d4-DPP, d4-DiBP d4-DnHP, d4-BzBP, d4-DEHP 153 d4-DMP 167
3.1.3. Khảo sát dung môi chiết
Các dung môi chiết đƣợc thay đổi theo tỉ lệ DCM: n-hexane 3:1; 3:2; 2:1 và tiến hành nhƣ đã trình bày ở phần 2.4.3.
Dựa vào kết quả hiệu suất thu hồi để lựa chọn tỉ lệ hỗn hợp dung môi chiết, kết quả đƣợc thể hiện trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Hiệu suất thu hồi (%) khi dùng dung môi chiết ở các tỉ lệ khác nhau
Phthalate DCM : n-hexane 3:1 DCM : n-hexane 3:2 DCM : n-hexane 2:1 DMP 45 86 52 DEP 62 82 48 DBP 54 89 39 DPP 67 91 43 DiBP 52 82 31 DNHP 56 89 49 BzBP 46 92 41 DEHP 57 90 54 DCHP 48 87 61
Từ bảng số liệu trên ta thấy tỉ lệ hỗn hợp DCM: n-hexane là 3:2 cho hiệu suât thu hồi cao nhất, do đó hỗn hợp DCM: n-hexane với tỉ lệ 3:2 đƣợc chọn cho quá trình chiết phthalate trong mẫu không khí.
3.1.4. Tính đặc hiệu, độ chọn lọc của phƣơng pháp
Áp dụng các thông số của máy sau khi đã khảo sát tiến hành bơm lặp lại 7 lần trên thiết bị GC-MS tại nồng độ 500 ng/mL. Kết quả thu đƣợc thể hiện trên bảng 3.3 và sắc đồ hình 3.2.
Hình 3.2. Sắc ký đồ chất chuẩn phthalate 500 ng/mL
Từ sắc ký đồ của chất chuẩn phthalate ta có thời gian lƣu của từng phthalate nhƣ sau:
Bảng 3.3. Thời gian lƣu của phthalate
Phthalate Thời gian lƣu (phút)
DMP 8,23 DEP 9,68 DPP 11,93 DiBP 13,22 DBP 14,57 DnHP 19,72 BzBP 19,98 DCHP 21,96 DEHP 22,19 DnOP 24,25
Từ bảng 3.3 và sắc ký đồ 3.2 ở trên cho thấy với điều kiện phân tích sắc ký đã lựa chọn thì các phthalate trong hỗn hợp đã tách riêng ra khỏi nhau khá tốt. Từ đó, có thể phân tích đồng thời các phthalate trong cùng một hỗn hợp.
3.1.5. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của thiết bị
Sau khi đo sắc ký hỗn hợp dung dịch chuẩn nhƣ đã nêu trong phần 2.4.4. Với thể tích bơm mẫu là 2µL. Kết quả thu đƣợc IDL và IQL của thiết bị đƣợc thể hiện trong bảng 3.4.
Bảng 3.4. IDL và IQL của phthalate
Phthalate IDL (pg) IQL (pg)
DMP 0,32 0,96 DEP 0,33 0,99 DBP 0,32 0,96 DPP 0,65 1,95 DiBP 0,66 1,98 DNHP 0,31 0,93 BzBP 0,33 0,99 DEHP 0,32 0,96 DCHP 0,66 1,98 DnOP 0,66 1,98
3.1.6. Đƣờng chuẩn và khoảng tuyến tính
Khoảng nồng độ tuyến tính của các phthalate đƣợc xác định từ giới hạn định lƣợng đến điểm nồng độ lớn nhất của đƣờng chuẩn. Phƣơng trình đƣờng chuẩn đã đƣợc xây dựng từ các điểm chuẩn với các nồng độ 1, 5, 25, 50 , 100 , 300, 500 ng/mL cho mỗi phthalate.
Mỗi dung dịch đƣợc bơm trên hệ sắc ký 3 lần, diện tích peak trung bình thu đƣợc thể hiện ở bảng 3.5
Bảng 3.5. Sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ phthalate 1ppb 5 pbb 25 ppb 50 ppb 100 ppb 300 ppb 500 ppb DMP 1682 5098 22528 40995 82547 240755 416963 DEP 1984 4765 24667 48294 91549 284569 473589 DPP 885 5043 32061 53080 95640 310270 517117 DiBP 1140 4425 24790 41750 83261 257934 429890 DBP 2468 7581 31907 54139 107099 337282 562136 DNHP 1486 1903 13941 25577 52272 158627 264378 BzBP 948 2488 10354 25772 49992 147694 246157 DCHP 1181 6105 33090 66675 142977 413547 689245 DEHP 1127 3718 12674 21213 41009 132569 222129 DnOP 1024 2318 6415 11421 21047 71517 117528
Sử dụng phần mềm Excel ta thu đƣợc các phƣơng trình đƣờng chuẩn trong bảng 3.6.
