3. Nội dung nghiên cứu
3.4.2. Kết quả thăm dị mơi trường nảy mầm và phát sinh hình thái của các mẫu
nghiên cứu
Từ những năm 50 của thế kỷ XX, người ta đã nhận thấy vai trị của nhĩm cytokinin cĩ ảnh hưởng rõ rệt và đặc trưng lên sự phân hĩa các cơ quan của thực vật đặc biệt là sự phân hĩa chồi. Vì vậy, để tăng hệ số nhân, người ta đã sử sụng thêm một số chất cĩ trong nhĩm cytokinin trong mơi trường nuơi cấy.
3.4.2.1. Kết quả thăm dị mơi trường nảy mầm của hạt
a. Ảnh hưởng của GA3 đến hệ số nảy mầm của hạt
GA3 là một loại của gibberellin cĩ cơng thức hĩa học là C19H22O6. Gibberellin kích thích sự nảy mầm của hạt, nảy chồi của các mầm, do đĩ nĩ cĩ tác dụng trong việc phá bỏ trạng thái ngủ nghỉ của cây [63]. Theo kinh nghiệm thực tiễn của người dân, hạt Thất diệp nhất chi hoa cĩ thời gian ngủ dài, sau khi thu hoạch hạt đem gieo trồng thì sau 5 - 8 tháng hạt mới nảy mầm. Chính vì vậy, chúng tơi đã sử dụng hạt cây Thất diệp nhất chi hoa cấy trên mơi trường
MS cơ bản cĩ bổ sung GA3 nồng độ từ 0,3mg/l đến 1,9 mg/l để thăm dị mơi
trường nảy mầm của hạt. Tuy nhiên, sau 05 tuần theo dõi nhận thấy hạt khơng cĩ bất kỳ sự thay đổi nào của hạt.
b. Ảnh hưởng của BAP đến sự biến đổi của hạt
BAP là một chất kích thích sinh trưởng thuộc nhĩm cytokinin được sử dụng thơng dụng, nên trong nghiên cứu chúng tơi chọn cấy hạt trên mơi trường MS cĩ bổ sung BAP để khảo sát khả năng nảy mầm ở cây Thất diệp
nhất chi hoa ở các theo thí nghiệm 7. Sau 04 tuần nuơi cấy cũng khơng nhận thấy sự thay đổi nào của hạt.
3.4.2.2. Kết quả thăm dị mơi trường phát sinh hình thái mơ lá
Quá trình tái sinh của cây in vitro cĩ thể thơng qua con đường trực tiếp
hoặc gián tiếp qua giai đoạn mơ sẹo. Với mục tiêu tạo ra các khối mơ sẹo từ lá, chúng tơi đã bổ sung vào mơi trường nuơi cấy các chất kích thích sinh trưởng loại 2,4D, IBA và BAP nồng độ từ 1mg/l đến 4mg/l, bước nhảy 0,5mg/l. Sau 03 tuần theo dõi mẫu lá cĩ bổ sung 2,4-D nhận thấy mẫu lá bị mất màu diệp lục chuyển sang màu vàng, cịn mẫu lá cĩ bổ sung BAP và IBA chuyển dần sang vàng và chết đen.
Như vậy, cả ba loại auxin ở những nồng độ trên đều khơng cĩ tác dụng kích thích hình thành mơ sẹo và tạo chồi ở lá cây Thất diệp nhất chi hoa hình 3.11
Hình 3.11. Ảnh hƣởng của chất ĐHST đến sự phát sinh hình thái mơ lá.
3.4.2.3. Kết quả thăm dị mơi trường biến đổi của tế bào lớp mỏng từ củ
Xuất phát từ những thành cơng của các cơng trình nghiên cứu nuơi cấy tế bào lớp mỏng cây khoai mơn sọ [19] và cây Sâm ngọc linh [28]. Chúng tơi tiến hành tạo tế bào lớp mỏng cắt ngang từ củ cây Thất diệp nhất chi hoa. Các lát cắt mỏng cĩ kích thước rộng 0,5cm, dài 1cm và dày 0,2cm, Cấy trên mơi trường MS cơ bản cĩ bổ sung kích thích sinh trưởng IBA, 2,4-D, ở các nồng độ từ 0,2mg/l đến 1,4mg/l bước nhảy giữa mỗi nồng độ là 0,2mg/l. Sau 08 tuần nuơi cấy, các mơ nuơi cấy cũng khơng cĩ hiện tượng tạo mơ sẹo hay tạo đa chồi xuất hiện. Sau 08 tuần các mảnh mẫu cĩ hiện tượng úa dần và chết hình 3.12.
