3. Nội dung nghiên cứu
1.4. Một số chất bổ sung trong môi trường nuôi cấy in vitro
1.4.1. Đường
Mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương thức dị dưỡng, mặc dù ở nhiều trường hợp chúng có thể sống bán dị dưỡng nhờ ánh sáng nhân tạo và lục lạp có khả năng quang hợp. Vì vậy việc đưa vào môi trường nuôi cấy nguồn cacbon hữu cơ là điều bắt buộc. Hai dạng đường thường sử dụng nhất là sucrose và glucose, nhưng hiện nay sucrose được sử dụng thông dụng hơn cả. hàm lượngthích hợp phổ biến từ 2% - 3%, song tùy vào
mục đích nuôi cấy có thể thay đổi xuống tới 0,2% (trong chọn dòng) và tăng lên đến 12% (nhằm gây ra cảm ứng mất nước).
Các loại đường khác nhau như fructose, lactose, galactose… cũng được thử nghiệm, nhưng tỏ ra kém hiệu quả và chỉ được sử dụng trong trường hợp đặc biệt [19].
1.4.2. Than hoạt tính
Bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy có tác dụng khử độc. Than hoạt tính cho vào môi trường để hấp thụ các chất màu, các hợp chất phenol… trong trường hợp những chất đó gây ức chế sinh trưởng của mẫu nghiên cứu. Than hoạt tính làm thay đổi môi trường ánh sáng, do môi trường trở nên sẫm khi có nó vì thế có sự kích thích sự hình thành và sinh trưởng của rễ. Than hoạt tính còn là một trong những chất chống oxy hóa tốt. Nhìn chung nó có ảnh hưởng trên 3 mặt: hút các hợp chất cản, hút các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong môi trường nuôi cấy hoặc làm đen môi trường [24].
1.4.3. Nước dừa
Trong nuôi cấy mô và tế bào người ta có thể bổ sung một số hỗn hợp tự nhiên như: nước dừa, dịch chiết mầm lúa mỳ, dịch chiết nấm men, dịch thủy phân casein… làm nguồn bổ sung amino axit hoặc vitamin, đường, khoáng…
Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và kích thích sinh trưởng. Các chất có hoạt tính trong nước dừa hiện đã được chứng minh là myo-insitol và một số amino axit khác. Nước dừa được sử dụng để kích thích sự phân hóa và nhân nhanh chồi ở nhiều loại cây [19].
1.4.4. Khoai tây
Môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật tuy rất đa dạng nhưng đều gồm 1 số thành phần như muối khoáng đa lượng, vi lượng, các vitamim, các amino axit, nguồn cacbon, các chất điều hòa sinh trưởng và các chất hữu cơ bổ sung: nước dừa, dịch chiết nấm mem, dịch chiết khoai tây, bột chuối khô….Tất
cả các hợp chất này đều tham gia vào một hoạc nhiều chức năng trong sự sinh trưởng và phân hóa của thực vật nuôi cấy in vitro. Như vậy việc bổ sung hàm lượng khoai tây vào môi trường nuôi cấy mô tế bào cho thấy có sự khác biệt giữa các MS cơ bản không bổ sung hàm lượng khoai tây [37].
1.5. Tình hình nhân giống cây dược liệu bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ở trong nước và ngoài nước
Ở Việt Nam, công nghệ nuôi cấy mô tế bào phục vụ nhân giống cây trồng đã được triển khai trên 20 năm nay. Nhân giống thương mại quy mô lớn đã đạt được ở một số cây trồng như nhân nhanh giống chuối (khoảng 2 triệu cây/năm), nhân nhanh giống khoai tây sạch bệnh, nhân nhanh các giống mía mới nhập nội năng suất cao, nhân nhanh các dòng bạch đàn chọn lọc và keo lai đạt 3 triệu cây/năm. Công nghệ nhân giống cũng được áp dụng trên nhiều cây trồng khác nhau như dứa, dứa sợi, cà phê, tếch, các cây thuốc quý, các loài lan và cây hoa, cây cảnh, cây ăn quả…Việc thương mại hóa các quy trình công nghệ trên đây là chìa khóa quan trọng để mở ra sự bùng nổ ứng dụng công nghiệp vi nhân giống ở nước ta trong những năm tới [14].
