7. Cấu trỳc của luận văn
2.2.3. Kớnh hiển vi huỳnh quang
Kớnh hiển vi huỳnh quang cơ bản là giống kớnh hiển vi quang học thụng thƣờng nhƣng thờm vào một số thành phần để mở rộng khả năng của chỳng.
Kớnh hiển vi quang học thụng thƣờng sử dụng ỏnh sỏng chiếu vào mẫu vật và tạo hỡnh ảnh phúng to của vật đú. Kớnh hiển vi huỳnh quang sử dụng ỏnh sỏng với cƣờng độ lớn hơn rất nhiều để chiếu vào mẫu vật. Ánh sỏng này sẽ kớch thớch huỳnh quang mẫu vật cú bƣớc súng dài hơn. Kớnh hiển vi huỳnh quang cũng tạo ra hỡnh ảnh phúng to của vật, nhƣng hỡnh ảnh này đƣợc tạo trờn cơ sở nguồn sỏng thứ cấp - ỏnh sỏng huỳnh quang. Hỡnh 2.7 mụ tả sơ đồ nguyờn lý của kớnh hiển vi huỳnh quang với hai kớnh lọc (filter) là: kớnh lọc ỏnh sỏng kớch thớch và kớnh lọc ỏnh sỏng phỏt xạ.
- Kớnh lọc kớch thớch (excitation filter): dựng để chọn lọc bƣớc súng kớch thớch, kớnh lọc kớch thớch đƣợc đặt trờn đƣờng đi của ỏnh sỏng kớch thớch.
- Kớnh lọc phỏt xạ: dựng để lọc ỏnh sỏng phỏt xạ từ mẫu vật và loại bỏ dấu vết của ỏnh sỏng kớch thớch.
a) b)
Hỡnh 2.7.a) Sơ đồ nguyờn lý của kớnh hiển vi huỳnh quang cấu hỡnh cơ bản và b) cấu hỡnh epi.
Trong thực nghiệm, hệ kớnh hiển vi thƣờng với đƣờng kớch thớch và phỏt xạ riờng biệt cú rất nhiều hạn chế. Khụng gian thao tỏc với mẫu vật chật hẹp, toàn bộ ỏnh sỏng kớch thớch khi đi qua mẫu vẫn nằm trong quang trỡnh của ỏnh sỏng thu làm
Camera Nguồn sỏng Kớnh lọc kớch thớch Kớnh lọc phỏt xạ Mẫu Vật kớnh Gương lưỡng chiết
tăng tớn hiệu nền, giảm độ tƣơng phản. Để khắc phục cỏc hạn chế này, ngày nay, hầu hết cỏc kớnh hiển vi huỳnh quang sử dụng cấu hỡnh epi (hỡnh 2.7a). Đặc điểm của cấu hỡnh epi là ỏnh sang kớch thớch và ỏnh sỏng phỏt xạ đƣợc chiếu tới mẫu và thu nhận bởi cựng một vật kớnh. Cỏc hệ kớnh lọc đƣợc bố trớ trờn cựng một vị trớ thƣờng đƣợc gọi là khối kớnh lọc lập phƣơng (filter cube). Ngoài cỏc kớnh lọc kớch thớch và phỏt xạ nhƣ cấu hỡnh cơ bản, một gƣơng lƣỡng sắc đƣợc sử dụng để phõn tỏch đƣờng đi của ỏnh sỏng kớch thớch và ỏnh sỏng phỏt xạ. Gƣơng lƣỡng sắc cú tớnh chất phản xạ đặc biệt cho phộp phõn tỏch đƣờng đi của hai chựm ỏnh sỏng. Mỗi gƣơng lƣỡng sắc cú một giỏ trị bƣớc súng giới hạn, gọi là giỏ trị bƣớc súng chuyển pha, mà ở bƣớc súng đú 50% ỏnh sỏng truyền qua. Gƣơng sẽ phản xạ những ỏnh sỏng cú bƣớc súng nhỏ hơn giỏ trị bƣớc súng chuyển pha và truyền qua ỏnh sỏng cú bƣớc súng lớn hơn giỏ trị này. Chớnh vỡ tớnh chất này mà gƣơng cú tờn gọi là lƣỡng sắc hay 2 màu (dichroic, two color). Trong điều kiện lý tƣởng, bƣớc súng chuyển pha của gƣơng lƣỡng sắc đƣợc chọn ở giữa bƣớc súng kớch thớch và phỏt xạ. Ánh sỏng kớch thớch cú bƣớc súng nhỏ hơn giỏ trị bƣớc súng chuyển pha nờn sẽ phản xạ trờn bề mặt gƣơng lƣỡng sắc và tới vật kớnh. Ánh sỏng huỳnh quang cú bƣớc súng lớn hơn giỏ trị bƣớc súng chuyển pha nờn sẽ truyền qua gƣơng lƣỡng sắc và đi tới thị kớnh hoặc hệ thống đầu thu.