3. Nội dung nghiên cứu
1.3.3.3. Các đường hướng trong nhân giống in vitro
Quá trình thực hiện, nhân giống in vitro sẽ tạo ra các dịng vơ tính. Theo
đĩ, dịng vơ tính là một nhĩm cá thể cĩ kiểu gen tương tự nhau, chúng được nhân bằng sinh sản vơ tính. Trong nuơi cấy in vitro, các dịng vơ tính này sẽ được tạo ra theo hai đường hướng chính: (i) Tái sinh cây trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng, phơi, ngọn chồi, chồi nách; (ii) Tái sinh cây gián tiếp thơng qua giai đoạn hình thành mơ sẹo.
Tái sinh trực tiếp từ mẫu nuơi cấy là quá trình phát động những điểm tồn tại sẵn cĩ trong mơ nuơi cấy phân chia và tái sinh thành cây. Xét về nguồn gốc các cây này cĩ thể phát sinh từ chồi đỉnh, chồi nách phá ngủ hoặc từ chồi mới phát sinh. Các cây con này, được phát sinh từ các đỉnh sinh trưởng cĩ bộ nhiễm sắc thể 2n, hồn tồn đồng nhất về mặt di truyền và duy trì được các tính trạng của cây mẹ. Tái sinh trực tiếp cũng cĩ thể xuất phát từ những tế bào khơng nằm trên đỉnh sinh trưởng đĩ là các đoạn thân, mảnh lá, cuống lá, mảnh hoa….Trong trường hợp này, các tế bào thường phân chia nhưng khơng hình thành các tế bào mơ sẹo mà tạo thành các điểm sinh trưởng phụ sau đĩ tái sinh thành cây con. Xác xuất biến dị và đột biến thường cao hơn so với tái sinh từ ở trường hợp nĩi trên [22].
Nghiên cứu khả năng tái sinh chồi và cụm chồi trong nuơi cấy in vitro
cây Hà thủ ơ đỏ (Polygonum multiflorunb.) theo cách sử dụng những đoạn thân
mang một mắt của cây Hà thủ ơ trưởng thành ngồi tự nhiên, đầu tiên đoạn thân
được khử trùng bằng cồn 70o
trong 30 giây, sau đĩ dùng NaClO 0,5% khử trùng trong 10 phút, rồi cấy trên mơi trường MS cơ bản cĩ bổ sung BAP 4mg/l và NAA 0,1mg/l nhằm kích thích đoạn thân tạo cụm chồi. Các chồi đơn được tách từ cụm chồi in vitro và tạo rễ trên mơi trường MS cĩ bổ sung NAA 0,5 mg/l.
Kết quả tạo ra những cây hà thủ ơ con cĩ đặc điểm giống cây mẹ từ nuơi cấy in
Theo con đường tái sinh gián tiếp, mẫu cấy khi nuơi cấy trong mơi trường thích hợp cĩ chứa auxin và cytokinin cĩ thể đem lại sự
khơng tổ chức đĩ chính là các tế bào mơ sẹo. Trong nuơi cấy, sự tăng sinh này cĩ thể được duy trì nhiều hay ít là khơng hạn định, chỉ cần mơ sẹo được cấy chuyển sang mơi trường mới theo chu kỳ. Tuy nhiên, tế bào mơ sẹo khi cấy chuyển nhiều lần sẽ khơng ổn định về mặt di truyền. Để tránh tình trạng này nên sử dụng các mơ sẹo vừa mới phát sinh. Nuơi cấy mơ sẹo cĩ vai trị vơ cùng quan trọng trong cơng nghệ sinh học thực vật. Tỷ lệ auxin và cytokinin trong mơi trường cĩ thể dẫn tới sự phát triển của ngọn, rễ hay phơi soma từ đĩ cĩ thể tạo thành cây hồn chỉnh. Nuơi cấy mơ sẹo cũng cĩ thể được sử dụng để mở đầu nuơi cấy tế bào dịch huyền phù hay tạo ra hạt nhân tạo [7].
