3. Nội dung nghiên cứu
2.1.2. Hĩa chất, thiết bị
2.1.2.1. Hĩa chất
Sử dụng hĩa chất cĩ nguồn gốc rõ ràng, đặc biệt là các hĩa chất dùng trong sinh học phân tử của các hãng cĩ uy tín, Fermentas (Đức) như: CTAB, SDS, EDTA, Tris-HCl, Trung Quốc như: NaCl, sodium acetate, Merck (Đức) như: ethanol, agarose, ethidium bromide.
- Mơi trường nuơi cấy cơ bản là mơi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) cĩ bổ sung thạch agar (8,5g/lít), đường (30g/lít) và các chất kích thích sinh trưởng với nhiều nồng độ khác nhau, pH mơi trường được điều chỉnh tới
5,8 và khử trùng dưới áp suất 1,2atm ở nhiệt độ 1210C trong 22 phút.
2.1.2.2. Thiết bị
Box cấy, nồi hấp khử trùng, máy sấy, cân điện tử, bình tam giác cĩ kích thước từ 250 đến 500ml, pipet, dụng cụ nuơi cấy…Các hĩa chất và thiết bị cần thiết phục vụ cho quá trình nghiên cứu nuơi cấy mơ tại phịng cơng nghệ tế bào thuộc khoa Sinh học, trường Đại học sư phạm Thái Nguyên.
Các thí nghiệm phân lập gen, được tiến hành trên trang thiết bị của phịng Cơng nghệ DNA ứng dụng, phịng cơng nghệ tế bào thực vật và phịng thí nghiệm trọng điểm cơng nghệ gen, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và cơng nghệ Việt Nam.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp thu thập mẫu
Thu thập mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa trong tự nhiên, mơ tả và chụp ảnh.
2.2.2. Phương pháp bảo tồn cây Thất diệp nhất chi hoa tại Thái Nguyên
Số cây con sau khi thu được đưa về trồng tại vườn ươm của trường Đại học sư phạm Thái Nguyên,
Thí nghiệm 1. Trồng cây tại vườn ươm của trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên. Tổng số 26 cây được bố trí trồng trên 2 luống, mỗi luống chia làm 2 hàng cách nhau 40cm, cây cách cây 40cm, tưới nước ngày 1 lần vào buổi chiều.
Thí nghiệm 2. Trồng cây trong phịng sinh trưởng cây in vitro của phịng cơng nghệ tế bào. Mỗi cây trồng 1 chậu. Mỗi chậu cĩ kích thước rộng 30cm, cao
30cm. Nhiệt độ 25oC ±2. Độ ẩm 50 - 70%. Chiếu sáng 12 giờ/ngày.
Các chỉ tiêu theo dõi được mơ tả theo thứ tự ở bảng 3.5 Đánh giá kết quả ngồi vườn ươm.
Tỉ lệ cây sống Tỷ lệ cây chết
Chiều cao trung bình/cây (cm) Số lá/cây (cm)
Chiều rộng lá/cây (cm) Chiều dài lá/cây (cm) Số gân/lá
2.2.3. Phương pháp phân lập gen rpoC1
Lá non của cây Thất diệp nhất chi hoa thu thập tịa huyện Bình Gia – Lạng Sơn. Được sử dụng để tách chiết DNA tổng số theo phương pháp CTAB của Doyle.JJ (1987) [30]. DNA tổng số được định tính và định lượng bằng phương pháp quang phổ kế và điện di trên gel agarose 1%. DNA được tinh sạch theo bộ
Kit GenJET PCR Purification của hãng Thermo Scientific và hướng dẫn của nhà sản xuất.
Gen rpoC1 được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu
rpoC1-1f/rpoC1-3r theo chu trình nhiệt như sau: 94oC - 4 phút; lặp lại 35 chu kì
o
C - 30 giây, 55oC - 40 giây, 72oC - 40 giây); 72oC - 10 phút và giữ ở 4oC. Thành phần phản ứng PCR bao gồm: master mix (2X) - 7,5 μl, mồi xuơi (10pmol/μl) - 0,5 μl, mồi ngược (10 pmol/μl) - 0,5μl, DNA khuơn (10ng/μl)- 0,5 μl. Tổng thể tích phản ứng - 15μl.
