Các mẫu đất thu tại các vùng trồng cà phê được tiến hành tách chiết DNA bằng bộ Kit PowerSoil® DNA Isolation theo quy trình như sau:
• B1: Thêm 0,25 gam mẫu đất vào ống PowerBead
• B2: Lắc hoặc vortex để trộn đều mẫu
• B3: Kiểm tra Giải dung dịch C1. Nếu C1 bị kết tủa, ủ ở 60 C cho đến khi tan trước khi sử dụng
• B4: Thêm 60 l dung dịch C1 và đảo ngược nhiều lần hoặc lắc thời gian ngắn.
• B5: vortex 5-10p tốc độ tối đa
• B6: ly tâm 10.000g 30s ở nhiệt độ phòng, lưu ý nếu li tâm > 10.000g có thể ống sẽ vỡ
• B7: Chuyển nổi sang ống 2 ml, thể tích mong muốn khoảng 400-500 µl
• B8: Thêm 250 l đệm C2 và lắc trong 5 giây. Ủ ở 4 C trong 5 phút
• B9: Ly tâm ở nhiệt độ phòng trong 1 phút 10.000 x g
• B10: chuyển dịch nổi sang ống 2 ml nhưng không nhiều hơn 600 l
• B12: Ly tâm các ống ở nhiệt độ phòng trong 1 phút 10.000 x g
• B13: chuyển dich nổi vào ống 2 ml không nhiều quá 750 l
• B14: Lắc để trộn đệm C4 trước khi sử dụng. Thêm 1200 l đệm C4, lắc hoặc vortex 5 giây
• B15: cho 675 l vào bộ lọc Spin và ly tâm ở 10.000 x g trong 1 phút ở nhiệt độ phòng, đổ dich qua cột và lặp lại cho đến hết dung dịch
• B16: Thêm 500 l đệm C5 ly tâm ở nhiệt độ phòng trong 30 giây ở 10.000 x g
• B17: Loại bỏ các phần dung dịch qua qua cột
• B18: Ly tâm một lần nữa ở nhiệt độ phòng trong 1 phút ở 10.000 x g
• B19: chuyển thận đặt bộ lọc sang ống 2 ml sạch
• B20: Thêm 100 l đệm C6.
• B21: Ly tâm ở nhiệt độ phòng trong 30 giây ở 10.000 x g.
DNA sau khi tách thành công được tiến hành do nồng độ và độ tinh sach bằng máy nano drop, kiểm tra bằng điện di trên agarose 1% và bảo quản ở -20oC
2.2.3. Phương pháp khuếch đại và xác định trình tự các đoạn gen a. Vùng 16S rRNA
Các loài vi sinh vật tách ra từ các mẫu thu thập được được phân loại dựa vào đa hình của 9 vùng gen nằm trên gen 16S ribosome RNA (16S rRNA). Trong nghiên cứu này, đa hình trên hai phân vùng V3 và V4 của vùng 16S rRNA sẽ được tập trung phân tích. Các đoạn 16S rRNA tđược giải trình tự tự động thông qua hệ thống máy MiSeq.