Hình 3.12. Mẫu sạch từ củ cây Thất diệp nhất chi hoa trên mơi trƣờng MS cĩ bổ sung thêm các chất kích thích sinh trƣởng
3.4.2.4. Kết quả thăm dị mơi trường biến đổi của chồi củ nguyên vẹn
Sau khi thực hiện với phương pháp nuơi cây tế bào lớp mỏng trên khơng thu được kết quả mong muốn. Chúng tơi đã chuyển sang phương pháp nuơi cấy giữ nguyên phần thân củ, sau khi thu mẫu củ sạch chúng tơi tiến hành chuyển tổng số 21 mẫu sang mơi trường cĩ bổ sung BAP nồng độ từ 0,5mg/l đến 2,0 mg/l. Kết quả theo dõi sau 30 ngày, chúng tơi thu được kết quả ở bảng 3.9.
Bảng 3.10. Ảnh hƣởng của các chất ĐHST đến hệ số nảy mầm của củ Cơng thức Nồng độ Số mẫu Tỷ lệ bật chồi
BAP
0,5 4 1
1,0 4 0
2,0 4 0
BAP + than hoạt tính 0,5 4 1 1,0 5 0 ĐC BAP 2,4D IBA
Bảng số liệu 3.10 cho ta thấy, đã thu được 02 mẫu nuơi cấy trên mơi trường cĩ bổ sung BAP ở nồng độ 0,5mg/l đã bật chồi, tuy nhiên qua quan sát tơi nhận thấy mẫu cĩ bổ sung thêm than hoạt tính củ ra chồi và phát triển nhanh hơn mẫu khơng cĩ bổ sung than hoạt tính, tính từ thời điểm bật chồi trong 30 ngày mẫu cĩ bổ sung than hoạt tính cĩ chiều cao hơn 7cm, trong khi đĩ mẫu khơng cĩ than hoạt tính chỉ đạt chiều cao chồi 1,5cm, cịn lại 05 mẫu MS cơ bản làm đối chứng khơng nhận thấy cĩ sự thay đổi nào.
So với các thí phương pháp nghiệm trên khi sử dụng chất kích thích sinh trưởng trên mảnh lá, hạt, hay củ lát mỏng đều nhận thấy cĩ biệu hiện của sự sống, thì phương pháp thí nghiệm nuơi cấy thân củ trên mơi trường MS cơ bản cĩ bổ sung BAP nồng độ 0,5mg/l và bổ sung than hoạt hoạt tính là hiệu quả nhất.
Hình 3.13. Mẫu củ bật chồi cĩ bổ sung BAP 0,5mg/l + Than hoạt tính
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. KẾT LUẬN
1. Cây Thất diệp nhất chi hoa cĩ mặt ở 3 tỉnh Lạng Sơn, Hà Giang và Lào Cai của Việt Nam cĩ dạng dị thảo từ hai đến tám lá.
2. Cây Thất diệp nhất chi hoa cĩ thể nhân giống vơ tính tại Thái Nguyên
trên giá thể hỗn hợp đất và cát theo tỷ lệ 1:1, trong điều kiện nhiệt độ 25oC ± 2, độ ẩm 50% - 70%.
3. Hạt trưởng thành của cây Thất diệp nhất chi hoa khử trùng bằng hỗn
hợp HCl và javen với tỉ lệ 4 : 20ml trong 16 giờ, thu được 90% mẫu sạch; Lá được khử trùng bằng javen 7% trong 15 phút thu được 65% mẫu sạch; Củ khử trùng bằng hỗn hợp javen 70% trong 7 phút + HgCl 0.1% trong 6 phút thu được 60% mẫu sạch.
Mơi trường nuơi cấy thân củ gồm MS cơ bản + BAP 0,5mg/l + than hoạt tính đã thu được 02 mẫu bật chồi trong ống nghiệm
4. Sử dụng cặp mồi đặc hiệu rpoC1-1f/rpoC1-3r đã khuếch đại thành
cơng gen rpoC1 từ DNA cây Thất diệp nhất chi hoa . Gen rpoC1 cĩ kích thước
558 nucleotide. Trình tự nucleotit gen rpoC1của cây Thất diệp nhất cho hoa cĩ
mối quan hệ gần gũi nhất với lồi Paris verticillata voucher (độ tương đồng 99% ).