Để cĩ thể thực hiện nuơi cấy cĩ kết quả tốt, dù bằng con đường nào đi chăng nữa cũng cần chú ý tới các yếu tố ảnh hưởng tới nuơi cấy vì chính các yếu tố này quyết định đường hướng vơ tính cũng như chất lượng của cây giống thu được.
Nhân giống in vitro cây Mỏ quạ được tiến hành thơng qua sự hình thành
mơ sẹo, mơ sẹo tạo phơi vơ tính và cây con là một minh chứng của con đường tái sinh gián tiếp. Theo đĩ, mơ sẹo được hình thành trên mơi trường MS bổ sung 2,4D nồng độ 0,5, 1,0 và 1,5 mg/l kết hợp với BAP. Mơ sẹo cĩ khả năng phát sinh phơi vơ tính, tạo cây con trên mơi trường cĩ sự kết hợp 2 BAP mg/l và NAA 0,05 và 0,1 mg/l [4].
Theo Nguyễn Thị Lý Anh và Đinh Thị Phịng (2007), quá trình nhân giống in
vitro bao gồm 5 bước [1].
Bước thứ nhất: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ. Trong bước này phải chọn cây mẹ sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện mơi trường thích hợp với chế độ chăm sĩc và phịng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi cấy mẫu sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống, sinh trưởng của mẫu nuơi cấy.
Bước thứ hai: Nuơi cấy khởi động, đây là giai đoạn khử trùng đưa các mẫu
vật, cấy mẫu vào ống nghiệm hoặc bình nuơi cấy cĩ sẵn mơi trường nhân tạo. Yêu cầu ở giai đoạn này phải cĩ tỷ lệ mẫu nhiễm thấp, tỷ lệ mẫu sống cao, mẫu sinh trưởng và phát triển tốt. Sau một thời gian nhất định, từ mẫu nuơi cấy bắt đầu xuất hiện các cụm tế bào hoặc cơ quan (chồi, cụm chồi, rễ) hoặc các phơi vơ tính cĩ đặc tính gần như phơi hữu tính. Sau một thời gian nhất định tuỳ thuộc vào loại cây, mẫu cấy đĩ được chuyển sang giai đoạn tiếp theo.
Bước thứ ba: Bước nhân nhanh. Khi mẫu cấy sạch đã được tạo ra, từ đĩ nhân lên thành các cụm chồi hoặc các phơi vơ tính. Giai đoạn này cần tạo ra tốc độ nhân nhanh cao nhất trong điều kiện nuơi cấy. Vì vậy, thành phần và điều kiện mơi trường phải được tối ưu nhằm đạt được mục tiêu nhân nhanh.
Quy trình cấy chuyển nhân nhanh thường diễn ra trong khoảng từ một đến hai tháng tháng tuỳ loại cây. Tỷ lệ nhân nhanh sau mỗi lần cấy chuyển đạt khoảng 2 - 8 lần cấy chuyển. Giai đoạn nhân nhanh chồi từ một vài chồi ban đầu khơng nên kéo dài quá lâu để tránh biến dị soma.
Kết quả nhân nhanh chồi cây Chuối cho thấy, từ một chồi cây Chuối chọn lọc ban đầu người ta chỉ nên nhân khoảng 2000 đến 3000 chồi cây mới sau 7 - 8 lần cấy chuyển sẽ hạn chế được sự xuất hiện biến dị soma [20].
Các chồi nhân nhanh cần được chuyển sang mơi trường tạo rễ để tái sinh thành cây hồn chỉnh
Bước 4: Tạo cây in vitro hồn chỉnh
Các chồi hình thành trong quá trình nuơi cấy cĩ thể phát rễ tự sinh nhưng thơng thường các chồi này phải được cấy chuyển sang một mơi trường khác để kích thích tạo rễ. Ở một số lồi khác thì các chồi sẽ tạo rễ khi được chuyển trực tiếp ra đất. Giai đoạn này trong vịng từ 2 - 8 tuần. Sau khi cây đã được tái sinh hồn chỉnh sẽ được đưa trở về điều kiện tự nhiên để sản xuất đại trà.
