1.6.1. Các nghiên cứu metagenomics trên thế giới
Người đầu tiên đưa ra ý tưởng nhân bản trực tiếp các mẫu DNA từ môi trường là Pace và cộng sự, họ đã chứng minh sự tồn tại của một hệ sinh vật phức tạp chưa từng được nghiên cứu đến [26] . Năm 1991, Pace đã công bố nghiên cứu phân lập các gen cấu trúc từ thư viện gen của hệ vi sinh vật phát triển trên cỏ khô trong điều kiện phòng thí nghiệm [27]. Năm 2002, Breitbart và các đồng nghiệp sử dụng công nghệ metagenomics cho thấy trong 200 lít nước biển chứa hơn 5000 loại virus khác nhau [8]. Các nghiên cứu sau đó cho thấy rằng có hơn một nghìn loài virus trong phân của con người và khoảng một triệu loại virus khác nhau cho mỗi kg trầm tích biển, bao gồm cả thể thực khuẩn [50][54][55][56]. Về cơ bản tất cả các virus đã được phát hiện trong các nghiên cứu này đều là những loài chưa từng được phát hiện. Năm 2004, Tyson và các đồng nghiệp tại Đại học California, Berkeley đã xác định trình tự DNA của hệ vi sinh vật có trong nước thải nhiễm acid [57]. Đây là một bước tiến quan trọng xác định được bộ gen hoàn chỉnh, hoặc gần như hoàn chỉnh của một số vi khuẩn mà trước đây chưa nuôi cấy thành công [23].
Từ năm 2003, Venter đã đi vòng quanh trái đất bằng đường biển nhằm thu thập các mẫu và sử dụng công nghệ metagenomics với mục đích xác định các genome (và theo đó là các sinh vật) mới.Dự án thí điểm, tiến hành trong vùng biển Sargasso, phát hiện DNA của gần 2000 loài khác nhau, trong đó có 148 loài vi khuẩn chưa bao giờ được xác định trước đây [60]. Phân tích hệ sinh vật đất sử dụng công nghệ metagenomics xuất hiện chậm hơn so với những nghiên cứu phân tích hệ sinh vật biển do trong đất thường tồn tại những hợp chất liên kết với DNA hoặc ức chế phản ứng
PCR, gây khó khăn cho việc nhân bản các mẫu DNA từ đất [11]. Tuy nhiên trong những năm gần đây những tiến bộ đáng kể trong nghiên cứu hệ vi sinh vật đất, xây dựng các thư viện gen của các vi sinh vật này đã giúp các nhà khoa học hiểu rõ hơn về hệ sinh vật phức tạp này [32][28].
Các tiến bộ trong kỹ thuật đọc trình tự DNA đã mở ra phương pháp tiếp cận mới cho công nghệ metagenomics. Năm 2006, các nhà khoa học tại Đại học Penn State đã công bố các trình tự thu được từ một mẫu môi trường bằng phương pháp pyrosequencing sử dụng kỹ thuật đọc trình tự 454 – kỹ thuật cho phép đọc tới 400-600 megabases DNA chỉ trong vòng 10 giờ. Kỹ thuật này ra đời cho phép đọc trình tự nucleotit của hệ sinh vật ở quy mô lớn trong một thời gian ngắn [14]. Gần đây công nghệ sinh học đã thay đổi cách tiếp cận trong việc xác định các gen mới, nghiên cứu chức năng của các gen, phân tích thành phần loài và các hệ vi sinh vật... Kỹ thuật metagenomics là một lĩnh vực nghiên cứu mới, đang phát triển mạnh mẽ trong hơn một thập kỷ qua, đã giúp xác định hệ gen của các vi sinh vật không thể nuôi cấy, một mặt hoàn thiện những hiểu biết của con người về các loài vi sinh vật trên trái đất, mặt khác góp phần giải quyết nhu cầu tìm kiếm các enzyme và hợp chất sinh học có ích [7][ 58]
Các nghiên cứu phân tích thành phần và hoạt động của các hệ vi sinh vật tự nhiên cho thấy tiềm năng sản xuất từ các vi sinh vật này các hợp chất sinh học có giá trị cao sử dụng trong y tế như thuốc kháng sinh, các chất chống ung thư và ức chế miễn dịch. Sử dụng kỹ thuật metagenomic để đánh giá tiềm năng và hoạt tính sinh học của quần thể vi sinh vật không thông qua nuôi cấy theo phương pháp cổ điển đã cho thấy tiềm năng ứng dụng kỹ thuật metagenomic trong nghiên cứu khái thác đa dạng sinh học vi sinh vật là rất lớn.