2. ĐỀ NGHỊ
1. Tiếp tục nhân giống vơ tính cây Thất diệp nhất chi hoa nhằm lưu giữ và
phát triển nguồn gen cây thuốc quý.
2. Tiếp tục nghiên cứu giám định mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa thu thập
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu Tiếng Việt
1. Nguyễn Thị Lý Anh, Đinh Thị Phịng (2007), Cơng nghệ nuơi cấy mơ, NXB
Nơng nghiệp Hà Nội.
2. Lê Trần Chấn, Trần Ngọc Ninh, Trần Thị Thúy Vân (2013), “Đa dạng sinh
học và giải pháp bảo, phát triền bền vững vùng núi đá vơi ở tỉnh Hà Giang”, Hội thảo khoa học và diễn đàn đầu tư Vì Hà Giang phát triển, 115-120.
3. Lê Thị Kim Đào, Lê Thị Hạnh, Huỳnh Xuân Trường, Đỗ Thị Thu Hiền,
Đồn Minh Hải (2002), “Nghiên cứu thử nghiệm nhân một số cây trồng rừng bằng phương pháp nuơi cấy mơ (bạch đàn E. urophylla, cây hồng, giổi xanh, trầm hương)”, Trung tâm ứng dụng tiến bộ khoa học kỹ thuật
Bình Định, Báo cáo tổng kết khoa học và kỹ thuật dự án SXTN KC.04-
DA9, 9-11.
4. Lê Hồng Giang và Nguyễn Bảo Tồn (2011), “Sự hình thành mơ sẹo, phơi
và cây con ở cây Mỏ quạ in vitro (Dischidia Raflesiana Wall)”, Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ, 20a 61-67.
5. Mai Thị Phương Hoa, Đỗ Tiến Vinh (2012), “Thực hành nuơi cấy mơ tế bào
thực vật”, Tạp trí Khoa học Trường Đại học Nguyễn Tất Thành, 2-13.
6. Lê Thị Thanh Hương, Trần Thị Ngọc Anh, Nguyễn Thị Ngọc Yến, Nguyễn
Trung Thành, Nguyễn Nghĩa Thìn (2012), “Thực trạng các lồi cây thuốc
quý hiếm tại tỉnh Thái Nguyên”, Tạp chí Khoa học Đại học Quốc gia Hà
Nội, Khoa học Tự nhiên và Cơng nghệ, 28:173-194.
7. Hồng Thị Kim Hồng (2011), nghiên cứu khả năng tái sinh chồi và cụm
chồi trong nuơi cấy in vitro cây Hà thủ ơ đỏ (Polygonum multiflorunb.),
Tạp chí khoa học, Đại học Huế, 64(1), 23-32.
8. Dương Cơng Kiên (2002), Nuơi cấy mơ thực vật, NXB Đại Học Quốc Gia
9. Đỗ Tất Lợi (2014), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Hồng Đức. 10. Mai Xuân Lương, Nguyễn Văn Kết (1994), “Ứng dụng nuơi cấy mơ trong nhân
giống cây cẩm chướng”, Tạp chí khoa học, Đại học tổng hợp Đà Lạt, 7-11.
11. Phan Lê, Lê Quý Ngưu, Tú Văn Lương (2002), Cây thuốc phịng trị ung
thư, NXB Thuận Hĩa, Huế.
12. Trần Đình Long (1996), Chiến lược bảo tồn và sử dụng nguồn tài nguyên di
truyền cây trồng Việt Nam, Tài nguyên di truyền thực vật Việt Nam, NXB
Nơng nghiệp Hà Nội, 54-61.
13. Vũ Triệu Mân (1986), Bệnh virus hại khoai tây, NXB khoa học Hà Nội.
14. Trần Văn Minh, Bùi Thị Tường Thu (2007), “Ứng dụng cơng nghệ tế bào thực vật bảo tồn nguồn gen lát hoa Cơn Đảo (Chukrasia taburais A. Juss)”, Hội nghị Khoa học và Cơng nghệ - Viện Sinh học Nhiệt Đới, 367- 371.
15. Nguyễn Thị Quỳnh (2005), “Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố mơi trường lên sự tăng trưởng của một số cây thân gỗ nhiệt đới và cận nhiệt đới
trong điều kiện nuơi cấy in vitro”, Hội nghị tổng kết NCCB trong KHTN khu
vực phía Nam, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, 42 - 44.
