3. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp nuôi cấy in vitro
Nuôi cấy mô tế bào được tiến hành trên nền môi trường cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962).
Bảng 2.1. Thành phần cơ bản của môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) STT Thành phần hàm lượng(mg/l) STT Thành phần hàm lượng (mg/l) MS 1 11 CuSO4.5H2O 0.025 1 CaCl2 440.00 12 Na2MoO4.2H2O 0.25 MS 2 MS 4 2 KH2PO4 170.00 13 FeSO4.7H2O 27.80 3 KNO3 1900.00 14 Na2EDTA 37.30 4 MgSO4.7H2O 370.00 MS 5 5 NH4NO3 1650.00 15 Glicine 2.00 MS 3 16 Thiamine HCl 0.10 6 H3BO3 6.20 17 Pyridoxine HCl 0.50 7 KI 0.83 18 Nicotinic Acid 0.50
8 MnSO4.4H2O 22.30 19 Myo- inositol 100.00
9 ZnSO4.7H2O 8.60 20 - -
10 CoCl2.6H2O 0.025 21 - -
Nguyên tắc pha môi trường nuôi cấy: Pha môi trường đặc với thành phần và hàm lượngcác chất phù hợp. Môi trường cơ bản là MS, có đầy đủ muối khoáng, các chất hữu cơ, vitamin…Tất cả các hóa chất phải được tan đều, không kết tủa. Môi trường có bổ sung chất độn là thạch làm giá đỡ không quá rắn hay quá mềm để khi cấy mẫu được dễ dàng. Khử trùng ở nhiệt độ 1200C, áp
suất 0,7at - 1,2at. Sau khi khử trùng để nguội và tiến hành cấy mẫu trong buồng cấy vô trùng.
Các bước cụ thể trong pha môi trường nuôi cấy:
(1) Xác định công thức cần pha.
(2) Đong khoảng 0,6 lít nước cất, đun trên bếp điê ̣n.
(3) Dùng ống đong hoặc pipet để lấy dung dịch MS cơ bản và các chất kích thích sinh trưởng.
(4) Cân đường sucrose, agar, than hoạt tính để riêng từng loại.
(5) Khi nước cất gần sôi thì đổ đường vào, khuấy tan, sau đó cho thạch và than vào khuấy tan hết.
(6) Bổ sung dung dịch hóa chất đã chuẩn bị ở trên. (7) Bổ sung nước cất vào hỗn hợp trên cho đủ 1 lít. (8) Chuẩn độ pH của hỗn hơ ̣p trong khoảng từ 5,6 - 5,8.
(9) Chia đều cho các bình tam giác (mỗi bình 50 ml môi trường). Làm nút bông, nút giấy cho các bình tam giác.
(10) Khử trùng ở nhiệt độ 120oC, áp suất 0,7at - 1,2at. Sau khi khử trùng để nguội và tiến hành cấy mẫu trong buồng cấy vô trùng.
Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của các chất bổ sung đến sự sinh trưởng và phát triển của cây Đảng Sâm trong ống nghiệm.
Để tìm ra môi trường thích hợp cho nhân giống cây Đảng Sâm trong ống nghiệm, chúng tôi đã bố trí các thí nghiệm thăm dò môi trường nuôi cấy.Mẫu là đoạn thân cây Đẳng Sâm được cây trong môi trường MS cơ bản có bổ sung BAP 0,6mg/l + IBA 0,6mg/l +chất phụ gia ( đường, dịch triết khoai tây, than hoạt tính) với nồng độ thay đổi. Đối chứng sử dụng môi trường MS cơ bản + BAP 0,6mg/l + IBA 0,6mg/l không có các chất bổ sung [7].
(1) Các đoạn thân mang nách chồi được cấy lên môi trường MS cơ bản + agar 9,0g/l + bổ sung đường sucrose với hàm lượng từ 10g/l; 20g/l; 30g/l; 40g/l.
(2) Các đoạn thân mang chồi nách được cấy lên môi trường MS cơ bản + agar 9,0g/l + bổ sung than hoạt tính với hàm lượng từ 0,5g/l; 1g/l; 1,5g/l; 2g/l.
(3) Các đoạn thân mang chồi nách được cấy lên môi trường MS cơ bản + agar 9,0g/l + bổ sung nước dừa với hàm lượng từ 50ml/l; 100ml/l; 150ml/l; 200ml/l. (4) Các đoạn thân mang chồi nách được cấy lên môi trường MS cơ bản + agar 9,0g/l + bổ sung khoai tây với hàm lượng từ 10g/l; 20g/l; 30g/l; 40g/l.
Mỗi công thức tiến hành trên 5 bình (30 đoạn thân). Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Đánh giá khả năng sinh trưởng của cây Đảng Sâm sau các thời gian: 2 tuần, 4 tuần và 6 tuần nuôi cấy qua các chỉ tiêu theo dõi sau:
+ Số chồi/mẫu.
+ Chiều cao chồi (cm). + Chất lượng chồi.
Chồi sinh trưởng tốt: Chồi mập, lá xanh đậm.
Chồi sinh trưởng trung bình: Chồi hơi gầy, lá xanh nhạt.
Chồi sinh trưởng kém: Chồi gầy, lá vàng nhạt hoặc xoăn, chồi bị dị dạng. + Số lá/chồi + Màu sắc lá + Màu sắc thân + Số rễ/chồi. + Chiều dài rễ (cm). + Chất lượng rễ.
Rễ tốt: Bề mặt rễ trơn nhẵn, màu vàng hoặc màu trắng sữa. Rễ trung bình: Bề mặt rễ trơn nhẵn, màu vàng nâu.
Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp của hàm lượng đường sucrose, nước dừa, than hoạt tính, khoai tây đến khả năng sinh trưởng của cây Đảng Sâm trong ống nghiệm.
Sử dụng MS cơ bản + BAP 0,6mg/l + IBA 0,6mg/l và các chất bổ sung có hàm lượng tốt nhất ở nội dung 1. Đối chứng là môi trường MS cơ bản + BAP 0,6mg/l + IBA 0,6mg/l không có các chất bổ sung.
Mỗi công thức tiến hành trên 5 bình (30 đoạn thân). Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Đánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển của cây sau các thời gian theo dõi: 2 tuần, 4 tuần và 6 tuần nuôi cấy bằng các chỉ tiêu theo dõi như nội dung 1.