Đối với tài nguyên cây thuốc việc bảo tồn có ý nghĩa hết sức quan trọng. Nhiều loài cây thuốc đang đứng trước nguy cơ bị tuyệt chủng do khai thác quá mức. Với những ưu thế của công nghệ nuôi cấy mô tế bào, việc ứng dụng vào bảo tồn nguồn gen cây thuốc đã được nhiều tác giả quan tâm như:
Năm 2007, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Phú Lịch và cs đã tiến hành nhân giống Thanh hao hoa vàng bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro. Nghiên cứu
cho thấy có thể sử dụng môi trường MS cơ bản hoặc môi trường MS bổ sung BAP 1,5 mg/l hay kinetin 1,5 mg/l để nhân giống cây Thanh hao hoa vàng, môi trường bổ sung NAA 0,3 mg/l là môi trường ra rễ thích hợp nhất [11]. Trong một nghiên cứu khác về cây Thanh hao hoa vàng của tác giả Nguyễn Thị Kim Uyên và cs (2007) đã đề xuất môi trường thích hợp cho sự nhân chồi là LV có
bổ sung BAP 0,3 mg/l, môi trường thích hợp cho nuôi cấy tăng sinh tế bào soma là LV + BA 0,5 mg/l + NAA 0,5 mg/l [27].
Nghiên cứu nuôi cấy rễ bất định sâm Ngọc Linh của tác giả Nguyễn Trung Thành và cs (2007) đã cho thấy môi trường nuôi cấy MS có bổ sung 2,4-D 1 mg/l là tối ưu cho sự hình thành và phát triển mô sẹo của sâm Ngọc Linh; số rễ bất định hình thành cao nhất và tăng trưởng tốt ở hàm lượng IBA 2 mg/l; hàm lượng đường 50 g/l là tối ưu cho sự sinh trưởng của rễ bất định [24].
Nhóm nghiên cứu của Nguyễn Thị Kim Thanh (2008) đã tiến hành nhân giống vô tính in vitro cây Lô hội và thu được kết quả: Môi trường MS bổ sung BAP 2,5 mg/l cho hệ số nhân cao, chất lượng chồi tốt. Bổ sung than hoạt tính 1,5 - 2 g/l cho khả năng ra rễ đạt cao nhất. Giá thể ra cây Lô hội in vitro thích
hợp là cát mịn, tỉ lệ sống cao, cây sinh trưởng phát triển tốt [21].
Tác giả Võ Châu Tuấn và Huỳnh Minh Tư (2010) đã đưa ra môi trường tái sinh chồi in vitro cây Ba kích tím là MS bổ sung kinetin 0,25 mg/l, môi trường nhân chồi là MS bổ sung BAP 3,5 mg/l + IBA 0,2 mg/l, môi trường tạo rễ là MS bổ sung IBA 0,2 - 0,25 mg/l [25].
Vũ Thị Lan và CS (2011) đã đề xuất môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng mô sẹo cây Trinh nữ hoàng cung để thu sinh khối là SB1 (MS + NAA 2,0 mg/l + BAP 0,5 mg/l) và SB2 (MS + NAA 2,0 mg/l + 1,0 mg/l BAP); SK6 (MS + NAA 2,0 mg/l + kinetin 1,0 mg/l) và SK7 (MS + NAA 2,0 mg/l + kinetin 1,5 mg/l); SN9 (MS + NAA 2,0 mg/l + 10% nước dừa) và SN10 (MS + NAA 2,0 mg/l + 20% nước dừa) [10]. Cũng thông qua giai đoạn mô sẹo để nhân nhanh in vitro cây Hoắc hương, tác giả Vũ Thanh Sắc và cs (2012) đã đi đến kết luận, môi trường phù hợp nhất cho tạo mô sẹo từ lá và thân cây Hoắc hương là môi trường MS bổ sung 2,4-D 1,5 mg/l; hàm lượngthan hoạt tính thích hợp nhất cho tạo mô sẹo từ lá hoắc hương in vitro là 0,5 g/l; môi trường tái sinh chồi từ mô sẹo cây hoắc hương tốt nhất là MS bổ sung than hoạt tính 0,5 mg/l, kinetin 1,0 mg/l [16].
