VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu thực vật
Sử dụng cây Đảng Sâm được nuôi cấy trong ống nghiệm của phịng thí nghiệm Cơng nghệ tế bào thực vật - Khoa Sinh học - Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên - Đại học Thái Nguyên cung cấp.
2.1.2. Hoá chất, thiết bị Hoá chất Hoá chất
Sử dụng các loại hóa chất có nguồn gốc từ Đức, Trung Quốc như các chất kích thích sinh trưởng BAP, IBA, nước dừa, đường sucrose, thạch agar, than hoạt tính, khoai tây…
Thiết bị
Thiết bị dùng trong nuôi cấy mô tế bào: Bình tam giác 250ml, pipet, cốc thủy tinh định mức, đũa thủy tinh, bông, giấy làm nút, giấy thấm. Bộ đồ cấy: dao cấy, que cấy, đĩa cấy, buồng cấy vô trùng (Biological Safety Cabinets) của hãng Nuarie (Mĩ), nồi khử trùng (Auto Clave) của hãng Tomy (Nhật), tủ sấy (Carbolite, Anh), máy đo pH, cân kĩ thuật, cân phân tích, bếp điện....
2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Địa điểm: Các thí nghiệm được thực hiện tại phịng Cơng nghệ tế bào thực vật - Khoa Sinh học - Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên cung cấp.
Thời gian nghiên cứu : Thực hiện từ tháng 03 năm 2016 đến tháng 04
năm 2017 tại phịng thí nghiệm Cơng nghệ tế bào thực vật thuộc Khoa Sinh học - Trường Đại học Sư Phạm - Đại học Thái Nguyên.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp nuôi cấy in vitro
Nuôi cấy mô tế bào được tiến hành trên nền môi trường cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962).
Bảng 2.1. Thành phần cơ bản của môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) STT Thành phần hàm lượng(mg/l) STT Thành phần hàm lượng (mg/l) MS 1 11 CuSO4.5H2O 0.025 1 CaCl2 440.00 12 Na2MoO4.2H2O 0.25 MS 2 MS 4 2 KH2PO4 170.00 13 FeSO4.7H2O 27.80 3 KNO3 1900.00 14 Na2EDTA 37.30 4 MgSO4.7H2O 370.00 MS 5 5 NH4NO3 1650.00 15 Glicine 2.00 MS 3 16 Thiamine HCl 0.10 6 H3BO3 6.20 17 Pyridoxine HCl 0.50 7 KI 0.83 18 Nicotinic Acid 0.50
8 MnSO4.4H2O 22.30 19 Myo- inositol 100.00
9 ZnSO4.7H2O 8.60 20 - -
10 CoCl2.6H2O 0.025 21 - -
Nguyên tắc pha môi trường nuôi cấy: Pha môi trường đặc với thành phần và hàm lượngcác chất phù hợp. Môi trường cơ bản là MS, có đầy đủ muối khống, các chất hữu cơ, vitamin…Tất cả các hóa chất phải được tan đều, khơng kết tủa. Mơi trường có bổ sung chất độn là thạch làm giá đỡ không quá rắn hay quá mềm để khi cấy mẫu được dễ dàng. Khử trùng ở nhiệt độ 1200C, áp
suất 0,7at - 1,2at. Sau khi khử trùng để nguội và tiến hành cấy mẫu trong buồng cấy vô trùng.
Các bước cụ thể trong pha môi trường nuôi cấy:
(1) Xác định công thức cần pha.
(2) Đong khoảng 0,6 lít nước cất, đun trên bếp điê ̣n.
(3) Dùng ống đong hoặc pipet để lấy dung dịch MS cơ bản và các chất kích thích sinh trưởng.
(4) Cân đường sucrose, agar, than hoạt tính để riêng từng loại.
(5) Khi nước cất gần sơi thì đổ đường vào, khuấy tan, sau đó cho thạch và than vào khuấy tan hết.
(6) Bổ sung dung dịch hóa chất đã chuẩn bị ở trên. (7) Bổ sung nước cất vào hỗn hợp trên cho đủ 1 lít. (8) Chuẩn đợ pH của hỗn hơ ̣p trong khoảng từ 5,6 - 5,8.
(9) Chia đều cho các bình tam giác (mỗi bình 50 ml mơi trường). Làm nút bơng, nút giấy cho các bình tam giác.
(10) Khử trùng ở nhiệt độ 120oC, áp suất 0,7at - 1,2at. Sau khi khử trùng để nguội và tiến hành cấy mẫu trong buồng cấy vô trùng.
Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của các chất bổ sung đến sự sinh trưởng và phát triển của cây Đảng Sâm trong ống nghiệm.