1.6.2. Các nghiên cứu metagenomics tại Việt Nam
Metagenomics là một lĩnh vực nghiên cứu tương đối mới mẻ tại Việt Nam.Tuy nhiên, các trung tâm nghiên cứu cũng như các nhà khoa học Việt Nam đang từng bước tiếp cận với công nghệ giải trình tự thế hệ mới. Viện nghiên cứu các hệ gen thuộc Viện hàn lâm khoa học Việt Nam đã được thành lập để tiến hành các nghiên cứu về hệ gen.
Viện đang nghiên cứu triển khai một số dự án liên quan đến hệ gen người, hệ gen cá tra cũng như các loài sinh vật khác.
Viện di truyền nông nghiệp Việt Nam kết hợp với các viện nghiên cứu tại Vương Quốc Anh vừa tiến hành giải trình tự 36 giống lúa Việt Nam. Dữ liệu hệ gen lúa sẽ cho phép chúng ta tiến hành các nghiên cứu liên quan đến bảo tồn các nguồn gen quý, cũng như tìm ra các gen cho năng suất cao và có khả năng chống chịu được với các điều kiện khí hậu khắc nghiệp như chịu rét, chịu hạn hay chịu mặn.
Các nhóm nghiên cứu về tin sinh học đã và đang tiếp tục được thành lập và phát triển tại các viện nghiên cứu và các trường đại học lớn tại Việt Nam như Đại học công nghệ, ĐHQGHN, Học viện bưu chính viên thông, Đại học sư phạm Hà Nội. Bộ khoa học công nghệ đã tài trợ đề tài độc lập cấp nhà nước “Nghiên cứu các phương pháp phân tích và phát triển các công cụ tin sinh học nhằm giải quyết các bài toán quan trọng trong tin sinh học” từ năm 2009-2011 để phát triển đội ngũ cũng như các công cụ tính toán tin sinh học phục vụ các nghiên cứu tại Việt Nam. Quỹ phát triển Nafosted cũng đã và đang tài trợ nhiều đề tài nghiên cứu cơ bản trong lĩnh vực tin sinh học như “phân tích mô hình biến đổi axit amin của vi rút”, “các phương pháp tính toán hiệu quả giải quyết các bài toán lớn trong sinh học phân tử”. Các nghiên cứu trong các năm gần đây của các nhóm đã được đăng tải trên các tạp chí và hội nghị có uy tin trên thế giới về tin sinh học hay sinh học phân tử. Một số nhóm nghiên cứu tin sinh học đang từng bước tìm hiểu và phát triển các phương pháp liên quan đến phân tích dữ liệu hệ gen. Một số kết quả nghiên cứu đầu liên đã được công bố tại hội nghị quốc tế.
Các trung tâm tính toán hiệu năng cao đã được thành lập và trang bị các hệ thống tính toán tương đối lớn và hiện đại như Trung tâm tính toán hiệu năng cao của trường Đại học khoa học tự nhiên, ĐHQGHN, Trung tâm tính toán hiệu năng cao của Đại học bách khoa Hà Nội, Trung tâm tính toán hiệu năng cao của Đại học sư phạm Hà Nội.Các trung tâm này về cơ bản có thể tham gia vào việc phân tích các dữ liệu hệ gen, kể cá các hệ gen có kích thước lớn như hệ gen người.