b. Tóm tắt quy trình thiết kế theo hướng dẫn của hãng Ilumina
1. Thiết kế mồi
2. Chuẩn bị thư viện: các đoạn DNA sau khi được khuếch đại được gắn các Illumina sequencing adapter và các vùng barcode index
3. Giải trình tự: Sử dụng bộ kit 300 bp để xác định trình tự các đoạn DNA với 65 giờ trong 1 lần chạy. dữ liệu đầu ra của hệ thống MiSeq xấp xỉ > 20 triệu đoạn đọc (read)
4. Dữ liệu đầu ra của hệ thống được phân tích trên phần mềm MiSeq Sequencing Reporter
Hình 2.2. Quy trình khuếch đại và giải trình tự vùng 16S rRNA 2.2.4. Khuếch đại vùng 16S rRNA
1. Thành phần phản ứng khuếch đại vùng 16S rRNA
Thể tích
DNA vi sinh vật (5 ng/µl) 2,5 µl
Mồi xuôi 16S Amplicon PCR 1 µM 5 µl
Mồi ngược 16S Amplicon PCR 1 µM 5 µl
2X KAPA HiFi HotStart Ready Mix 12,5 µl
Tổng 25 µl
2. Đậy chặt plate 96 giếng và tiến hành chạy PCR sử dụng chương trình sau:
3.Bổ sung 1 µl sản phẩm PCR vào Bioanalyzer DNA 1000 chip để kiểm định kích thước. Kích thước dự kiến sau khuếch đại là 550 bp
95oC 55oC 72oC 72oC 4oC 30 giây 30 giây 30 giây 5 phút ∞ 25 chu kỳ 3 phút 95oC
2.2.5. Tinh sạch sản phẩm PCR
1. Ly tâm đĩa 96 giếng 3000 v/p trong 1 phút ở 20oC. để toàn bộ dịch dồn xuống đáy ống
2. Sử dụng Pipet đa kênh hút toàn bộ 25 µl sản phẩm PCR chuyển sang plate MIDI
3. Vortex các hạt AMPure XP trong 30 giây để đảm bảo các hạt được trộn đều. 4. Sử dụng Pipet đa kênh, bổ sung 20 µl các hạt AMPure XP vào mỗi giếng
của plate MIDI
5. Trộn đều nhẹ nhàng toàn bộ các giếng khoảng 10 lần sau đó đậy chặt nắp và lắc plate MIDI tại 1800 v/p trong 2 phút
6. Ủ ở nhiệt độ phòng trong điều kiện không lắc trong 5 phút
7. Đặt plate trên một giá nam châm trong 2 phút hoặc tới khi quan sát thấy toàn dung dịch chuyển hoàn toàn thành dạng trong suốt
8. Giữ nguyên plate trên giá nam châm, sử dụng pipet đa kênh loại bỏ toàn bộ dịch nổi.
9. Rửa 2 lần với 200 µl cồn 80%, ủ trên giá nam châm 30 giây sau đó loại bỏ toàn bộ dịch nổi
10. Làm khô các hạt tự nhiên trong 10 phút
11.Chuyển plate MIDI khỏi giá nam châm, bổ sung 52,5 µl Tris pH 8,5 ở nồng độ 10 mM vào mỗi giếng
12. Trộn đều nhẹ nhàng 10 lần bằng pipet 13.Ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 phút
14. Đặt plate lên giá nam châmtrong 2 phút hoặc tới khi dung dịch chuyển sang trong suốt
15.Dùng pipet đa kênh thu 50 µl dịch nổi chuyển sang plate 96 giếng mới
2.2.6. Gắn Index (Nextera XT Index kit)
1.Sử dụng pipet đa kênh, chuyển 5 µl từ mỗi giếng sang một plate mới. 2.Sắp xếp các mồi Index 1 và 2 lên rack như trên hình 2.4:
Hình 2.3. Bố trí các ống mẫu A: Mồi Index 2 (Nắp màu trắng) B: Mồi Index 1 (Nắp màu cam) C: Đĩa 96 giếng
3.Thành phần phản ứng
Thể tích
DNA 5 µl
Nextera XT Index Primer 1 5 µl
Nextera XT Index Primer 2 5 µl
2x KAPA HiFi HotStart Ready
Mix 25 µl
Nước khử ion 10 µl
Tổng 50 µl
4.Trộn đều thành phần phản ứng 10 lần 5.Đậy nắp plate với Microseal A
6.Ly tâm plate 3000 v/p trong 1 phút ở 20oC 7.Chạy PCR với chu trình phản ứng
95oC 55oC 72oC 72oC 4oC 30 giây 30 giây 30 giây 5 phút ∞ 8 chu kỳ 3 phút 95oC
2.2.7. Tinh sạch sản phẩm gắn Index
1. Ly tâm plate 96 giếng 1000 v/p trong 1 phút ở 20oC. để toàn bộ dịch dồn xuống đáy ống
2. Sử dụng Pipet đa kênh hút toàn bộ 50 µl sản phẩm PCR chuyển sang plate MIDI
3. Vortex các hạt AMPure XP trong 30 giây để đảm bảo các hạt được trộn đều. 4. Sử dụng Pipet đa kênh, bổ sung 56 µl các hạt AMPure XP vào mỗi giếng
của plate MIDI
5. Trộn đều nhẹ nhàng toàn bộ các giếng khoảng 10 lần sau đó đậy chặt nắp và lắc plate MIDI tại 1800 v/p trong 2 phút
6. Ủ ở nhiệt độ phòng trong điều kiện không lắc trong 5 phút
7. Đặt plate trên một giá nam châm trong 2 phút hoặc tới khi quan sát thấy toàn dung dịch chuyển hoàn toàn thành dạng trong suốt
