Trên tổng số 3.470.415 trình tự phân tích của hệ vi sinh vật ở 4 nhóm mẫu đã phân loại được 51 ngành, 141 lớp, 283 họ, 438 chi và 155 loài. Trên cả 4 khối dữ liệu phân tích các nhóm trình tự có tỉ lệ phần trăm trên tổng số trình tự thấp hơn 0,1% được xếp vào nhóm others, các trình tự không thể phân loại được thống kê trong nhóm unclassified.
3.5.1. Kết quả đánh giá độ đa dạng ở mức phân loại ngành
Qua quá trình chọn lọc và phân tích dữ liệu dựa trên mẫu thu thập được, để làm nổi bật nên vai trò của vi sinh vật đối với giai đoạn phát triển khác nhau của cây cà phê, chúng tôi tiến hành phân tích, so sánh kết quả thu được theo 2 nhóm là cà phê tái canh (cây con) và cà phê kinh doanh (cây trưởng thành). Dựa vào trình tự vi khuẩn phân tích được ở cả bốn quần thể nghiên cứu chúng tôi đã phân loại được 51 ngành, các nhóm trình tự có tỉ lệ phần trăm trên tổng số trình tự thấp hơn 0,1% được phân vào nhóm còn lại, các trình tự không thể phân loại được được thống kê trong nhóm unclassified.
Trong 51 ngành vi sinh vật phân tích được, trong khuôn khổ mục tiêu luận văn chúng tôi tiến hành chọn lọc, đánh giá cấu trúc của một số ngành vi khuẩn chính có khả năng tác động tới khả năng kháng tuyến trùng trong nhóm cà phê tái canh và năng suất trong nhóm cà phê kinh doanh (hình 3.7). Kết quả phân tích cấu trúc vi sinh vật trong đất trồng cà phê thu được sử dụng trong các nghiên cứu tiếp theo mới các mục tiêu đánh giá ảnh hưởng của một số nguyên nhân khác tới sinh trưởng cà phát triển của cây cà phê.
Từ biểu đồ trong hình 3.7 cho thấy các vi sinh vật chủ yếu thuộc nghành Proteobacteria và Acidobacteria chiếm tỉ lệ trên 50% ở cả 4 mẫu nghiên cứu. Tiếp theo là các ngành Actionbacteria, Bacteriodetes, Verucomicrobia, Chloroflexi, Gemmationadetes, Planctomycetes và Nitrospirae. Tuy nhiên số lượng các vi sinh vật trong các ngành trên biến động tùy thuộc vào từng giai đoạn phát triển của cây cà phê. Trong nhóm cà phê tái canh số lượng trình tự xếp vào ngành proteobacteria cao hơn so với cà phê kinh doanh và ngược lại ngành Acidobacteria số lượng trình tự xác định được ở nhóm cà phê kinh doanh nhiều hơn so với nhóm cà phê tái canh. Proteobacteria thuộc phân lớp vi khuẩn gram (-), bao gồm nhiều loại vi khuẩn có khả năng gây bệnh như Escherichia, Salmonella, Vibrio, Helicobacter, Yersinia, các vi khuẩn cố định
đạm và nhiều chi quan trọng khác. Acidobacteria là ngành vi khuẩn phổ biến, các loài
vi khuẩn thuộc ngành này rất đa dạng về mặt sinh lý và phân bố, đặc biệt là trong đất, tuy nhiên số lượng các loài được nuôi cấy chưa nhiều. Actinobacteria là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rất rộng rãi. Trước kia được xếp vào Tản thực vật (nấm), nhưng ngày nay chúng được xếp vào vi khuẩn (Schizomycetes) (https://vi.wikipedia.org/wiki/X%E1%BA%A1_khu%E1%BA%A9n)
Tiếp theo, dưới nghành chúng tôi xác định được 141 lớp trên toàn bộ dữ liệu và chọn ra 15 lớp có số lượng lớn để phân tích (hình 3.8).