2.2.4. Phương pháp nuơi cấy in vitro
- Phương pháp lấy mẫu: Cây được lựa chọn để lấy mẫu là những cây sinh trưởng khoẻ khơng bị sâu .
Tạo nguồn vật liệu ban đầu
+ Rửa mẫu (hạt, lá, củ) nhiều lần bằng nước sạch, tránh làm dập mẫu. + Ngâm trong nước xà phịng lỗng 1% khoảng 5 - 7 phút.
+ Tiếp tục rửa mẫu bằng nước sạch nhiều lần
+ Chuyển mẫu vào bình tam giác và tráng lại nhiều lần bằng nước cất vơ trùng trước khi khử trùng với hĩa chất.
Thí nghiệm 3. Khử trùng hạt bằng 3 loại hĩa chất
CT 1: Javen nồng độ 65% trong 15 phút và 75% trong 10 phút.
CT 2: HgCl2 nồng độ 0,1% trong 5 phút, 8 phút.
CT 3: Khí clo (HCl và javen theo tỉ lệ 4 : 20ml) trong 16 giờ.
Thí nghiệm 4. Khử trùng củ bằng cách kết hợp cồn, javen và HgCl2
CT 1: cồn 70% trong 3 phút sau đĩ sử dụng javen 7% trong 3phút, tiếp
đến dùng HgCl2 0,1% trong 4 phút.
CT 2: cồn 70% trong 3 phút, sau đĩ sử dụng javen 7% trong 5 phút tiếp
CT 3: cồn 70% trong 3 phút sau đĩ sử dụng javen7% trong 7 phút tiếp
đến dùng HgCl2 0,1% trong 6 phút.
CT 4: cồn 70% trong 3 phút sau đĩ sử dụng javen 7% trong 9 phút tiếp
đến dùng HgCl2 0,1% trong 8 phút.
Thí nghiệm 5. Khử trùng lá bằng:
Cơng thức 1: javen 7% trong 10 phút Cơng thức 2: javen 7% trong 15 phút.
Cơng thức 3: cồn 70% trong 1 phút sau đĩ sử dụng javen 20% 10 phút tiếp
đến dùng HgCl2 0,1% trong 5 phút.
Nhân nhanh chồi cây Thất diệp nhất chi hoa
Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của GA3 đến sự nảy mầm của hạt.
Hạt cấy trên mơi trường MS cĩ bổ sung GA3 nồng độ từ 0,3 đến 1,9 mg/l, mỗi bậc cách nhau 0,2mg/l.
Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của BAP đến sự nảy mầm của hạt
Hạt cấy trên mơi trường MS cĩ bổ sung BAP nồng độ từ 1,0 đến 5mg/l, mỗi bậc cách nhau 0,5ml.
Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của các ĐHST đến sự phát sinh hình thái của lá Hạt cấy trên mơi trường MS cĩ bổ sung
Cơng thức 1: 2,4-D nồng độ từ 1,0 đến 4 mg/l bước nhảy 0,5mg/l. Cơng thức 2: BAP nồng độ từ 1,0 đến 4mg/l bước nhảy 0,5mg/l. Cơng thức 3: IBA nồng độ từ 1,0 đến 4mg/l bước nhảy 0,5mg/l.
Thí nghiệm 9: Ảnh hưởng của các chất ĐHST đến sự phát sinh hình thái của tế bào lớp mỏng
Củ của cây Thất diệp nhất chi hoa sau khi khử trùng được cắt thành từng lát mỏng theo kích thước khoảng 0,5 x 1cm dày khoảng 0,2cm và được cấy trên mơi trường MS cơ bản cĩ bổ sung :
Cơng thức 1: IBA nồng độ từ 0,2 đến 1,4 bước nhảy 0,2 mg/l Cơng thức 2: 2,4-D nồng độ từ 0,2 đến 1,4 bước nhảy 0,2 mg/l
Thí nghiệm 10: Ảnh hưởng của các ĐHST đến sự phát sinh hình thái của củ.