Bước 5: Thích ứng cây in vitro ngồi điều kiện tự nhiên
nghiệm ra thích ứng với điều kiện mơi trường ngồi tự nhiên. Cây cần được chăm sĩc cẩn thận để đạt tỷ lệ sống cao. Giai đoạn này địi hỏi từ 4 - 16 tuần tuỳ từng đối tượng nghiên cứu [1].
Hiện nay chưa cĩ cơng trình nghiên cứu nào cơng bố nhân giống in vitro
thành cơng trên cây Thất diệp nhất chi hoa . Tuy nhiên đã thành cơng trên nhiều đối tượng cây trồng khác nhau, trong đĩ cĩ một số cây dạng thân củ, ví dụ như nghiên cứu của Nguyễn Quang Thạch và cs (2010) đã tạo được giống cây Khoai mơn sọ từ kỹ thuật nuơi cấy in vitro theo cách: Khử trùng mẫu củ Khoai mơn sọ
bằng dung dịch HgCl2 0,1% trong 15 phút sau đĩ ngâm mẫu vào dung dịch
Johson trong 15 phút. Tạo tỷ lệ mẫu sạch bệnh đạt 66,67% - 88,67%. Các mắt ngủ được cắt thành những tế bào lớp mỏng, nhân nhanh trên nền mơi trường MS cĩ bổ sung TDZ 1,5mg/l cho hệ số nhân giống của các thí nghiệm tăng từ
8,07 đến 9,12 lần. Cây Khoai mơn sọ in vitro ra rễ hiệu quả trên mơi trường MS
cơ bản [16].
Dựa trên những thành tựu nghiên cứu đã thành cơng bước đầu nghiên cứu
nhân giống in vitro cây Thất diệp nhất chi hoa tạo nền tảng nhằm phục vụ cho
Chƣơng 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu
Mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa thu thập từ các tỉnh Lào Cai, Hà Giang, Lạng Sơn được sử dụng làm vật liệu nghiên cứu.
C rpoC1-1f/rpoC1-3r do phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Cơng nghệ Sinh học Việt Nam cung cấp. Cặp mồi cĩ trình tự nucleotide như sau:
rpoC1-1f: 5’-GTGGATACACTTCTTGATAATGG-3’; rpoC1-3r: 5’-TGAGAAAACATAAGTAAACGGGC-3’
2.1.2. Hĩa chất, thiết bị
2.1.2.1. Hĩa chất
Sử dụng hĩa chất cĩ nguồn gốc rõ ràng, đặc biệt là các hĩa chất dùng trong sinh học phân tử của các hãng cĩ uy tín, Fermentas (Đức) như: CTAB, SDS, EDTA, Tris-HCl, Trung Quốc như: NaCl, sodium acetate, Merck (Đức) như: ethanol, agarose, ethidium bromide.
- Mơi trường nuơi cấy cơ bản là mơi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) cĩ bổ sung thạch agar (8,5g/lít), đường (30g/lít) và các chất kích thích sinh trưởng với nhiều nồng độ khác nhau, pH mơi trường được điều chỉnh tới
5,8 và khử trùng dưới áp suất 1,2atm ở nhiệt độ 1210C trong 22 phút.
2.1.2.2. Thiết bị
Box cấy, nồi hấp khử trùng, máy sấy, cân điện tử, bình tam giác cĩ kích thước từ 250 đến 500ml, pipet, dụng cụ nuơi cấy…Các hĩa chất và thiết bị cần thiết phục vụ cho quá trình nghiên cứu nuơi cấy mơ tại phịng cơng nghệ tế bào thuộc khoa Sinh học, trường Đại học sư phạm Thái Nguyên.
Các thí nghiệm phân lập gen, được tiến hành trên trang thiết bị của phịng Cơng nghệ DNA ứng dụng, phịng cơng nghệ tế bào thực vật và phịng thí nghiệm trọng điểm cơng nghệ gen, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và cơng nghệ Việt Nam.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp thu thập mẫu
Thu thập mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa trong tự nhiên, mơ tả và chụp ảnh.