Việc áp dụng công nghệ metagenomics vào nghiên cứu hệ gen của vi sinh vật đất, đã và sẽ đóng vai trò to lớn trong các nghiên cứu tiếp theo. Tuy nhiên, tại Việt
Nam chưa có nhiều các nghiên cứu ứng dụng kĩ thuật metagenomics trong nghiên cứu hệ vi sinh vật đất nói chung cũng như hệ vi sinh vật vùng rễ cà phê nói riêng. Vì vậy, nghiên cứu này tập trung đánh giá sự đa dạng, ảnh hưởng của hệ vi sinh vật vùng rễ đến sự sinh trưởng và phát triển của cây cà phê thông qua kĩ thuật metagenomics.
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu nghiên cứu
• Mẫu nghiên cứu:
Mẫu đất vùng rễ cây cà phê được thu thập tại Nông trường cà phê Eapok thuộc huyện Cư M’gra, tỉnh Đắk Lắk. Tỉnh Đắk Lắk thuộc trung tâm cao nguyên Tây Nguyên, trong khoảng tọa độ địa lý từ 107o28'57" đến 108o59'37" độ kinh Đông và từ 12o9'45"đến 13o25'06" độ vĩ Bắc, có độ cao trung bình 400 – 800 mét so với mặt nước biển.
• Hóa chất
Bộ Kit PowerSoil® DNA Isolation (MO BIO) cho quá trình tách DNA từ đất, Bộ kit KAPA2G Robust HotStart Ready Mix (Kapa Biosystems), Agencourt AMPure XP DNA purification kit (Beckman Coulter), Nextera XT index kit (Illumina)
Hóa chất dùng trong điện di DNA: agarose, TAE 1X (Tris - Acetic acide - EDTA), ethidium bromide.
• Máy móc, thiết bị
Máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac300 (Bio-Rad, Mỹ), máy soi DNA (Mini-transllumminatior, Bio-Rad, Mỹ), máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thuỵ Điển), máy vortex (Mimishaker, IKA, Đức), máy ly tâm, Qubit (Invitrogen; LifeTechnologies Europe BV, Monza, Italy), Agilent 2100 Bioanalyser (Agilent Technologies), cùng với các trang thiết bị khác của phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ Sinh học.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp thu mẫu
Mẫu đất được thu tại vùng rễ sâu từ 20-30 cm của các cây cà phê tái canh từ 2 đến 3 năm tuổi và các cây cà phê kinh doanh từ 10 đến 20 năm tuổi vào tháng 8 năm 2015.Tại mỗi khu vực 25 m2 gồm khoảng 3 cây cà phê, chúng tôi tiến hành lấy mẫu đất tại 9 vị trí nhưhình 2.1.
Hình 2.1. Vị trí tiến hành thu mẫu tại một khu vực nghiên cứu
Mẫu đất tại 9 vị trí trong 1 khu vực sau đó được gộp làm một, trộn đều, và chuyển vào các ống corning 50 ml. Mẫu đất được bảo quản trong điều kiện tối,ở -20oC tới khi tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
2.2.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Các mẫu đất thu tại các vùng trồng cà phê được tiến hành tách chiết DNA bằng bộ Kit PowerSoil® DNA Isolation theo quy trình như sau:
• B1: Thêm 0,25 gam mẫu đất vào ống PowerBead
• B2: Lắc hoặc vortex để trộn đều mẫu
• B3: Kiểm tra Giải dung dịch C1. Nếu C1 bị kết tủa, ủ ở 60 C cho đến khi tan trước khi sử dụng
• B4: Thêm 60 l dung dịch C1 và đảo ngược nhiều lần hoặc lắc thời gian ngắn.