Cơng thức 1: MS cơ bản
Cơng thức 2: MS + BAP (0; 0,5; 1; 2 mg/l)
Cơng thức 3: MS + BAP (0; 0,5; 1 mg/l) + than hoạt tính.
2.2.5. Phương pháp xử lí số liệu
Các số liệu phân tích được thực hiện trên máy tính theo chương trình excel. Các cơng thức so sánh được tiến hành theo phương pháp kiểm tra sự sai khác giữa các giá trị trung bình bằng phép ước lượng, đọc kết quả dựa vào bảng ANOVA
Trình tự nucleotit của rpoC1 được phân tích, so sánh bằng các phần mềm
Bioedit, BLAST, ClustalW, DNA star.
2.3. Địa điểm tiến hành thí nghiệm
Các thí nghiệm trên được tiến hành tại khoa Sinh học của trường Đại học sư phạm Thái Nguyên. Phịng Cơng nghệ DNA ứng dụng, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và cơng nghệ Việt Nam.
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả thu thập mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa tại một số tỉnh miền núi phía Bắc của Việt Nam núi phía Bắc của Việt Nam
Xuất phát từ những thơng tin ban đầu về sự đa dạng và rộng khắp của cây Thất diệp nhất chi hoa , chúng tơi tiến hành khảo sát và thu thập mẫu tại 3 tỉnh Lạng Sơn, Hà Giang và Lào Cai. Kết quả nghiên cứu nhằm bổ sung các thơng tin về đặc điểm sinh trưởng của cây Thất diệp nhất chi hoa ở khu vực miền núi phía bắc Việt Nam.
3.1.1. Đặc điểm mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa thu thập tại huyện Bình Gia- Lạng Sơn Lạng Sơn
Bình Gia là một huyện của tỉnh Lạng Sơn, cách thành phố chừng 70km về phía đơng bắc theo tuyến đường quốc lộ 1B. Địa hình bị chia cắt bởi những
dãy núi đất, núi đá, độ dốc trung bình từ 25 - 30o
C. Khí hậu nhiệt đới giĩ mùa
vùng núi, nhiệt độ trung bình năm 20,8oC, độ ẩm trung bình năm là 82%, mùa
mưa từ tháng 4 đến tháng 9, lượng mưa trung bình 1,540 mm/năm [53].
Tiến hành thu mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa tại hai xã của huyện Bình Gia, tỉnh Lạng Sơn chúng tơi thu được tổng cộng 4 cây hồn chỉnh. Kết quả thể hiện ở bảng 3.1, hình 3.1 và 3.2.
Bảng 3.1. Mẫu cây thu đƣợc tại huyện Bình Gia - Lạng Sơn
Loại mẫu Số lƣợng
(cây) Xã thu mẫu
Điều kiện tự nhiên của xã Độ cao (m) Nhiệt độ/năm (oC) Độ ẩm/năm (%) Cây 06 lá 03 Hồng Phong 800 - 1000m 20,8 o C 82%
Cây 05 lá 01 Hội Hoan
Kết quả nghiên cứu ở bảng 3.1 cho thấy, tại xã Hồng Phong, huyện Bình Gia, tỉnh Lạng Sơn chúng tơi thu được 03 mẫu cây, cả 3 cây đều cĩ 06 lá/cây. Các cây cĩ chiều cao từ 30 - 80cm. Trong tháng 9 và 10, cây đang ở độ sinh
trưởng và phát triển mạnh, thân cây to, mọng nước, lá rộng và xanh, trên lá cĩ 5 gân chạy hình vịng cung. Đến tháng 10 cĩ 01 cây xuất hiện cuống mang nụ hoa, mọc ra từ đỉnh vành lá. Sang tháng 11, phần cuống của cây hoa này dài 50cm, hoa nở với 06 cánh tràng và 06 lá đài. Nhị hoa màu vàng, nhụy hoa màu tím đen. Tuy nhiên, sau đĩ hoa lụy tàn khơng nhận thấy quả được hình thành.