2.2.2. Phương pháp bảo tồn cây Thất diệp nhất chi hoa tại Thái Nguyên
Số cây con sau khi thu được đưa về trồng tại vườn ươm của trường Đại học sư phạm Thái Nguyên,
Thí nghiệm 1. Trồng cây tại vườn ươm của trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên. Tổng số 26 cây được bố trí trồng trên 2 luống, mỗi luống chia làm 2 hàng cách nhau 40cm, cây cách cây 40cm, tưới nước ngày 1 lần vào buổi chiều.
Thí nghiệm 2. Trồng cây trong phịng sinh trưởng cây in vitro của phịng cơng nghệ tế bào. Mỗi cây trồng 1 chậu. Mỗi chậu cĩ kích thước rộng 30cm, cao
30cm. Nhiệt độ 25oC ±2. Độ ẩm 50 - 70%. Chiếu sáng 12 giờ/ngày.
Các chỉ tiêu theo dõi được mơ tả theo thứ tự ở bảng 3.5 Đánh giá kết quả ngồi vườn ươm.
Tỉ lệ cây sống Tỷ lệ cây chết
Chiều cao trung bình/cây (cm) Số lá/cây (cm)
Chiều rộng lá/cây (cm) Chiều dài lá/cây (cm) Số gân/lá
2.2.3. Phương pháp phân lập gen rpoC1
Lá non của cây Thất diệp nhất chi hoa thu thập tịa huyện Bình Gia – Lạng Sơn. Được sử dụng để tách chiết DNA tổng số theo phương pháp CTAB của Doyle.JJ (1987) [30]. DNA tổng số được định tính và định lượng bằng phương pháp quang phổ kế và điện di trên gel agarose 1%. DNA được tinh sạch theo bộ
Kit GenJET PCR Purification của hãng Thermo Scientific và hướng dẫn của nhà sản xuất.
Gen rpoC1 được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu
rpoC1-1f/rpoC1-3r theo chu trình nhiệt như sau: 94oC - 4 phút; lặp lại 35 chu kì
o
C - 30 giây, 55oC - 40 giây, 72oC - 40 giây); 72oC - 10 phút và giữ ở 4oC. Thành phần phản ứng PCR bao gồm: master mix (2X) - 7,5 μl, mồi xuơi (10pmol/μl) - 0,5 μl, mồi ngược (10 pmol/μl) - 0,5μl, DNA khuơn (10ng/μl)- 0,5 μl. Tổng thể tích phản ứng - 15μl.
2.2.4. Phương pháp nuơi cấy in vitro
- Phương pháp lấy mẫu: Cây được lựa chọn để lấy mẫu là những cây sinh trưởng khoẻ khơng bị sâu .
Tạo nguồn vật liệu ban đầu
+ Rửa mẫu (hạt, lá, củ) nhiều lần bằng nước sạch, tránh làm dập mẫu. + Ngâm trong nước xà phịng lỗng 1% khoảng 5 - 7 phút.
+ Tiếp tục rửa mẫu bằng nước sạch nhiều lần
+ Chuyển mẫu vào bình tam giác và tráng lại nhiều lần bằng nước cất vơ trùng trước khi khử trùng với hĩa chất.
Thí nghiệm 3. Khử trùng hạt bằng 3 loại hĩa chất
CT 1: Javen nồng độ 65% trong 15 phút và 75% trong 10 phút.
CT 2: HgCl2 nồng độ 0,1% trong 5 phút, 8 phút.
CT 3: Khí clo (HCl và javen theo tỉ lệ 4 : 20ml) trong 16 giờ.
Thí nghiệm 4. Khử trùng củ bằng cách kết hợp cồn, javen và HgCl2
CT 1: cồn 70% trong 3 phút sau đĩ sử dụng javen 7% trong 3phút, tiếp
đến dùng HgCl2 0,1% trong 4 phút.
CT 2: cồn 70% trong 3 phút, sau đĩ sử dụng javen 7% trong 5 phút tiếp
CT 3: cồn 70% trong 3 phút sau đĩ sử dụng javen7% trong 7 phút tiếp
đến dùng HgCl2 0,1% trong 6 phút.