Bảng 3.6. Phƣơng trình đƣờng chuẩn của các phthalate
Phthalate Phƣơng trình đƣờng chuẩn Hệ số tƣơng quan
DMP Y = 825,37 X + 126,25 0,9999 DEP Y = 946,47 X + 132,56 0,9995 DPP Y = 1032 X + 247,02 0,9999 DiBP Y = 858,78 X +103,22 0,9996 DBP Y = 1122 X + 274,66 0,9998 DnHP Y = 528,69 X - 65,761 0,9999 BzBP Y = 492,42 X + 48,5 0,9999 DCHP Y = 1379,8 X - 113,21 0,9999 DEHP Y = 442,57 X + 39,467 0.9996 DnOP Y = 234,88 X + 121,67 0,9992
Từ bảng trên ta có thể thấy tất cả các phƣơng trình đƣờng chuẩn của các phthalate đều có hệ số hồi quy tuyến tính (R2
) lớn hơn 0,999. Từ đó, có thể thấy máy có độ nhạy và độ lặp lại khá tốt và đạt điều kiện để phân tích cũng nhƣ tính
3.2. Chuẩn bị mẫu trắng
3.2.1. Hàm lƣợng phthalate trong PUF và filter mới
Mẫu trắng đều đƣợc thực hiện ở cả pha hơi và pha hạt. Ở pha hơi, mẫu trắng gồm 2 PUF mới mua về, PUF sau khi làm sạch không cho hấp thụ mẫu không khí, đƣợc thêm chất đồng hành và đƣợc tiến hành chiết với hỗn hợp dung môi và dịch chiết đƣợc phân tích với điều kiện sắc ký nhƣ quy trình đã đƣợc đƣa ra. Tƣơng tự đối với pha hạt, màng lọc (filter) mới chƣa qua quá trình thu mẫu cũng đƣợc thêm chất chuẩn nội và tiến hành chiết và dịch chiết cũng đƣợc phân tích với các điều kiện sắc ký giống nhƣ quy trình đã đƣa ra trong phần 2.4.5. Kết quả đƣợc thể hiện trong bảng 3.7
Bảng 3.7. Hàm lƣợng các phthalate có trong mỗi PUF mới (ng)
Lần DMP DEP DPP DiBP DBP DnHP BzBP DCHP DEHP DnOP
1 KPH KPH KPH 2,39 1,23 KPH KPH KPH 2,12 1,43 2 KPH KPH KPH 2,02 1,92 KPH KPH KPH 2,51 2,13 3 KPH KPH KPH 3,87 2,56 KPH KPH KPH 1,96 3,12 4 KPH KPH KPH 2,49 1,34 KPH KPH KPH 2,34 2,12 5 KPH KPH KPH 3,92 2,34 KPH KPH KPH 1,27 1,54 6 KPH KPH KPH 3,28 2,46 KPH KPH KPH 3,21 2,01 7 KPH KPH KPH 2,23 2,34 KPH KPH KPH 1,54 1,28 TB KPH KPH KPH 2,89 2,03 KPH KHP KPH 2,14 1,95
KPH: Không phát hiện, TB: trung bình,
3.2.2. Hàm lƣợng phthalate trong mẫu trắng
Kết quả khảo sát hàm lƣợng phthalte trong mẫu trắng nhƣ quy trình đã nêu trong phần 2.4.5 đƣợc thể hiện trong bảng 3.8
Bảng 3.8. Hàm lƣợng các phthalate có trong mẫu trắng ở pha hơi(ng)
Lần DMP DEP DPP DiBP DBP DnHP BzBP DCHP DEHP DnOP
1 3,12 2,35 KPH 3,02 1,98 KPH KPH KPH 5,25 2,54 2 2,24 1,93 KPH 3,07 2,02 KPH KPH KPH 5,34 2,51 3 3,21 2,26 KPH 2,89 2,06 KPH KPH KPH 4,98 2,65 4 3,15 2,39 KPH 2,76 1,95 KPH KPH KPH 5,39 2,58 5 2,62 1,98 KPH 3,12 2,11 KPH KPH KPH 5,28 2,49 6 2,68 2,29 KPH 3,19 2,09 KPH KPH KPH 5,35 2,52 7 3,21 2,83 KPH 2,94 2,17 KPH KPH KPH 5,27 2,63 TB 2,89 2,29 KPH 3,00 2,05 KHP KPH KPH 5,27 2,56
KPH: Không phát hiện, TB: trung bình
Qua 7 lần tiến hành thí nghiệm đều cho kết quả là trong các màng lọc thạch anh hàm lƣợng phthalate rất nhỏ, hầu nhƣ không có. Tuy nhiên, trong các PUF kể cả mới mua về vẫn chứa một số phthalate. Điều này cho thấy việc làm sạch các PUF và xác định các phthalate có trong mẫu trắng (gồm cả độ sạch của PUF và dung môi, dụng cụ) là cần thiết trƣớc khi tiến hành thu mẫu. Kết quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu trƣớc [26]. Các giá trị phthalate báo cáo đều đƣợc trừ lƣợng phthalate trung bình có trong mẫu trắng.
3.2.3. Đánh giá sự thay đổi nồng độ phthalate khi nhiệt độ thay đổi
Kết quả nồng độ phthalate trong mẫu không khí qua 8 ngày khác nhau tại cùng một vị trí trong nhà ở số 1 đƣợc thể hiện trong bảng 3.9.
Bảng 3.9. Nồng độ phthalate trong không khí ở các nhiệt độ khác nhau
Ngày Phthalate trong không
khí (ng/m3) Nhiệt độ ( 0C) 1 1093 25 1123 25 2 893 23 976 23 3 1156 26 1178 26 4 1221 27 1219 27 5 1248 28 1274 28 6 1226 28 1278 28 7 1324 29 1297 29 8 1402 31 1389 31
Để kiểm tra nồng độ phthalate có bị thay đổi đáng kể khi nhiệt độ môi trƣờng thay đổi hay không, chúng tôi sử dụng phần mềm Minitab ANOVA, kết quả thể hiện trong phụ lục 2, ta thu đƣợc PValue < 0.05, kết luận nhiệt độ khác nhau làm cho nồng độ phthalate cũng khác nhau. Nhìn vào đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc nồng độ phthalate trong không khí (hình 3.3) ta nhận thấy khi nhiệt độ càng tăng thì nồng độ phthalate càng tăng.
Hình 3.3. Sự phụ thuộc nồng độ phthalate trong không khí vào nhiệt độ 3.3. Xác định các thông số của phƣơng pháp