Nghiên cứu của Nguyễn Quang Thạch và cs (2012) đã cho thấy: môi trường thích hợp nhất để thực hiện nhân nhanh in vitro Lan Kim Tuyến là Knud* + BAP 0,5 mg/l + kinetin 0,3 mg/l + NAA 0,3 mg/l + sucrose 20 g/l + nước dừa 100 ml/l + dịch chiết khoai tây 100 ml/l + agar 7g/l. Môi trường thích hợp nhất cho sự hình thành rễ tạo cây hoàn chỉnh là: Knud* + IBA 0,5 - 1 mg/l hoặc NAA 1 mg/l + sucrose 20 g/l + nước dừa 100 ml/l + than hoạt tính 5% + agar 7g/l [20].
Kỹ thuật nhân giống cây Sa nhân tím của Nguyễn Văn Hồng và cs (2013) đã cho thấy, khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 15 phút cho tỉ lệ mẫu sạch cao nhất; môi trường phù hợp cho quá trình nhân nhanh chồi là môi trường nền (MS + Đường 30 g/l + Agar 5,2 g/l + Inositol 100 mg/l) bổ sung BAP ở hàm lượng 4 mg/l kết hợp với IAA ở hàm lượng 0,1 mg/l; môi trường phù hợp cho quá trình ra rễ là môi trường nền (MS + Đường 30 g/l + Agar 5,2 g/l + Inositol 100 mg/l) bổ sung IBA 0,1 mg/l [8].
Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất hữu cơ và bạc nitrat (AgNO3) lên sự sinh trưởng và phát triển của cây sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro của Nguyễn Việt Cường và cs (2013), cho thấy dịch chiết chuối ở hàm lượng 10 g/l, tảo spirulina ở hàm lượng 5 mg/l và nước dừa ở tỉ lệ 5% tăng cường sự sinh trưởng và phát triển của sâm Ngọc Linh. Dịch chiết khoai tây ức chế khả năng sinh trưởng của sâm Ngọc Linh in vitro. Riêng AgNO3 làm tăng khả năng sinh trưởng và phát triển in vitro của cây sâm Ngọc Linh ở hàm lượng 2 mg/l [4].
Tác giả Vũ Thị Bạch Phượng và cs (2013) đã tiến hành nghiên cứu nuôi cấy in vitro nguồn nguyên liệu có hoạt tính kháng oxi hóa của cây Thổ tam thất và xác định được rễ in vitro của cây Thổ tam thất có hoạt tính kháng oxi hóa cao nhất, trong rễ in vitro có chứa nhóm hợp chất saponin và flavonoid, đồng thời xác định được NAA 2 mg/l thích hợp cho sự tạo rễ ở cây Thổ tam thất [15].