Để tìm ra mơi trường thích hợp cho nhân giống cây Đảng Sâm trong ống nghiệm, chúng tơi đã bố trí các thí nghiệm thăm dị mơi trường ni cấy.Mẫu là đoạn thân cây Đẳng Sâm được cây trong môi trường MS cơ bản có bổ sung BAP 0,6mg/l + IBA 0,6mg/l +chất phụ gia ( đường, dịch triết khoai tây, than hoạt tính) với nồng độ thay đổi. Đối chứng sử dụng môi trường MS cơ bản + BAP 0,6mg/l + IBA 0,6mg/l khơng có các chất bổ sung [7].
(1) Các đoạn thân mang nách chồi được cấy lên môi trường MS cơ bản + agar 9,0g/l + bổ sung đường sucrose với hàm lượng từ 10g/l; 20g/l; 30g/l; 40g/l.
(2) Các đoạn thân mang chồi nách được cấy lên môi trường MS cơ bản + agar 9,0g/l + bổ sung than hoạt tính với hàm lượng từ 0,5g/l; 1g/l; 1,5g/l; 2g/l.
(3) Các đoạn thân mang chồi nách được cấy lên môi trường MS cơ bản + agar 9,0g/l + bổ sung nước dừa với hàm lượng từ 50ml/l; 100ml/l; 150ml/l; 200ml/l. (4) Các đoạn thân mang chồi nách được cấy lên môi trường MS cơ bản + agar 9,0g/l + bổ sung khoai tây với hàm lượng từ 10g/l; 20g/l; 30g/l; 40g/l.
Mỗi cơng thức tiến hành trên 5 bình (30 đoạn thân). Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Đánh giá khả năng sinh trưởng của cây Đảng Sâm sau các thời gian: 2 tuần, 4 tuần và 6 tuần nuôi cấy qua các chỉ tiêu theo dõi sau:
+ Số chồi/mẫu.
+ Chiều cao chồi (cm). + Chất lượng chồi.
Chồi sinh trưởng tốt: Chồi mập, lá xanh đậm.
Chồi sinh trưởng trung bình: Chồi hơi gầy, lá xanh nhạt.
Chồi sinh trưởng kém: Chồi gầy, lá vàng nhạt hoặc xoăn, chồi bị dị dạng. + Số lá/chồi + Màu sắc lá + Màu sắc thân + Số rễ/chồi. + Chiều dài rễ (cm). + Chất lượng rễ.
Rễ tốt: Bề mặt rễ trơn nhẵn, màu vàng hoặc màu trắng sữa. Rễ trung bình: Bề mặt rễ trơn nhẵn, màu vàng nâu.
Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp của hàm lượng đường sucrose, nước dừa, than hoạt tính, khoai tây đến khả năng sinh trưởng của cây Đảng Sâm trong ống nghiệm.
Sử dụng MS cơ bản + BAP 0,6mg/l + IBA 0,6mg/l và các chất bổ sung có hàm lượng tốt nhất ở nội dung 1. Đối chứng là môi trường MS cơ bản + BAP 0,6mg/l + IBA 0,6mg/l khơng có các chất bổ sung.
Mỗi cơng thức tiến hành trên 5 bình (30 đoạn thân). Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Đánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển của cây sau các thời gian theo dõi: 2 tuần, 4 tuần và 6 tuần nuôi cấy bằng các chỉ tiêu theo dõi như nội dung 1.
2.2.2. Phương pháp xử lí và tính tốn số liệu
Sử dụng tốn thống kê để xác định các chỉ số thống kê như: Trung bình mẫu, phương sai, độ lệch chuẩn và sai số trung bình mẫu với n ≥ 30, α = 0,05. Các số liệu được xử lí trên máy vi tính bằng chương trình Excel [26]. Các phương pháp được sử dụng là phương pháp so sánh nhiều mẫu độc lập theo tiêu chuẩn phi tham số của Kruskal và Wallis, phương pháp phân tích phương sai một nhân tố.
2.2.3. Điều kiện thí nghiệm
Các thí nghiệm in vitro được tiến hành trong điều kiện nhân tạo, các yếu tố vật lí như ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm ln được duy trì ổn định.
+ Ánh sáng: Các mẫu được nuôi cấy dưới ánh đèn Neon với cường độ chiếu sáng 2000 lux, thời gian chiếu sáng 10 - 12 giờ/ngày.
+ Nhiệt độ: Nhiệt độ phịng ni cấy được duy trì trong khoảng 25 ± 20C. + Độ ẩm: Phịng ni cấy có độ ẩm khoảng 70%.