16. Mai Thị Tân (1993), “Phục tráng giống khoai tây Thường Tín bằng phương
pháp nuơi cấy đỉnh sinh trưởng”, Kết quả nghiên cứu khoa học khoa trồng
trọt, Trường Đại học Nơng Nghiệp 1, NXB Hà Nội, Tr 90 - 94.
17. Nguyễn Thị Tần (2013), “Cây dược liệu - lợi thế để người dân vùng cao Lào
Cai thốt nghèo”, Tạp chí kinh tế kỹ thuật Lào Cai:24: 455.
18. Hồng Minh Tấn, Vũ Quang Sáng, Nguyễn Kim Thanh, (2004), Sinh lý thực
vật, NXB Đại học Sư phạm Hà Nội.
19. Nguyễn Quang Thạch, Đào Huy Chiên, Đỗ Thị Bích Nga (2010), Kết quả
nghiên cứu nhân giống khoai mơn sọ bằng phương pháp in vitro, Kết quả
nghiên cứu khoa học cơng nghệ 2006 - 2010, Viện Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam, NXB Nơng nghiệp Hà Nội, 573 - 580.
Hùng (1993) “Nhân Giống chuối bằng phương pháp cấy mơ”, NXB Nơng nghiệp, TP Hồ Chí Minh.
21. Trung tâm nghiên cứu Tài nguyên và Mơi trường Đại học Quốc gia Hà Nội, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật - Trung tâm Khoa học tự nhiên và
Cơng nghệ Quốc gia (2001-2005), Danh lục các lồi thực vật Việt Nam,
tập 1-3, NXB Nơng nghiệp, Hà Nội.
22. Nguyễn Văn Uyển (1985), Ứng dụng nuơi cấy mơ tế bào thực vật trong
cơng tác chọn giống cây trồng, NXB TP. Hồ Chí Minh.
23. Đỗ Năng Vịnh (2002), Cơng nghệ sinh học cây trồng, NXB Nơng Nghiệp Hà Nội.
24. Viện Khoa học và Cơng Nghệ Việt Nam, Sách đỏ Việt Nam, 2007.
25. Viện dược liệu (2003), “Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam”, tập
1 NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, 182-184.
26. Vũ Văn Vụ (1992), Sinh lý thực vật ứng dụng, NXB Giáo dục.
Tài liệu nƣớc ngồi
27. Bammi, R.K., Randhava, G.S (1975), Dioscorea Improvement Project -
Status Report. IJHR. Bangalore.
28. Bhojwani S.S (1980), factors affecting in vitro stage of micropropagation.
Plant physiol., 65: 90.
29. Chaturvedi, H.C., Sinha, M. (1979), Mass propagation of Dioscorea
floribunda by tissue culture. Ext. Bull. No 6. NBRI. Lucknow. India.
30. Do,H.D.K., Kim,J.S., Kim,J.H.(2014), “Paris verticillata voucher KWU02222
plastid, complete genome”, Genome Biol Evol 6 (7), 1699-1706.
31. Doyle. JJ, JL. Doyle (1987), A rapid DNA isolation procedure for small
quantities of fresh leaf tissue. Phytochem Bull 19: 11-15.
32. Deng, D., Lauren, D.R., Cooney, J.M., Jensen, D.J., Wurms, K.V., Upritchard, J.E., Cannon, R.D., Wang, M.Z., Li, M.Z. (2008), Antifungal
33. Devkota, K.P. (2005), “Bioprospecting studies on Sarcococca hookeriana Bail, Sonchus wightianus DC, Paris polyphylla Smith and related Medicinal Herbs of Nepal”, Ph D Thesis, HEJResearch Institute of Chemistry, International Centre for Chemical Science, University of Karachi Pakistan, Karachi 75,270.
34. Ford C.S, Ayres K.L, Toomey (2009), Selection of candidate coding DNA
barcoding regions for use on DNA plants. Botanical Journal of the
Linnean Society, 159 (1): 1 - 11.
35. Haberlandt, G. (1902) Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen.
Sitzungsber. Akad. Wiss. Wien. Math.-Naturwiss. Kl., Abt. J. 111, 69 - 92.
36. Jun, Z (1989), “Some bioactive substances from plants of West china”, Pure
& Appl Chem, 61(3), 457 - 460.
37. Kim M. Wilson, Mark A. Schembri, Peter D. Baker, Christopher P. Saint, (2000), ”Molecular characterization of the toxic cyanobacterium cylindrospermopsis raciborskii and design of a Species-Specific PCR”,
Applied and Environmental Microbiology, 66 (1) 332 - 338 .