CT 4: cồn 70% trong 3 phút sau đĩ sử dụng javen 7% trong 9 phút tiếp
đến dùng HgCl2 0,1% trong 8 phút.
Thí nghiệm 5. Khử trùng lá bằng:
Cơng thức 1: javen 7% trong 10 phút Cơng thức 2: javen 7% trong 15 phút.
Cơng thức 3: cồn 70% trong 1 phút sau đĩ sử dụng javen 20% 10 phút tiếp
đến dùng HgCl2 0,1% trong 5 phút.
Nhân nhanh chồi cây Thất diệp nhất chi hoa
Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của GA3 đến sự nảy mầm của hạt.
Hạt cấy trên mơi trường MS cĩ bổ sung GA3 nồng độ từ 0,3 đến 1,9 mg/l, mỗi bậc cách nhau 0,2mg/l.
Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của BAP đến sự nảy mầm của hạt
Hạt cấy trên mơi trường MS cĩ bổ sung BAP nồng độ từ 1,0 đến 5mg/l, mỗi bậc cách nhau 0,5ml.
Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của các ĐHST đến sự phát sinh hình thái của lá Hạt cấy trên mơi trường MS cĩ bổ sung
Cơng thức 1: 2,4-D nồng độ từ 1,0 đến 4 mg/l bước nhảy 0,5mg/l. Cơng thức 2: BAP nồng độ từ 1,0 đến 4mg/l bước nhảy 0,5mg/l. Cơng thức 3: IBA nồng độ từ 1,0 đến 4mg/l bước nhảy 0,5mg/l.
Thí nghiệm 9: Ảnh hưởng của các chất ĐHST đến sự phát sinh hình thái của tế bào lớp mỏng
Củ của cây Thất diệp nhất chi hoa sau khi khử trùng được cắt thành từng lát mỏng theo kích thước khoảng 0,5 x 1cm dày khoảng 0,2cm và được cấy trên mơi trường MS cơ bản cĩ bổ sung :
Cơng thức 1: IBA nồng độ từ 0,2 đến 1,4 bước nhảy 0,2 mg/l Cơng thức 2: 2,4-D nồng độ từ 0,2 đến 1,4 bước nhảy 0,2 mg/l
Thí nghiệm 10: Ảnh hưởng của các ĐHST đến sự phát sinh hình thái của củ.
Cơng thức 1: MS cơ bản
Cơng thức 2: MS + BAP (0; 0,5; 1; 2 mg/l)
Cơng thức 3: MS + BAP (0; 0,5; 1 mg/l) + than hoạt tính.
2.2.5. Phương pháp xử lí số liệu
Các số liệu phân tích được thực hiện trên máy tính theo chương trình excel. Các cơng thức so sánh được tiến hành theo phương pháp kiểm tra sự sai khác giữa các giá trị trung bình bằng phép ước lượng, đọc kết quả dựa vào bảng ANOVA
Trình tự nucleotit của rpoC1 được phân tích, so sánh bằng các phần mềm
Bioedit, BLAST, ClustalW, DNA star.
2.3. Địa điểm tiến hành thí nghiệm
Các thí nghiệm trên được tiến hành tại khoa Sinh học của trường Đại học sư phạm Thái Nguyên. Phịng Cơng nghệ DNA ứng dụng, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và cơng nghệ Việt Nam.
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả thu thập mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa tại một số tỉnh miền núi phía Bắc của Việt Nam núi phía Bắc của Việt Nam
Xuất phát từ những thơng tin ban đầu về sự đa dạng và rộng khắp của cây Thất diệp nhất chi hoa , chúng tơi tiến hành khảo sát và thu thập mẫu tại 3 tỉnh Lạng Sơn, Hà Giang và Lào Cai. Kết quả nghiên cứu nhằm bổ sung các thơng tin về đặc điểm sinh trưởng của cây Thất diệp nhất chi hoa ở khu vực miền núi phía bắc Việt Nam.
3.1.1. Đặc điểm mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa thu thập tại huyện Bình Gia- Lạng Sơn