3.5.2. Kết quả phân tích cấu trúc thành phần vi khuẩn chiếm ưu thế trong đất vùng rễ ở mức độ phân loại lớp và họ vi khuẩn vùng rễ ở mức độ phân loại lớp và họ vi khuẩn
Kết quả phân tích thành phần vi khuẩn chiếm ưu thế ở mức độ phân loại lớp (Class) được thể hiện ở (hình 3.8). Phân tích dữ liệu metagenomics cho thấy Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gamaproteobacteria, Saprospirae, Actinobacteria, Actinobacteria-6 là 6 lớp phổ biến nhất. Đặc biệt, vi sinh vật thuộc lớp Alphaproteobacteria chiếm số lượng cao hơn hẳn ở trong mẫu cà phê tái canh tốt. Đây là lớp vi khuẩn gram âm bao gồm một số chi vi sinh vật có khả năng quang hợp, chuyển hóa hợp chất C1 như Methylobacterium, cộng sinh như Rhizobium. Vi sinh vật thuộc lớp Betaproteobacteria có khả năng chuyển hóa rất đa dạng, chẳng hạn như Rhodocyclus có thể sử dụng được năng lượng mặt trời. Một số loài khác có thể sử dụng các hợp chất vô cơ để tạo ra năng lượng, như Nitrosomonadales chuyển hóa
nitrat. Gammaproteobacteria bao gồm một số nhóm quan trọng như Enterobacteriaceae, Vibrionaceae, và Pseudomonadaceae. Chúng tôi tiếp tục đánh giá cấu trúc hệ vi khuẩn đất vùng rễ cà phê ở mức độ họ (Family) nhằm lựa chọn những họ vi khuẩn phổ biến trong các mẫu đất.
Hình 3.8. Cấu trúc quần thể vi sinh vật ở mức độ lớp
Ở mức độ họ, chúng tôi xác định được 283 họ trên toàn bộ dữ liệu và chọn ra 13 họ có số lượng OUT lớn để phân tích (Hình 3.8). Từ biểu đồ 3.8 cho ta thấy họ Sphingomonadaceae, Chitinnophagaceae, Xanthomonadaceae, Burkholderiaceae, Chthonlobacteraceae chiếm số lượng lớn. Mặc dù số lượng họ vi sinh vật thu được là đa dạng, nhưng số chi trong cùng một họ thì khác nhau, phụ thuộc vào từng mẫu.
Hình 3.9. Cấu trúc quần thể vi sinh vật ở mức độ họ
Trong nghiên cứu này, chúng tôi chỉ tập trung phân tích các họ các tác động đến sinh trưởng, phát triển của thực vật và môi trường. Sphingomonadaceae là một họ thuộc lớp Alphaproteobacteria có khả năng phân hủy một số hợp chất vòng thơm như dioxin, vì thế nhóm khuẩn này được đặc biệt quan tâm trong các nghiên cứu nhằm khắc phục ô nhiễm môi trường. Trong các mẫu phân tích của chúng tôi, vi sinh vật
thuộc họ Sphingomonadaceae có số lượng giảm gấp đôi trong mẫu nhiễm bệnh so với
các mẫu khác. Trong các mẫu cà phê tái canh tốt, số lượng các vi sinh vật thuộc họ Chitinophagaceae vượt trội hẳn (75729 OTUs) so với mẫu tái canh bệnh (28549 OTUs). Họ Chitinophagaceaebao gồm một số loài có thể thủy phân chitin (thành phần cấu tạo nên vỏ của tuyến trùng) như B. Chitinophaga pinensis, thủy phân của cellulosenhư B. Chitinophaga oryziterrae. Điều này phần nào cho thấy hai họ Sphingomonadaceae và Chitinophagaceae có thể tác động tốt đến sự sinh trưởng và phát triển của cây cà phê.