• B5: vortex 5-10p tốc độ tối đa
• B6: ly tâm 10.000g 30s ở nhiệt độ phòng, lưu ý nếu li tâm > 10.000g có thể ống sẽ vỡ
• B7: Chuyển nổi sang ống 2 ml, thể tích mong muốn khoảng 400-500 µl
• B8: Thêm 250 l đệm C2 và lắc trong 5 giây. Ủ ở 4 C trong 5 phút
• B9: Ly tâm ở nhiệt độ phòng trong 1 phút 10.000 x g
• B10: chuyển dịch nổi sang ống 2 ml nhưng không nhiều hơn 600 l
• B12: Ly tâm các ống ở nhiệt độ phòng trong 1 phút 10.000 x g
• B13: chuyển dich nổi vào ống 2 ml không nhiều quá 750 l
• B14: Lắc để trộn đệm C4 trước khi sử dụng. Thêm 1200 l đệm C4, lắc hoặc vortex 5 giây
• B15: cho 675 l vào bộ lọc Spin và ly tâm ở 10.000 x g trong 1 phút ở nhiệt độ phòng, đổ dich qua cột và lặp lại cho đến hết dung dịch
• B16: Thêm 500 l đệm C5 ly tâm ở nhiệt độ phòng trong 30 giây ở 10.000 x g
• B17: Loại bỏ các phần dung dịch qua qua cột
• B18: Ly tâm một lần nữa ở nhiệt độ phòng trong 1 phút ở 10.000 x g
• B19: chuyển thận đặt bộ lọc sang ống 2 ml sạch
• B20: Thêm 100 l đệm C6.
• B21: Ly tâm ở nhiệt độ phòng trong 30 giây ở 10.000 x g.
DNA sau khi tách thành công được tiến hành do nồng độ và độ tinh sach bằng máy nano drop, kiểm tra bằng điện di trên agarose 1% và bảo quản ở -20oC
2.2.3. Phương pháp khuếch đại và xác định trình tự các đoạn gen a. Vùng 16S rRNA
Các loài vi sinh vật tách ra từ các mẫu thu thập được được phân loại dựa vào đa hình của 9 vùng gen nằm trên gen 16S ribosome RNA (16S rRNA). Trong nghiên cứu này, đa hình trên hai phân vùng V3 và V4 của vùng 16S rRNA sẽ được tập trung phân tích. Các đoạn 16S rRNA tđược giải trình tự tự động thông qua hệ thống máy MiSeq.
b. Tóm tắt quy trình thiết kế theo hướng dẫn của hãng Ilumina
1. Thiết kế mồi
2. Chuẩn bị thư viện: các đoạn DNA sau khi được khuếch đại được gắn các Illumina sequencing adapter và các vùng barcode index
3. Giải trình tự: Sử dụng bộ kit 300 bp để xác định trình tự các đoạn DNA với 65 giờ trong 1 lần chạy. dữ liệu đầu ra của hệ thống MiSeq xấp xỉ > 20 triệu đoạn đọc (read)
4. Dữ liệu đầu ra của hệ thống được phân tích trên phần mềm MiSeq Sequencing Reporter
Hình 2.2. Quy trình khuếch đại và giải trình tự vùng 16S rRNA 2.2.4. Khuếch đại vùng 16S rRNA
1. Thành phần phản ứng khuếch đại vùng 16S rRNA
Thể tích
DNA vi sinh vật (5 ng/µl) 2,5 µl
Mồi xuôi 16S Amplicon PCR 1 µM 5 µl
Mồi ngược 16S Amplicon PCR 1 µM 5 µl
2X KAPA HiFi HotStart Ready Mix 12,5 µl
Tổng 25 µl
2. Đậy chặt plate 96 giếng và tiến hành chạy PCR sử dụng chương trình sau:
3.Bổ sung 1 µl sản phẩm PCR vào Bioanalyzer DNA 1000 chip để kiểm định kích thước. Kích thước dự kiến sau khuếch đại là 550 bp
95oC 55oC 72oC 72oC 4oC 30 giây 30 giây 30 giây 5 phút ∞ 25 chu kỳ 3 phút 95oC
2.2.5. Tinh sạch sản phẩm PCR
1. Ly tâm đĩa 96 giếng 3000 v/p trong 1 phút ở 20oC. để toàn bộ dịch dồn xuống đáy ống
2. Sử dụng Pipet đa kênh hút toàn bộ 25 µl sản phẩm PCR chuyển sang plate MIDI
3. Vortex các hạt AMPure XP trong 30 giây để đảm bảo các hạt được trộn đều. 4. Sử dụng Pipet đa kênh, bổ sung 20 µl các hạt AMPure XP vào mỗi giếng
của plate MIDI
5. Trộn đều nhẹ nhàng toàn bộ các giếng khoảng 10 lần sau đó đậy chặt nắp và lắc plate MIDI tại 1800 v/p trong 2 phút
6. Ủ ở nhiệt độ phòng trong điều kiện không lắc trong 5 phút
7. Đặt plate trên một giá nam châm trong 2 phút hoặc tới khi quan sát thấy toàn dung dịch chuyển hoàn toàn thành dạng trong suốt
8. Giữ nguyên plate trên giá nam châm, sử dụng pipet đa kênh loại bỏ toàn bộ dịch nổi.
9. Rửa 2 lần với 200 µl cồn 80%, ủ trên giá nam châm 30 giây sau đó loại bỏ toàn bộ dịch nổi
10. Làm khô các hạt tự nhiên trong 10 phút
11.Chuyển plate MIDI khỏi giá nam châm, bổ sung 52,5 µl Tris pH 8,5 ở nồng độ 10 mM vào mỗi giếng
12. Trộn đều nhẹ nhàng 10 lần bằng pipet 13.Ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 phút
14. Đặt plate lên giá nam châmtrong 2 phút hoặc tới khi dung dịch chuyển sang trong suốt
15.Dùng pipet đa kênh thu 50 µl dịch nổi chuyển sang plate 96 giếng mới
2.2.6. Gắn Index (Nextera XT Index kit)
1.Sử dụng pipet đa kênh, chuyển 5 µl từ mỗi giếng sang một plate mới. 2.Sắp xếp các mồi Index 1 và 2 lên rack như trên hình 2.4:
Hình 2.3. Bố trí các ống mẫu A: Mồi Index 2 (Nắp màu trắng) B: Mồi Index 1 (Nắp màu cam) C: Đĩa 96 giếng
3.Thành phần phản ứng
Thể tích
DNA 5 µl
Nextera XT Index Primer 1 5 µl
Nextera XT Index Primer 2 5 µl
2x KAPA HiFi HotStart Ready
Mix 25 µl
Nước khử ion 10 µl
Tổng 50 µl
4.Trộn đều thành phần phản ứng 10 lần 5.Đậy nắp plate với Microseal A
6.Ly tâm plate 3000 v/p trong 1 phút ở 20oC 7.Chạy PCR với chu trình phản ứng
95oC 55oC 72oC 72oC 4oC 30 giây 30 giây 30 giây 5 phút ∞ 8 chu kỳ 3 phút 95oC
2.2.7. Tinh sạch sản phẩm gắn Index
1. Ly tâm plate 96 giếng 1000 v/p trong 1 phút ở 20oC. để toàn bộ dịch dồn xuống đáy ống
2. Sử dụng Pipet đa kênh hút toàn bộ 50 µl sản phẩm PCR chuyển sang plate MIDI
3. Vortex các hạt AMPure XP trong 30 giây để đảm bảo các hạt được trộn đều. 4. Sử dụng Pipet đa kênh, bổ sung 56 µl các hạt AMPure XP vào mỗi giếng
của plate MIDI
5. Trộn đều nhẹ nhàng toàn bộ các giếng khoảng 10 lần sau đó đậy chặt nắp và lắc plate MIDI tại 1800 v/p trong 2 phút
6. Ủ ở nhiệt độ phòng trong điều kiện không lắc trong 5 phút
7. Đặt plate trên một giá nam châm trong 2 phút hoặc tới khi quan sát thấy