3. Nội dung nghiên cứu
3.3. Kết quả nghiên cứu bảo tồn cây Thất diệp nhất chi hoa trồng tại tỉnh Thái Nguyên
Thái Nguyên
Với mục đích bảo tồn cây Thất diệp nhất chi hoa ở các vùng sinh thái khác nhau, chúng tơi tiến hành nhân giống vơ tính cây Thất diệp nhất chi hoa từ
các mầm củ thu được tại huyện Quản Bạ tỉnh Hà Giang. Thí nghiệm được tiến hành tại trường Đại học Sư Phạm theo mơ tả ở mục 2.2.2
Kết quả nghiên cứu ở thí nghiệm thứ nhất, cây Thất diệp nhất chi hoa sau khi thu thập, được trồng tại vườn ươm của trường Đại học sư phạm Thái Nguyên trong điều kiện mơi trường tự nhiên. Tồn bộ số cây trồng đều khơng thích nghi được và chết.
Ở thí nghiệm thứ 2 chúng tơi đã chọn 2 giá thể khác nhau gồm giá thể bằng đất và giá thể hỗn hợp của đất với cát (theo tỉ lệ 1:1). Chúng tơi lựa chọn phịng sinh trưởng làm điểm nuơi cấy, với đặc điểm phịng này cĩ sự ổn định
nhiệt độ trong khoảng 25oC ± 2oC, ánh sáng chiếu 14 giờ/ngày, độ ẩm khoảng
50 - 70%. Qua 5 tuần theo dõi, kết quả thu được trình bày ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của giá thể tới tỉ lệ sống của cây Thất diệp nhất chi hoa
(Thời điểm sau 35 ngày trồng)
Cơng thức thí nghiệm Tỷ lệ cây sống (%)
Giá thể đất thịt 51%
Giá thể hỗn hợp (đất + cát) 100%
Kết quả thu được ở bảng 3.4 cho thấy, nền giá thể hỗn hợp cho tỉ lệ sống 100%, giá thể đất cho tỉ lệ sống thấp hơn (51%). Qua quan sát thấy rằng cây Thất diệp nhất chi hoa trồng trên giá thể hỗn hợp cĩ bộ rễ phát triển mạnh hơn khi trồng trên nền giá thể đất, cĩ thể do nền giá thể hỗn hợp chứa cát nên thơng thống hơn và cây dễ hấp thụ đạt tỷ lệ sống cao hơn.
Nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng của cây Thất diệp nhất chi hoa trên giá thể hỗn hợp ở thí nghiệm 2 chúng tơi thu được kết quả trình bày ở bảng 3.6.
Bảng 3.6. Đặc điểm sinh trƣởng của cây Thất diệp nhất chi hoa trong phịng sinh trƣởng tại Thái Nguyên.
Đặc điểm Sau 10 ngày Sau 20 ngày Sau 30 ngày Sau 40 ngày
Chiều cao cây
(cm) 8,21 ± 1,45 13,39 ± 2,10 16,06 ± 2,31 21,25 ± 4,09
Chiều dài lá (cm) 7,40 ± 0,34 9,02 ± 0,42 10,08 ± 0,44 10,75 ± 0,45
Chiều rộng lá
(cm) 3,94 ± 0,25 4,39 ± 0,32 4,74 ± 0,36 5,13 ± 0,38
Chiều dài cuống
lá (cm) 1,09 ± 0,05 1,39 ± 0,06 1,80 ± 0,11 2,12 ± 0,15
Số gân lá/mẫu 4,24 4,24 4,24 4,24
Số lá/mẫu 4,33 4,33 4,33 4,33
Màu sắc thân Xanh tím Xanh tím Xanh tím Xanh tím
Màu sắc lá Xanh nhạt Xanh nhạt Xanh đậm Xanh đậm
Theo dõi sự phát triển của 15 mẫu cây bật chồi trên giá thể hỗn hợp chúng tơi nhận thấy các cây trồng gồm nhiều dạng dị thảo khác nhau, đĩ là các cây cĩ 3, 4, 5, 6 và 8 lá, chúng tơi khơng thu được cây 7 lá.