Nhóm nghiên cứu của Ngô Thanh Tài và cs (2013) đã tiến hành nghiên cứu tác động của ánh sáng đèn LED lên khả năng tăng sinh mô sẹo và sự hình
thành cây hoàn chỉnh từ phôi vô tính cây sâm Ngọc Linh và nhận thấy mô sẹo tăng sinh cao nhất khi được nuôi cấy dưới ánh sáng đèn LED vàng; ánh sáng đèn LED đỏ và LED xanh dương được kết hợp với tỉ lệ 6R + 4B thích hợp cho sự hình thành cây con từ phôi vô tính cây sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro [18]. Đối với cây Đảng Sâm hiện nay các tài liệu nghiên cứu rất hạn chế. Việc nghiên cứu, bảo tồn và phát triển các loại dược liệu, nhất là dược liệu hoang dại là một trong những lĩnh vực phát triển mạnh đi cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học thực vật. Do đó việc nghiên cứu nhân giống cây Đảng Sâm bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật có ý nghĩa quan trọng trong việc bảo tồn. Hi vọng trong thời gian tới sẽ có các nghiên cứu tìm hiểu sâu hơn để có thể xác định được loại, hàm lượng của các hợp chất hóa học trong cây và tác dụng chữa bệnh của nó. Từ đó làm cơ sở cho việc phát triển, bảo tồn và ứng dụng nhiều hơn của cây Đảng Sâm trong y học.
Các nghiên cứu ngoài nước chủ yếu được thực hiện trên các loài họ hàng với cây Đảng Sâm Việt Nam Codonopsis sp. Do điều kiện khoa học tiến bộ nên các khía cạnh nghiên cứu cũng rất đa dạng. Slupki và đồng tác giả (2011) đã công bố về quá trình vi nhân giống cây Codonopsis pilosula (Đảng Sâm bắc). Nhóm nghiên cứu đã tìm ra môi trường tối ưu cho sự phát sinh chồi từ chồi nách là BAP 0,1 mg/l kết hợp với NAA 0,1 mg/l số lượng chồi có thể thu được lên tới 69 chồi/ nách. Tỉ lệ cây tạo rễ in vitro là 98% trong môi trường MS bổ sung IAA 0,5 mg/l [32]. Qui trình tạo mô sẹo từ lá là tốt nhất trong các nguồn nguyên liệu đoạn thân, hạt ở Codonopsis lanceolata (một loài trong họ hoa chuông) [31]. Bên cạnh đó còn rất nhiều nghiên cứu về xác định thành phần hóa học và công dụng của chúng, các phương pháp chiết xuất hợp chất trong các loài Codonopsis sp. ứng dụng trong lĩnh vực y dược.
Chương 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu thực vật
Sử dụng cây Đảng Sâm được nuôi cấy trong ống nghiệm của phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật - Khoa Sinh học - Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên - Đại học Thái Nguyên cung cấp.
2.1.2. Hoá chất, thiết bị Hoá chất Hoá chất
Sử dụng các loại hóa chất có nguồn gốc từ Đức, Trung Quốc như các chất kích thích sinh trưởng BAP, IBA, nước dừa, đường sucrose, thạch agar, than hoạt tính, khoai tây…
Thiết bị
Thiết bị dùng trong nuôi cấy mô tế bào: Bình tam giác 250ml, pipet, cốc thủy tinh định mức, đũa thủy tinh, bông, giấy làm nút, giấy thấm. Bộ đồ cấy: dao cấy, que cấy, đĩa cấy, buồng cấy vô trùng (Biological Safety Cabinets) của hãng Nuarie (Mĩ), nồi khử trùng (Auto Clave) của hãng Tomy (Nhật), tủ sấy (Carbolite, Anh), máy đo pH, cân kĩ thuật, cân phân tích, bếp điện....
2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Địa điểm: Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng Công nghệ tế bào thực vật - Khoa Sinh học - Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên cung cấp.
Thời gian nghiên cứu : Thực hiện từ tháng 03 năm 2016 đến tháng 04 năm 2017 tại phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật thuộc Khoa Sinh học
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp nuôi cấy in vitro
Nuôi cấy mô tế bào được tiến hành trên nền môi trường cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962).