38. Kumar M.H., Dhiman V., Choudhary R., Chikara A. (2014), Anticancer
activity of hydroalcoholic extracts from Paris polyphylla rhizomes
against human A549 lung cancer cell lines using MMT assay, IRJP,
5(4): 290 - 294.
39. Lee KH, Kwon KR, Kang Wm, Jeon EM, Jang JH (2010), ”Identification
and analysis of the chloroplast rpoC1 gene differentially expressed in wild
giseng” , J Pharmacopuncture, 15(2): 20-3
40. Lee M.S., Yuet-Wa J.C., Kong S.K., Yu B., EngChoon V.O., Nai-Ching H.W., Wai T.M., Fung K.P. (2005), Effects of polyphyllin D, a steroidal saponin in Paris polyphylla, in growth inhibition of human breast cancer
cells and in xenograft, Cancer Bio. Ther., 4(11): 1248-1254.
41. Li P. K., Yi X. L., Tolga E., Else D., He S. Y., Yang Z., Cheng Q. X., Chao L., Thomas E., Bai P. M. (2012), “Polyhydroxylated Steroidal Glycosides
42. Li F.R., Jiao P., Yao S.T., Sang H., Qin S.C., Zhang W., Zhang Y.B., Gao L.L. (2012), Paris polyphylla Smith extract induces apoptosis and activates
cancer suppressor gene connexin26 expression, Asian Pac. J. Cancer Prev,
13(1): 205-209.
43. Limasset cad Cornel (1949), Recherche du virus de la masọque du tabac
(Marmor tabaci Holmes) dans les méristèmes des plantes infectées, C.R Acad. Sci Paris 228. 1888-1890.
44. Murashige T. (1980) Plant Growth, Substances & Commercial uses of
tissues verlarg, Berlin, Heidelberg, Newyork, 642-677.
45. Murashige T, Skoog F (1962), A revised medium for rapid growth on bio -
assays with tabaco tissue culture. Physiol Plantar. 15: 473-477.
46. Murashige, T., Serpa, M., Jones, J.B. (1974), Clonal multiplication of
Gerbera Through tissue culture. Hortcience, 9, 175-180.
47. Morel, Martin (1952), Guerison de pomes de terre attains d’une maladie a
virus. C.R Acad. Sci: 235, 1324 - 1325.
48. Staritsky, G. (1970), Tissue culture of the oil palm (Elaeis guineensis Jacq)
as a tool for its vegetative propagation, Euphytica, 288 - 292.
49. Vijayan K, Tsoul C. H (2010). DNA barcoding in plant: taxonomy in a new
perspective, Curent Science, 99 (11): 1530-1538.
50. Wang Qiang (2005): Acta Botanica of nanging pharmaceutical University in
press, Journal of Chinese Pharmaceutical, 14(3), 1.762.180.
51. Yan, L.L., Zhang, Y.J., Gao, W.J., Man, S.L., Wang, L. (2009), In vitro
anticancer activity of steroid saponins of Paris polyphylla var.
yunnanensis. Exp. Oncol., 31(1): 27-32.
Trang Website
52. https://vi.wikipedia.org
53. ww.langson.gov.vn/binhgia/.../DE%20AN%20NTM%20BINH%20GIA.. 54. http://duan600.vn/huyen-ngheo/Huyen-Quan-Ba-Ha-Giang-28/
55. http://trungtamhoclieuthainguyen.com/chi-tiet/danh-gia-da-dang-sinh-hoc- thuc-vat-dac-huu-va-quy-hiem-tai-vuon-quoc-gia-hoang-lien-huyen-sa-pa- tinh-lao-cai-38747.html 56. http://timtailieu.vn/tai-lieu/phan-loai-sinh-hoc-phan-tu-32678/ 57. http://text.123doc.org/document/2575722-dai-cuong-ve-phan-loai-hoc-thuc- vat.htm 58. http://www. botanyvn.com/default.asp 59. http://www.baithuocquy.com/suc-khoe/bai-thuoc-tu-cay-that-diep-nhat-chi- mai/d3277 60. http://www.zhongyao.org.cn/zy/tp/gj/201102/246087.html 61. https://websrv1.ctu.edu.vn/coursewares/supham/phanloaitv/ch1.htm 62. http://www.vnbiobarcode.org/publication?id=27 63. http://www.bvtvhcm.gov.vn/handbook.php?id=13&cid=1 64. http://www.ncbi.nlm.nih.gov