Họ Xanthomonadaceae và Burkholderiaceae là hai họ có khả năng gây bệnh ở thực vật cũng phát hiệnphổ biến trong các mẫu đất nghiên cứu, kể cả mẫu cà phê kinh doanh năng suất cao.Xanthomonadaceae là nhóm vi khuẩn gây bệnh lớn nhất, bao gồm các loài như Xanthomonas citri, Xanthomonas euvesicatoria, Xanthomonas oryzae và
Xylella fastidiosa. Các vi khuẩn này ảnh hưởng đến các cây trồng quan trọng trong nông nghiệp bao gồm cà chua, chuối, cây có múi, gạo, và cà phê. Tuy nhiên tại mẫu tái canh tốt 2 họ này chiếm một số lượng ưu thế điều này có thể liên quan đến vấn đề tương tác giữa các hệ vi sinh vật mà chúng ta chưa biết tới, còn đối với nhóm cà phê kinh doanh có năng suất cao hệ vi sinh vật tồn tại trong mẫu đã được ổn định nên số lượng các loài vi sinh vật thuộc họ Xanthomonadaceae chiếm ưu thế hơn mẫu năng suất trung bình.
Chúng tôi tiếp tục tiến hành phân tích cấu trúc, thành phần hệ vi khuẩn đất vùng rễ cây cà phê ở mức độ chi (Genus).
3.5.3. Kết quả phân tích cấu trúc hệ vi khuẩn đất vùng rễ ở mức độ chi
Ở mức độ thấp hơn về mặt phân loại, nghiên cứu đã xác định được 438 chi trên toàn bộ dữ liệu phân tích, và chọn ra một số chi quan trọng, được cho là có lợi hay hại trên cây cà phê (Hình 3.10 và 3.11), để tập trung phân tích. Các nhóm có tỉ lệ phần trăm thấp hơn 0,1% được phân vào các nhóm khác. Các trình tự còn lại được xếp nhóm chưa được phân loại.
A B
Hình 3.10. Biểu đồ thể hiện cấu trúc quần thể vi sinh vật có lợi ở mức độ chi
A. Biểu đồ thể hiện cấu trúc quần thể vi sinh vật mức độ chi có lợi trong nhóm cà phê tái canh. B. Biểu đồ thể hiện cấu trúc quần thể vi sinh vật mức độ chi có lợi trong nhóm cà phê kinh doanh
Từ hình 3.10 cho thấy có 11 chi các vi sinh vật có lợi trong đất quanh vùng rễ cây cà phê. Tuy nhiên số lượng loài trong các chi phụ thược vào kiểu cảnh tác và giai đoạn phát triển của cây. Kết quả trong hình 3.9A cho thấy, chi Sphingobium ở mẫu cà phê tái canh có số lượng cao gấp 8 lần so với mẫu cà phê tái canh nhiễm bệnh. Đây làchi bao gồm các loài được biết là có khả năng phân huỷ một loạt các hóa chất gây
độc cho môi trường như các hợp chất thơm và clo, phenol như nonylphenol và pentachlorophenol, thuốc diệt cỏ như (RS)-2-(4-chloro-2-methylphenoxy) propionic acid và hexachlorocyclohexane, và hydrocacbon thơm đa vòng. Chi Chitinophaga
chiếm một số có khả năng phân hủy chitin (vỏ tuyến trùng) và cellulose đây là một chi vi sinh vật đất có ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây cà phê chúng có khả năng phân hủy vỏ chitin của tuyến trùng trong đất. Chi Streptomyces được tìm thấy chủ yếu trong đất và thảm thực vật mục nát. Streptomyces sinh bào tử, tạo mùi đặc trưng, là kết quả từ sản sinh geosmin trong quá trình chuyển hóa các chất. Streptomyces được nghiên cứu rộng rãi và được biết đến nhiều nhất là chi của họ xạ khuẩn (Actinomyces).
Streptomyces thường sống ở đất có vai trò là vi sinh vật phân hủy quan trọng. Chủng vi sinh này sản xuất hơn một nửa số thuốc kháng sinh trên thế giới và đó là sản phẩm có giá trị lớn trong lĩnh vực y tế, chính vì có khả năng sinh kháng sinh nên mẫu cà phê tái canh khỏe mạnh phân tích được lượng Streptomyces gấp 9 lần so với mẫu cà phê tái canh nhiễm bệnh.