Bảng 2.1. Thành phần cơ bản của môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) STT Thành phần hàm lượng(mg/l) STT Thành phần hàm lượng (mg/l) MS 1 11 CuSO4.5H2O 0.025 1 CaCl2 440.00 12 Na2MoO4.2H2O 0.25 MS 2 MS 4 2 KH2PO4 170.00 13 FeSO4.7H2O 27.80 3 KNO3 1900.00 14 Na2EDTA 37.30 4 MgSO4.7H2O 370.00 MS 5 5 NH4NO3 1650.00 15 Glicine 2.00 MS 3 16 Thiamine HCl 0.10 6 H3BO3 6.20 17 Pyridoxine HCl 0.50 7 KI 0.83 18 Nicotinic Acid 0.50
8 MnSO4.4H2O 22.30 19 Myo- inositol 100.00
9 ZnSO4.7H2O 8.60 20 - -
10 CoCl2.6H2O 0.025 21 - -
Nguyên tắc pha môi trường nuôi cấy: Pha môi trường đặc với thành phần và hàm lượngcác chất phù hợp. Môi trường cơ bản là MS, có đầy đủ muối khoáng, các chất hữu cơ, vitamin…Tất cả các hóa chất phải được tan đều, không kết tủa. Môi trường có bổ sung chất độn là thạch làm giá đỡ không quá rắn hay quá mềm để khi cấy mẫu được dễ dàng. Khử trùng ở nhiệt độ 1200C, áp
suất 0,7at - 1,2at. Sau khi khử trùng để nguội và tiến hành cấy mẫu trong buồng cấy vô trùng.
Các bước cụ thể trong pha môi trường nuôi cấy:
(1) Xác định công thức cần pha.
(2) Đong khoảng 0,6 lít nước cất, đun trên bếp điê ̣n.
(3) Dùng ống đong hoặc pipet để lấy dung dịch MS cơ bản và các chất kích thích sinh trưởng.
(4) Cân đường sucrose, agar, than hoạt tính để riêng từng loại.
(5) Khi nước cất gần sôi thì đổ đường vào, khuấy tan, sau đó cho thạch và than vào khuấy tan hết.
(6) Bổ sung dung dịch hóa chất đã chuẩn bị ở trên. (7) Bổ sung nước cất vào hỗn hợp trên cho đủ 1 lít. (8) Chuẩn độ pH của hỗn hơ ̣p trong khoảng từ 5,6 - 5,8.
(9) Chia đều cho các bình tam giác (mỗi bình 50 ml môi trường). Làm nút bông, nút giấy cho các bình tam giác.
(10) Khử trùng ở nhiệt độ 120oC, áp suất 0,7at - 1,2at. Sau khi khử trùng để nguội và tiến hành cấy mẫu trong buồng cấy vô trùng.
Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của các chất bổ sung đến sự sinh trưởng và phát triển của cây Đảng Sâm trong ống nghiệm.
Để tìm ra môi trường thích hợp cho nhân giống cây Đảng Sâm trong ống nghiệm, chúng tôi đã bố trí các thí nghiệm thăm dò môi trường nuôi cấy.Mẫu là đoạn thân cây Đẳng Sâm được cây trong môi trường MS cơ bản có bổ sung BAP 0,6mg/l + IBA 0,6mg/l +chất phụ gia ( đường, dịch triết khoai tây, than hoạt tính) với nồng độ thay đổi. Đối chứng sử dụng môi trường MS cơ bản + BAP 0,6mg/l + IBA 0,6mg/l không có các chất bổ sung [7].
(1) Các đoạn thân mang nách chồi được cấy lên môi trường MS cơ bản + agar 9,0g/l + bổ sung đường sucrose với hàm lượng từ 10g/l; 20g/l; 30g/l; 40g/l.
(2) Các đoạn thân mang chồi nách được cấy lên môi trường MS cơ bản + agar 9,0g/l + bổ sung than hoạt tính với hàm lượng từ 0,5g/l; 1g/l; 1,5g/l; 2g/l.
(3) Các đoạn thân mang chồi nách được cấy lên môi trường MS cơ bản +