Qua 40 ngày sinh trưởng, chúng tơi thấy tốc độ tăng trưởng giữa các cây cĩ sự chênh lệch nhau. Chiều cao cây thấp nhất chỉ đạt 6,5cm cây cao nhất đạt trên 60cm. Chiều cao trung bình của các cây tăng từ 8,21cm (thời điểm trong 10 ngày đầu) đến 21,25cm (thời điểm sau 40 ngày theo dõi). Chiều dài lá tăng từ 7,40cm đến 10,75cm. Chiều rộng lá từ 3,94cm đến 5,13cm. Cuống lá cũng thay đổi từ 1,09cm đến 2,12cm. Tuy nhiên số lá trên cây và số gân trong quá trình theo dõi từ 10 - 40 ngày vẫn giữ nguyên số lượng. Màu sắc của các lá thay đổi dần từ màu xanh nhạt sang màu xanh đậm. Gốc các thân cây đều cĩ màu tím, lên đến phần ngọn chuyển màu xanh dần. Sau 3 tuần một số cây bắt đầu ra hoa, cuống hoa dài từ 6 - 30cm, số cánh tràng bằng số lá đài, hoa lưỡng tính, gồm nhiều chỉ nhị màu vàng, nhụy màu tím đen.
Hình 3.8. Cây Thất diệp nhất chi hoa trong phịng sinh trƣởng của cây in vitro tại Thái Nguyên
Như vậy, kết quả nghiên cứu bảo tồn cây Thất diệp nhất chi hoa bằng phương pháp nhân giống vơ tính tại Thái Nguyên bước đầu cho thấy cây cĩ khả năng sinh trưởng và phát triển phải trong điều kiện tương đối ổn định về điều kiện tự nhiên như nhiệt độ mát lạnh, độ ẩm và ánh sáng phù hợp Vì vậy, việc biến đổi nguồn gen cây Thất diệp nhất chi hoa để cây cĩ khả năng thích nghi với nhiều kiểu điều kiện sinh thái khác nhau là hướng đến của các nhà khoa học.
3.4. Kết quả bảo tồn cây Thất diệp nhất chi hoa in vitro 3.4.1. Kết quả khử trùng mẫu
Khử trùng mẫu là giai đoạn đầu tiên của quá trình nuơi cấy in vitro. Mẫu
được lấy từ các bộ phận khác nhau của cây, vì vậy thường dễ nhiễm các loại vi khuẩn, virus, nấm…Ở giai đoạn đầu tiên này các thao tác kỹ thuật và các thí
3 Lá
5 Lá 8 Lá
nghiệm cần phải đạt được những yêu cầu như: cĩ tỷ lệ mẫu nhiễm thấp, cĩ tỷ lệ mẫu sống cao hơn thế, mẫu phải tồn tại, phân hĩa, sinh trưởng tốt.
Để đạt được mục đích này, cần phải tìm ra phương pháp khử trùng cĩ hiệu quả. Cĩ nhiều yếu tố ảnh hưởng đến kết quả khử trùng như thời gian khử trùng, hĩa chất khử trùng, phương pháp lấy mẫu, thời điểm lấy mẫu… Tuy
nhiên trong kỹ thuật in vitro, hai yếu tố ảnh hưởng sâu sắc nhất đến kết quả khử
trùng là hĩa chất khử trùng và thời gian khử trùng. Loại hĩa chất thường được sử dụng để làm sạch mẫu cấy thường là các chất hĩa học như: canxihypocloxit (CaOCl2), natrihypoclorit (H2O2), clorua thủy ngân (HgCl2), axit clohydrich (HCl)… Việc lựa chọn hĩa chất, nồng độ, thời gian khử trùng phụ thuộc rất lớn vào đặc điểm tình trạng mẫu cấy [20].
Từ nguồn mẫu thu thập được chúng tơi tiến hành lựa chọn phần hạt, phần củ và lá non của cây Thất diệp nhất chi hoa làm vật liệu nuơi cấy. Để đạt được
hiệu quả khử trùng cao chúng tơi lựa chọn các hĩa chất gồm javen, HgCl2, cồn
và HCl với nồng độ khác nhau, nhằm thu được lượng mẫu sạch cao.
3.4.1.1. Kết quả khử trùng mẫu hạt cây Thất diệp nhất chi hoa
Ảnh hưởng của hĩa chất, thời gian và nồng độ khử trùng được đánh giá qua một số chỉ tiêu: tỷ lệ nhiễm, tỷ lệ chết, tỷ lệ sống. Sau 3 tuần theo dõi chúng tơi thu được kết quả trình bày ở bảng 3.7 dưới đây:
Bảng 3.7. Kết quả khử trùng hạt cây Thất diệp nhất chi hoa
Hĩa chất Nồng độ (%) Thời gian (phút) Số mẫu Mẫu nhiễm Mẫu sạch Tỷ lệ mẫu sạch (%) Javen (NaOCl) 65 15 40 36 4 11,0 75 10 40 30 10 25,0 HgCl2 0,1 5 40 30 11 27,5 8 40 22 18 45,0 Khí Clo 16 giờ 40 5 35 87,5
Nhìn vào bảng số liệu bảng 3.7 hạt Thất diệp nhất chi hoa được khử trùng
với ba loại hĩa chất javen, HgCl2, khí clo với các nồng độ khác nhau sau đĩ cấy
lên mơi trường MS cơ bản đã thu được lượng mẫu sạch khơng giống nhau. Sử dụng javen nồng độ 65% trong thời gian 15 phút, thu được 11% mẫu hạt sạch. Nâng nồng độ javen lên 75% và giảm thời gian khử trùng xuống 10 phút chúng
tơi thu được 25% mẫu sạch. Tỷ lệ này thấp hơn khi khử trùng hạt bằng HgCl2
nồng độ 0,1% trong 5 phút đạt 27,5%, tăng thời gian khử trùng lên 8 phút với
nồng độ HgCl2 0,1% thu được 45% mẫu sạch. Hiệu quả khử trùng cao nhất khi
sử dụng khí clo trong 16 giờ các mẫu thu được khơng cĩ hiện tượng nhiễm và tỷ lệ sống đạt 87,5%. Đây cũng là cơng thức hiệu quả nhất trong các thí nghiệm trên, hạt trắng sạch (hình 3.9). Tuy nhiên sau 04 tuần nuơi cấy chưa nhận thấy hạt cĩ sự thay đổi nào.
Hình 3.9. Mẫu hạt sạch cây Thất diệp nhất chi hoa cấy trên mơi trƣờng MS cơ bản
3.4.1.2. Kết quả khử trùng mẫu lá cây Thất diệp nhất chi hoa
Chúng tơi sử dụng HgCl2 và javen để khử trùng lá cây Thất diệp nhất chi
hoa . Việc khử trùng được thực hiện theo 03 cách như mơ tả ở mục 2.2.3, mỗi cơng thức được thí nghiệm trên 20 bình mẫu lá (mỗi bình mẫu bố trí 6 mảnh lá).
Mẫu khử trùng được cấy lên mơi trường MS cơ bản, đánh giá kết quả khử trùng sau 02 tuần nuơi cấy thể hiện ở bảng 3.8.
Bảng 3.8. Kết quả khử trùng lá cây Thất diệp nhất chi hoa
(Sau 2 tuần nuơi cấy)
Nồng độ Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu sạch (%)
CT1 35 65
CT2 75 25
CT3 95 5
Nhìn vào bảng 3.8, lá của cây Thất diệp nhất chi hoa được khử trùng theo 3 cơng thức khác nhau sau khi khử trùng, lá được cắt thành từng mảnh nhỏ cĩ kích thước rộng khoảng 1cm dài 1,5cm sau đĩ cấy trên mơi trường MS cơ bản. Sau 02 tuần theo dõi kết quả thu được: cơng thức 1 sử dụng javen với nồng độ 7% để khử trùng lá trong 10 phút, sau 2 tuần nuơi cấy kết quả thu được 65% mẫu lá sạch, khi tăng thời gian khử trùng javen nồng độ 7% lên 15 phút ở cơng thức 2 nhận thấy tỷ lệ mẫu sạch giảm cịn 25%, trong khi đĩ tỷ lệ mẫu nhiễm tăng lên từ 35 đến 75%. Cơng thức 3 khử trùng lá cây Thất diệp nhất chi hoa
bằng cồn 70% trong 1 phút, javen 20% trong 10 phút và HgCl2 0,1% trong 5
phút, kết quả tỉ lệ mẫu nhiễm chiếm cao nhất tới 95%, mẫu sạch chỉ đạt 5%. Như vậy, trong 3 cơng thức khử trùng lá của cây Thất diệp nhất chi hoa thì cơng thức khử trùng lá đạt hiệu quả cao nhất là cơng thức 1 chiếm 65% mẫu sạch, thấp nhất là cơng thức 3 đạt 5% mẫu sạch.
3.4.1.3 Kết quả khử trùng củ Thất diệp nhất chi hoa
Củ Thất diệp nhất chi hoa sau khi được rửa sạch bằng xà phịng và nước
máy được đưa vào khử trùng bằng cồn, javen và thủy ngân HgCl2 theo các bước
mơ tả ở mục 2.2.4 ở các nồng độ khác nhau cấy trên mơi trường MS cơ bản sau 02 tuần khử trùng chúng tơi thu được kết quả thể hiện ở bảng 3.9.
Bảng 3.9. Kết quả khử trùng củ Thất diệp nhất chi hoa
(Sau 2 tuần)
Cơng thức khử
trùng (CT) Số lƣợng củ mẫu nhiễm mẫu sạch
CT1 25 24 1
CT2 25 23 2
CT3 25 10 15
CT4 25 16 9
Nhìn vào bảng 3.9 củ Thất diệp nhất chi hoa được khử trùng với 4 cơng thức khác nhau trong 4 cơng thức cĩ sự kết hợp của 3 hĩa chất đĩ là cồn 70%,
javen 7% và HgCl2 0,1%. Trong đĩ, cồn được sử dụng để khử trùng ở cả 4 cơng
thức được giữ nguyên thời gian khử trùng là 3 phút, javen 7% tăng dần thời gian khử trùng từ CT1 đến CT4 là 3 phút đến 9 phút mỗi cơng thức cách nhau 2
phút. HgCl2 0,1% tăng dần thời gian khử trùng từ 4 đến 7 phút. Qua 4 CT trên
nhận thấy CT1 và CT2 đạt tỷ lệ mẫu sạch thấp trong đĩ CT1 là thấp nhất chỉ thu được 1 mẫu sạch, CT2 thu được 2 mẫu sạch, tiếp đến là CT4 đạt 9 mẫu sạch. CT3 thu được 15 mẫu sạch và đây cũng chính là cơng thức đạt hiệu quả khử trùng mẫu củ cao nhất trong 4 CT khử trùng trên.
Hình 3.10. Mẫu sạch khử trùng củ Thất diệp nhất chi hoa
3.4.2. Kết quả thăm dị mơi trường nảy mầm và phát sinh hình thái của các mẫu nghiên cứu nghiên cứu
Từ những năm 50 của thế kỷ XX, người ta đã nhận thấy vai trị của nhĩm cytokinin cĩ ảnh hưởng rõ rệt và đặc trưng lên sự phân hĩa các cơ quan của thực vật đặc biệt là sự phân hĩa chồi. Vì vậy, để tăng hệ số nhân, người ta đã sử sụng thêm một số chất cĩ trong nhĩm cytokinin trong mơi trường nuơi cấy.
3.4.2.1. Kết quả thăm dị mơi trường nảy mầm của hạt
a. Ảnh hưởng của GA3 đến hệ số nảy mầm của hạt
GA3 là một loại của gibberellin cĩ cơng thức hĩa học là C19H22O6. Gibberellin kích thích sự nảy mầm của hạt, nảy chồi của các mầm, do đĩ nĩ cĩ tác dụng trong việc phá bỏ trạng thái ngủ nghỉ của cây [63]. Theo kinh nghiệm thực tiễn của người dân, hạt Thất diệp nhất chi hoa cĩ thời gian ngủ dài, sau khi thu hoạch hạt đem gieo trồng thì sau 5 - 8 tháng hạt mới nảy mầm. Chính vì vậy, chúng tơi đã sử dụng hạt cây Thất diệp nhất chi hoa cấy trên mơi trường
MS cơ bản cĩ bổ sung GA3 nồng độ từ 0,3mg/l đến 1,9 mg/l để thăm dị mơi
trường nảy mầm của hạt. Tuy nhiên, sau 05 tuần theo dõi nhận thấy hạt khơng cĩ bất kỳ sự thay đổi nào của hạt.
b. Ảnh hưởng của BAP đến sự biến đổi của hạt
BAP là một chất kích thích sinh trưởng thuộc nhĩm cytokinin được sử dụng thơng dụng, nên trong nghiên cứu chúng tơi chọn cấy hạt trên mơi trường MS cĩ bổ sung BAP để khảo sát khả năng nảy mầm ở cây Thất diệp
nhất chi hoa ở các theo thí nghiệm 7. Sau 04 tuần nuơi cấy cũng khơng nhận thấy sự thay đổi nào của hạt.
3.4.2.2. Kết quả thăm dị mơi trường phát sinh hình thái mơ lá
Quá trình tái sinh của cây in vitro cĩ thể thơng qua con đường trực tiếp
hoặc gián tiếp qua giai đoạn mơ sẹo. Với mục tiêu tạo ra các khối mơ sẹo từ lá, chúng tơi đã bổ sung vào mơi trường nuơi cấy các chất kích thích sinh trưởng loại 2,4D, IBA và BAP nồng độ từ 1mg/l đến 4mg/l, bước nhảy 0,5mg/l. Sau 03 tuần theo dõi mẫu lá cĩ bổ sung 2,4-D nhận thấy mẫu lá bị mất màu diệp lục chuyển sang màu vàng, cịn mẫu lá cĩ bổ sung BAP và IBA chuyển dần sang vàng và chết đen.
Như vậy, cả ba loại auxin ở những nồng độ trên đều khơng cĩ tác dụng kích thích hình thành mơ sẹo và tạo chồi ở lá cây Thất diệp nhất chi hoa hình 3.11
Hình 3.11. Ảnh hƣởng của chất ĐHST đến sự phát sinh hình thái mơ lá.
3.4.2.3. Kết quả thăm dị mơi trường biến đổi của tế bào lớp mỏng từ củ
Xuất phát từ những thành cơng của các cơng trình nghiên cứu nuơi cấy tế bào lớp mỏng cây khoai mơn sọ [19] và cây Sâm ngọc linh [28]. Chúng tơi tiến hành tạo tế bào lớp mỏng cắt ngang từ củ cây Thất diệp nhất chi hoa. Các lát cắt mỏng cĩ kích thước rộng 0,5cm, dài 1cm và dày 0,2cm, Cấy trên mơi trường MS cơ bản cĩ bổ sung kích thích sinh trưởng IBA, 2,4-D, ở các nồng độ từ 0,2mg/l đến 1,4mg/l bước nhảy giữa mỗi nồng độ là 0,2mg/l. Sau 08 tuần nuơi cấy, các mơ nuơi cấy cũng khơng cĩ hiện tượng tạo mơ sẹo hay tạo đa chồi xuất hiện. Sau 08 tuần các mảnh mẫu cĩ hiện tượng úa dần và chết hình 3.12.
Hình 3.12. Mẫu sạch từ củ cây Thất diệp nhất chi hoa trên mơi trƣờng MS cĩ bổ sung thêm các chất kích thích sinh trƣởng
3.4.2.4. Kết quả thăm dị mơi trường biến đổi của chồi củ nguyên vẹn
Sau khi thực hiện với phương pháp nuơi cây tế bào lớp mỏng trên khơng thu được kết quả mong muốn. Chúng tơi đã chuyển sang phương pháp nuơi cấy giữ nguyên phần thân củ, sau khi thu mẫu củ sạch chúng tơi tiến hành chuyển tổng số 21 mẫu sang mơi trường cĩ bổ sung BAP nồng độ từ 0,5mg/l đến 2,0 mg/l. Kết quả theo dõi sau 30 ngày, chúng tơi thu được kết quả ở bảng 3.9.
Bảng 3.10. Ảnh hƣởng của các chất ĐHST đến hệ số nảy mầm của củ Cơng thức Nồng độ Số mẫu Tỷ lệ bật chồi
BAP
0,5 4 1
1,0 4 0
2,0 4 0
BAP + than hoạt tính 0,5 4 1 1,0 5 0 ĐC BAP 2,4D IBA
Bảng số liệu 3.10 cho ta thấy, đã thu được 02 mẫu nuơi cấy trên mơi trường cĩ bổ sung BAP ở nồng độ 0,5mg/l đã bật chồi, tuy nhiên qua quan sát tơi nhận thấy mẫu cĩ bổ sung thêm than hoạt tính củ ra chồi và phát triển nhanh hơn mẫu khơng cĩ bổ sung than hoạt tính, tính từ thời điểm bật chồi trong 30 ngày mẫu cĩ bổ sung than hoạt tính cĩ chiều cao hơn 7cm, trong khi đĩ mẫu khơng cĩ than hoạt tính chỉ đạt chiều cao chồi 1,5cm, cịn lại 05 mẫu MS cơ bản làm đối chứng khơng nhận thấy