8. Giữ nguyên plate trên giá nam châm, sử dụng pipet đa kênh loại bỏ toàn bộ dịch nổi.
9. Rửa 2 lần với 200 µl cồn 80%, ủ trên giá nam châm 30 giây sau đó loại bỏ toàn bộ dịch nổi
10. Làm khô các hạt tự nhiên trong 10 phút
11.Chuyển plate MIDI khỏi giá nam châm, bổ sung 27,5 µl Tris pH 8,5 ở nồng độ 10 mM vào mỗi giếng
12. Trộn đều nhẹ nhàng 10 lần bằng pipet 13.Ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 phút
14. Đặt plate lên giá nam châmtrong 2 phút hoặc tới khi dung dịch chuyển sang trong suốt
15.Dùng pipet đa kênh thu 25 µl dịch nổi chuyển sang plate 96 giếng mới
2.2.8. Đánh giá thư viện
1.Lấy 1 µl trong tổng thể tích dung dịch thư viện đã pha loãng 50 lần
2.Đưa lên Bioanalyser chip, lựa chọn quy trình V3 và V4 primer, kích thước tính toán trên máy là 630 bp
2.2.9. Biến tính thư viện và giải trình tự trên máy Miseq
Thư viện được biến tính sử dụng NaOH, pha loãng trong buffer, và sau đó biến tính bằng nhiệt trước khi đưa vào máy Miseq để giải trình tự. Mỗi một lượt chạy phải bao gồm tối thiểu 5% PhiX làm đối chứng đối với những thư viện có độ đa dạng thấp. Chuẩn bị:
2.Đưa các thành phần phản ứng của máy Miseq từ các tủ -25oC ra ngoài và làm tan ở điều kiện nhiệt độ phòng
3.Trong một xô đá, chuẩn bị một bể nước đá bằng cách trộn 3 phần đá và 1 phần nước
a. Biến tính DNA
1.Trộn các thành phần thư viện DNA và NaOH0,2 N theo tỷ lệ thể tích như sau: 4nM thư viện DNA (5 µl) và 0,2N NaOH (5 µl)
2.Chuẩn bị đối chứng PhiX tương tự bằng cách trộn PhiX với NaOH 0,2N với tỉ lệ 1:1 (5 µl: 5 µl)
3.Trộn đều dung dịch phản ứng bằng vortex nhanh, và sau đó ly tâm ở 1000 v/p trong 1 phút ở 20oC
4.Ủ hỗn hợp dung dịch trong 5 phút ở nhiệt độ phòng để biến tính hoàn toàn các DNA sợi đôi thành sợi đơn
5.Bổ sung 10 µl sản phẩm DNA đã biến tính vào 990 µl Pre-chilled HT1 6.Đặt DNA biến tính trên đá cho tới khi bước pha loãng thư viện đã sẵn sang
b.Pha loãng thư viện DNA đã biến tính
1.Pha loãng DNA đã biến tính tới nồng độ mong muốn theo bảng sau: (Trong lần chạy đầu tiên, nồng độ thư viện được Illumina đề nghị là 4 pM, tùy thuộc vào khối lượng dữ liệu đầu ra, nồng độ thư viện trong các lần tiếp theo được điều chỉnh tăng giảm cho phù hợp)
Nồng độ cuối cùng 2 pM 4 pM 6 pM 8 pM 10 pM
20 pM Thư viện đã
biến tính 60µl 120 µl 180 µl 240 µl 300 µl
Pre-chilled HT1 540 µl 480 µl 420 µl 360 µl 300 µl
2.Trộn đều hỗn hợp dung dịch bằng cách đảo ngược ống rồi đặt ống mẫu trên đá
c. Biến tính và pha loãng đối chứng PhiX
Sử dụng chỉ dẫn sau đây để biến tính và pha loãng 10 nM thư viện PhiX tới nồng độ tương tự như thư viện của mẫu phân tích. Thư viện trộn lẫn cuối cùng phải bao gồm ít nhất 5% PhiX.