Từ hình 3.10 B cho thấy các chi Sphingobium, Chitinophaga, Streptomyces
chiếm ưu thế hơn trong mẫu cà phê kinh doanh năng suất cao. Ngoài các chi đó ra ta thấy Bacillus loài gần như phổ biến trong tự nhiên, ví dụ như trong đất, mà còn xảy ra trong môi trường khắc nghiệt như pH cao ( B. alcalophilus), nhiệt độ cao ( B. thermophilus ), hoặc muối cao ( B. halodurans ). B. thuringiensis tạo ra một độc tố có thể giết côn trùng và do đó đã được sử dụng làm thuốc trừ sâu (Joan L. Slonczewski & John W. Foster (2011), các loại vi sinh vật trên tồn tại trong đất, chúng có tác dụng lên trên vật chủ giúp cây chủ tăng được sức đề kháng với các loại bệnh, nấm, côn trùng hại. Chính vì vậy qua số liệu thu đư
Được nhận thấy trong nhóm cà phê kinh doanh năng suất cao có bacillus cao gấp 3 lần so với nhóm cà phê kinh doanh có năng suất thấp.
A B
Hình 3.11. Biểu đồ thể hiện cấu trúc quần thể vi sinh vật có hại mức độ chi
A. Biểu đồ thể hiện cấu trúc quần thể vi sinh vật có hại mức độ chi trong nhóm cà phê tái canh. B. Biểu đồ thể hiện cấu trúc quần thể vi sinh vật có hại mức độ chi trong nhóm cà phê kinh doanh.
Số lượng và phân bố của các chi có hại đối với sinh trưởng và phát triển của cây cà phê được thế hiện trong hình 3.11 A và 3.11 B, trong đó chi Burkholderia có số lượng lớn. Đặc biệt với nhóm tái canh bệnh, số lượng vi sinh vật cao gấp 13 lần so với nhóm cà phê tái canh tốt.
3.5.4. Kết quả phân tích thành phần một số loài vi khuẩn đặc trưng của hệ vi sinh vật đất vùng rễ cây cà phê.
Phân tích trên toàn bộ dữ liệu, chúng tôi xác định được sự có mặt của 155 loài và chọn ra một số loài đặc trưng để phân tích (Hình 3.12 và 3.13)
A B
Hình 3.12. Biểu đồ thể hiện cấu trúc quần thể vi sinh vật có ích mức độ loài
A. Biểu đồ thể hiện cấu trúc quần thể vi sinh vật có ích mức độ loài trong nhóm cà phê tái canh. B. Biểu đồ thể hiện cấu trúc quần thể vi sinh vật có ích mức độ loài trong nhóm cà phê kinh doanh.
Trong số các loài được phát hiện, S. wittichii chiếm số lượng ưu thế đặc biệt với mẫu tái canh tốt có số lượng cao gấp 5 lần so với mẫu tái canh bệnh. Điều này cho thấy S.wittichii có thểảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và phát triển của cà phê. Các loài S. wittichii là loài có khả năng phân hủy dioxin. Ngoài ra còn có các loài tạo ra các chất khác nhau như G.fujikuroi sản xuất chất kích thích sinh trưởng thực vật, H.
ochraceum chuyển hóa kháng nấm và sinh kháng sinh; R. leguminosarum có khả năng cố định đạm tự do.
A B
Hình 3.13. Biểu đồ thể hiện cấu trúc quần thể vi sinh vật có hại mức độ loài
A. Biểu đồ thể hiện cấu trúc quần thể vi sinh vật có hại mức độ loài trong nhóm cà phê tái canh. B. Biểu đồ thể hiện cấu trúc quần thể vi sinh vật có hại mức độ loài trong nhóm cà phê kinh doanh
Trong số các loài phân tích, có 5 loài có thể gây bệnh trên cà phê và các loài thực vật khác.Kết quả thể hiện ở Hình 3.13 cho thấy, có các loài gây hại cho thực vật điển hình như R. solanacearum gây bệnh héo lá, Fastidiosa gây bệnh lá cháy,
Pseudomonas garcae gây bệnh đốm lá cà phê. Đối với nhóm cà phê tai canh bị bệnh và năng suất thấp ta thấy sự có mặt của các loài Fastidiosa, Pseudomonas garcae và R. solanacearum cao hơn các nhóm tái canh tốt cà năng suất cao. Điều này phần nào cho thấy các chủng này phần nào tác động tới sự phát triển cũng như năng suất của cây cà phê.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1.Kết luận
- Xác định được 512.896 trình tự các đoạn V3 và V4 trên gen 16S rRNA, trong đó 133,661 trình tự cho cà phê tái canh ít bị bệnh,124,574 trình tự cho cà phê tái canh bị bệnh,122,816 trình tự cho cà phê kinh doanh năng suất cao và 131,845 trình tự cho cà phê kinh doanh năng trung bình.