a. Hình ảnh cây trong tháng 10 b. Hình ảnh cây trong tháng 11
Hình 3.1. Cây Thất diệp nhất chi hoa tại Hồng Phong - Bình Gia - Lạng Sơn
Tại xã Hội Hoan - Bình Gia - Lạng Sơn thu được 01 mẫu cây cây hồn chỉnh. Theo hình 3.2 mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa thuộc dạng dị thảo, cây cĩ 5 lá, lá cĩ hình bầu dục, phiến lá trơn, viền lá nhẵn. Lá cĩ kích thước chiều rộng 8cm, chiều dài 9,5cm. Năm cuống lá cùng xuất phát từ một vị trí. Hiện tại đây là phần cao nhất của thân cây, Thân cây dạng thảo, mọng nước, kích thước thân dài 9cm, Thân củ cĩ 5 mắt đốt và nhiều rễ nhỏ mọc xung quanh.
3.1.2. Đặc điểm mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa thu thập tại huyện Quản Bạ- Hà Giang Giang
Quản bạ là huyện vùng cao biên giới phía bắc của tỉnh Hà giang, cách trung tâm thành phố Hà Giang 44 km, gồm nhiều khu vực núi đá vơi, độ cao trung bình từ 1.000 - 1.600m, chịu ảnh hưởng của khí hậu nhiệt đới giĩ mùa, lượng mưa bình quân/năm đạt 1.745mm tập trung chủ yếu từ tháng 5 đến tháng 9 [54].
Qua quá trình thu thập mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa chúng tơi đã thu được kết quả ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Số lƣợng mẫu Thất diệp nhất chi hoa thu tại Hà Giang
Loại mẫu Số lƣợng Mẫu Độ cao (m) Nhiệt độ/năm (oC) Độ ẩm/năm (%)
Quả hạt 02 01 quả chứa 105 hạt.
01 quả chứa 124 hạt. 1000- 1600m 15-20 o C 85% Củ 70 Các củ cĩ kích thước khơng đều, trọng lượng củ 4 - 30g.
Theo bảng 3.2 và hình 3.3, mẫu củ thu được ở huyện Quản Bạ - Hà Giang là mẫu thu mua từ người dân bản địa (hình 3.3). Các mẫu củ đều cĩ màu xám đen, cĩ trọng lượng thay đổi từ 4g đến 30g, nhiều củ đang trong quá trình lên mầm cây mới.
Với phần quả thu được thể hiện trên bảng 3.2 và hình 3.4 cho thấy, quả của cây Thất diệp nhất chi hoa cĩ dạng hình cầu, đường kính khoảng 3 - 4cm. Phần vỏ bên ngồi cứng, màu xám đen. Vỏ quả chín để lộ nhiều hạt màu đỏ hình hơi trịn. Tổng số hạt của 2 quả đếm được gồm 229 hạt. Mỗi hạt cĩ kích thước khoảng 0,3 - 0,5cm, nặng khoảng 0,9 - 0,11g. (hình 3.4)
Hình 3.4. Quả và hạt cây Thất diệp nhất chi hoa thu tại Hà Giang
3.1.3. Đặc điểm mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa thu thập tại huyện Sa Pa- Lào Cai
Nằm ở phía Tây Bắc của Việt Nam, thị trấn Sa Pa ở độ cao 1.600 mét so với mực nước biển, cách thành phố Lào Cai 38 km. Sa Pa cĩ khí hậu cận nhiệt đới ẩm, ơn đới, khơng khí mát mẻ quanh năm. Nhiệt độ khơng khí trung bình năm của Sa Pa là 15°C [53].