1.Trộn các dung dịch theo tỷ lệ thể tích sau để nồng độ dung dịch cuối cùng đạt 4nM:
a. 10 nM thư viện PhiX (2 µl) b. 10 nM Tris pH 8.5 (3 µl)
2.Pha loãng PhiX trong NaOH theo tỷ lệ thể tích sau: a. 4 nM thư viện PhiX (5 µl)
3.Trộn đều hỗn hợp dung dịch bằng vortex nhanh
4.Ủ hỗn hợp dung dịch ở nhiệt độ phòng trong 5 phút để biến tính thư viện DNA sợi đôi thành sợi đơn
5.Bổ sung 10 µl sản phẩm DNA đã biến tính vào 990 µl Pre-chilled HT1
6.Pha loãng 20 pM thư viện PhiX đã biến tính tới nồng độ giống với thư viện DNA của mẫu phân tích theo bảng sau:
Nồng độ cuối cùng 2 pM 4 pM 6 pM 8 pM 10 pM
20 pM Thư viện đã
biến tính 60µl 120 µl 180 µl 240 µl 300 µl
Pre-chilled HT1 540 µl 480 µl 420 µl 360 µl 300 µl
7.Trộn đều hỗn hợp dung dịch bằng cách đảo ngược ống một vài lần sau đó ly tâm nhanh để toàn bộ dung dịch dồn xuống dưới đáy ống
8.Đặt các ống đã làm phản ứng trên đá
d.Hợp nhất thư viện DNA của mẫu phân tích và mẫu đối chứng
1.Hai thư viện được trộn lẫn theo tỉ lệ thể tích sau:
a. Hỗn hợp dung dịch đã biến tính và pha loãng của mẫu đối chứng PhiX (30 µl)
b. Hỗn hợp dung dịch đã biến tính và pha loãng của mẫu phân tích (570 µl) 2.Sử dụng block nhiệt biến tính hỗn hợp dung dịch trộn lẫn hai thư viện ở 96oC
trong 2 phút
3.Sau khi ủ, trộn đều hỗn hợp dung dịch bằng cách đảo ngược ống và ly tâm nhanh, sau đó giữ trong bể nước đá đã được chuẩn bị từ bước trước
4.Ủ hỗn hợp dung dịch trong bể nước đá trong 5 phút
5.Đưa hỗn hợp dung dịch trộn lẫn giữa 2 thư viện lên MiSeq v3 reagent cartridge
e. Giải trình tự trên máy Miseq
1.Khởi động máy Miseq
2.Sau khi mẫu được đưa lên cartridge, hệ thống yêu cầu khai báo các thông số chạy máy và các chuẩn phân tích mẫu. Khi đó, lựa chọn 16S Metagenomics workflow (quy trình phân tích 16S)
2.2.10.Phân tích dữ liệu
Các bước phân tích được thực hiện thông qua công cụ Qiime. Qiime là gói công cụ mã nguồn mở, tích hợp nhiều kịch bản (script) được lập trình cho các nhà khoa học nghiên cứu sự đa dạng của các hệ vi sinh vật thông qua phân tích trình tự bên trọng hoặc giữa các vùng gen 16S rRNA và 18S rRNA. Qiime thích hợp cho tất cả các nền
tảng giải trình tự như: Illumina, 454, và giải trình tự dựa trên nguyên lý của Sanger. Thiết kế của Qiime phù hợp cho nhiều đối tượng người sử dụng, từ sinh viên tới các chuyên gia sinh phân tích, các câu lệnh được sử dụng dễ hiểu và không yêu cầu các kỹ năng đặc biệt trong quá trình sử dụng. Trình tự vùng V3 và V4 của đoạn 16S rRNA của một mẫu được lắp ráp dựa trên các contig và với các tham số mặc định. Các trình tự chứa các thông tin nhiễu, các vị trí base có độ tin cậy thấp, các đoạn đọc có kích thước nhỏ hơn 400 bp hoặc lớn hơn 460 được loại bỏ. Dữ liệu đáng tin cậy sẽ được so sánh thẳng hàng với các trình tự đã công bố dựa trên cơ sở dữ liệu SILVA. Số lượng các đơn vị phân loại (OTUs) có mức độ tương đồng lần lượt 97%, 95% và 90% được sử dụng để xây dựng đường cong rarefaction, và tính toán các giá trị ACE (abundance based coverage estimator), CHAO (richness), Shannon, Simpson đối với từng mẫu. Kết quả sau khi phân tích được đưa vào phần mềm MEGAN 5 để so sánh mức độ tương đồng và sai khác giữa ba hệ vi sinh vật.
2.2.11.Phương pháp xác định tuyến trùng
a. Phương pháp lọc tĩnh thu tuyến trùng
Rây lọc được xếp một lớp giấy lên trên và đặt vào đĩa Petri, sau đó lấy rễ cho vào rây lọc, điều chỉnh lượng nước vừa ngập rễ trên rây, đậy nắp và đặt yên tĩnh trong 48h ở nhiệt độ phòng. Tuyến trùng sống chui qua rây lọc, lắng đọng xuống đáy đĩa Petri. Nhấc rây ra khỏi đĩa Petri thu lại dịch nước chứa tuyến trùng trong đĩa Petri.
b. Phương pháp đếm tuyến trùng
Tuyến trùng được đếm bằng đĩa đếm tuyến trùng dưới kính hiển vi soi nổi. Nếu mẫu có ít tuyến trùng: Đổ dung dịch tuyến trùng vào đĩa đếm. sau đó lắc nhẹ cho dung dịch tuyến trùng dàn đều. Đếm toàn bộ tuyến trùng theo các dãy ô cho toàn bộ đĩa hay đếm đại diện một số ô hoặc dãy, sau đó tính trung bình một ô và nhân với tổng số ô trong đĩa.
c. Phương pháp định danh tuyến trùng bằng hình thái theo De Grisse (1969)
Ngày thứ nhất: nhặt tuyến trùng chuyển vào giếng chứa 0,5ml dung dịch I (99ml Formalin 40% + 1 ml glycerine). Đặt giếng có tuyến trùng vào bình hút ẩm chứa ethanol 96 %. Để bình hút ẩm trong tủ ấm ở nhiệt độ 40°C ít nhất 12 giờ. Ngày thứ 2: lấy giếng ra khỏi bình hút ẩm, nhỏ vài giọt dung dịch II (95ml ethanol 96% + 5 ml glycerine) đặt trong tủ ấm. Cứ sau 2 giờ thì nhỏ 2 giọt dung dịch II, thực hiện 4 lần. Để giếng qua đêm, bổ sung vài giọt dung dịch III (50ml ethanol 96% + 50ml glycerine). Ngày thứ 3: tuyến trùng nằm trong dung dịch glycerine tinh khiết được sử dụng để lên tiêu bản định loại.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân tính đặc điểm lý hóa và sinh học chung của các mẫu
Dựa vào kiểu canh tác và hiện trạng phát triển, 04 vùng đất trồng cà phê bao gồm cà phê tái canh nhiễm bệnh (TCB), tái canh phát triển tốt (TCT), kinh doanh năng suất cao (NSC; 15-17 tấn/ha) và kinh doạnhnăng suất trung bình (NSTB; 5-6 tấn/ha) được chọn để thu mẫu. Đất tại 9 vị trí trong 1 khu vực được gộp làm một, trộn đều, và sau đó chuyển vào các túi đựng mẫu với trọng lượng khoảng 1 kg cho mỗi mẫu nghiên cứu.
Hình 3.1: Hình ảnh cây cà phê tái canh bệnh và cà phê kinh doanh tại khu vực thu mẫu thí nghiệm.