- Kết quả phân tích metagenomic cho thấy chiến đa số là các vi sinh vật vùng rễ cà phê thuộc ngành Proteobacteria, lớp Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gamaproteobacteria, Saprospirae, Actinobacteria, Actinobacteria-6, họ Sphingomonadaceae, Chitinnophagaceae, Xanthomonadaceae, Burkholderiaceae, Chthonlobacteraceae, Streptomycetaceae (33,44%, 41,71%, 41,57% và 40,49% lần lượt cho cà phê tái canh tốt, cà phê tái canh bệnh, cà phê kinh doanh năng suất cao và cà phê kinh doanh năng suất trung bình)
- Chi Sphingobium thuộc họ Sphingomonadaceae, Chitinophaga thuộc họ Chitinnophagaceae, Streptomyces thuộc họ Streptomycetaceae chiếm ứu thế trong mẫu cà phê kinh doanh năng suất cao. Chi Burkholderia thuộc họ Burkholderiaceae phổ biến trong vùng rễ nhóm cá phê tái canh bệnh (cao gấp 13 lần so với nhóm cà phê tái canh tốt).
- Loài Sphingobium wittichii chiếm ưu thế trong rễ cà phê tái canh tốt (gấp 5 lần so với tái canh bệnh). Các loài gây bệnh điển hình trên cây cà phê như R. solanacearum gây bệnh héo lá, Fastidiosa gây bệnh lá cháy, Pseudomonas garcae
gây bệnh đốm lá cà phê cũng phát hiện trong các vùng rễ khác nhau, đặc biệt ở vùng tái canh bệnh.
2. Kiến nghị
Từ kết quả thu được có thể nghiên cứu hướng phát triển sử dụng các chế phẩm sinh học làm tăng các vi sinh vật tự nhiên có lợi và giảm các vi sinh vật có hại, trực tiếp hoặc gián tiếp lên sinh trưởng và phát triển của cây cà phê, nhằm mục tiêu phát triển bền vững, tăng năng suất và chất lượng của cây cà phê Việt Nam.
Tiến hành tiệp tục nghiên cứu để đánh giá sự ảnh hưởng của hệ sinh vật tới khả năng sinh trưởng và phát triển của cà phê.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tham khảo
Tài liệu Tiếng Anh
1.Amann, R. I., Ludwig, W., Schleifer, K. H., (1995) “Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation”. Microbiol. Rev. 59, 143–169.
2.Atkinson, D. and Watson, C. A., (2000) “The beneficial rhizosphere: A dynamic entity”. Appl. Soil Ecol., 15, 99-104.
3.Aragon AD, Torrez-Martinez N, Edwards JS, (2012) “Genomic analysis of Saccharomyces cerevisiae isolates that grow optimally with glucose as the sole carbon source”. Electrophoresis 33(23): 3514-20.
4.Azad AK, Curtis A, Papp A, Webb A, Knoell D, Sadee W, Schlesinger LS, (2013) “Allelic mRNA expression imbalance in C-type lectins reveals a frequent regulatory SNP in the human surfactant protein A (SP-A) gene”. Genes Immun
14(2): 99-106.
5.Barns SM; Cain EC; Sommerville L; Kuske CR, (2007) “Acidobacteria phylum sequences in uranium-contaminated subsurface sediments greatly expand the known diversity within the phylum”. Appl. Environ. Microbiol.73 (9):31136.
6.Beja, O., Koonin, E. V., Aravind, L., Taylor, L. T., (2002) “Comparative genomic analysis of archaeal genotypic variants in a single population and in two different oceanic provinces”. Appl. Environ. Microbiol. 68, 335–345.