Về đa dạng sinh học huyện Sa Pa cĩ vườn quốc gia Hồng Liên Sơn cĩ diện tích 29.845 ha vùng lõi và 38.724 ha vùng đệm chủ yếu là cây nguyên sinh được bảo vệ nghiêm ngặt. Vườn được bảo vệ nghiêm ngặt, vườn cĩ kho tàng quỹ gen thực vật quý hiếm chiếm 50% số lồi thực vật quý hiếm của Việt Nam, thống kê cĩ 2024 lồi thực vật, 113 lồi thực vật quý hiếm đang cĩ nguy cơ
tuyệt chủng trên thế giới [55] trong đĩ cĩ cây Thất diệp nhất chi hoa . Kết quả
Bảng 3.3. Số lƣợng mẫu Thất diệp nhất chi hoa thu tại Sa Pa Loại mẫu Số lƣợng Mẫu Độ cao (m) Nhiệt độ/năm (oC) Độ ẩm/năm (%) Cây hồn chỉnh 27 Cây 03 lá cĩ 07 cây Cây 05 lá cĩ 9 cây Cây 06 lá cĩ 8 cây Cây 07 lá cĩ 3 cây ≥1000m 15-23oC 86-87%
Tại Sa Pa chúng tơi đã quan sát được sự cĩ mặt của cây Thất diệp nhất chi hoa tại hai khu vực: Khu vực thứ nhất tại vườn quốc gia Hồng Liên chúng tơi thống kê được 27 cây đang được bảo tồn, đây là những cây hồn chỉnh, trong đĩ cĩ nhiều dạng dị thảo khác nhau (hình 3.5A); Khu vực thứ 2, quan sát thấy cây Thất diệp nhất chi hoa tại xã Bản Khoang, huyện Sa Pa, tỉnh lào Cai khu vực này được người dân thu gom và trồng với diện tích khoảng 40m2 (hình 3.5B), cây sinh trưởng phát triển mạnh, đẻ nhiều nhánh con và nhiều cá thể cĩ hoa và quả.
Hình 3.5. Cây Thất diệp nhất chi hoa tại Sa Pa
(A. Cây Thất diệp nhất chi hoa tại xã Bản Khoang
B. Cây Thất diệp nhất chi hoa tại trung tâm bảo tồn vườn quốc gia Hồng Liên) Qua thực địa tìm kiếm cây Thất diệp nhất chi hoa tại 03 vùng trên và
chúng tơi nhận thấy: Cây phân bố chủ yếu ở nơi cĩ cường độ ánh sáng trung
bình, nhiệt độ từ 20 - 25o C, độ ẩm cao. Cây phát triển tốt hơn tại những nơi cĩ
độ mùn dày và lớp lá phủ nhiều trên mặt đất, đặc biệt gần các khe nước. Tại Sa Pa chúng tơi nhận thấy rằng cây sinh trưởng và phát triển rất tốt thân củ đẻ nhiều nhánh con, thân cây to mập, chiều cao chủ yếu từ 30-120cm, đa số cây ra hoa và hình thành quả, số lượng cá thể nhiều. Tuy nhiên, tại Lạng Sơn và Hà Giang số lượng cá thể tìm thấy trong tự nhiên cịn ít.
3.2. Kết quả phân tích gen rpoC1 của cây Thất diệp nhất chi hoa
Kết quả nhân bản gen rpoC1 bằng kỹ thuật PCR
Sau khi tách chiết, DNA tổng số được kiểm tra bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose 0,8% đã phát hiện DNA đủ sạch để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Quá trình nhân bản gen rpoC1 được tiến hành với
cặp mồi rpoC1- 1F/ rpoC1-3r. Theo tính tốn lý thuyết, gen rpoC1 nhân được
cĩ kích thước hơn 500 bp. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1%, kết quả được trình bày ở hình 3.6.
Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm nhân gen rpoC1
M: thang DNA 1kb;
TD: sản phẩm nhân gen rpoC1từ mẫu 05 lá thu tại Lạng Sơn
M TD
rpoC1
Sản phẩm PCR thu được ở hình 3.7 là một băng DNA sáng rõ nét, cĩ kích
thước khoảng 500 bp phù hợp với kích thước lý thuyết của gen rpoC1 dự kiến
nhân bản. Kết quả điện di cũng cho thấy, khơng cĩ băng DNA phụ xuất hiện,
như vậy sản phẩm PCR nhân bản gen rpoC1 rất đặc hiệu, cĩ thể sử dụng trực
tiếp các sản phẩm này để xác định trình trình tự nucleotide.
Sau khi được khuếch đại, sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit Gen JET PCR Purification của hãng Thermo Scientific và được xác định trình tự trên máy giải trình tự tự động ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer.