vắc xin SynflorixTM bằng phƣơng pháp ELISA
Để nhận dạng kháng nguyên trong vắc xin có nhiều phương pháp: Phương pháp trung hòa vi lượng, phương pháp ngưng kết kháng nguyên và kháng thể, phương pháp ngưng kết hạt latex, phương pháp ELISA....tuy nhiên phương pháp ELISA là phương pháp hiện đại mang tính chính xác cao, ít thời gian, độ nhạy lớn; do đó nhà sản xuất đã lựa chọn phương pháp ELISA là phương pháp nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu trong vắc xin SynflorixTM.
Theo khuyến cáo của tổ chức Y tế thế giới và ISO 17025, đối với các phòng thử nghiệm tất cả các quy trình thực hiện cho việc kiểm định chất lượng đều phải được thẩm định, nhằm đảm bảo kết quả thử nghiệm có giá trị và độ tin cậy cao; vắc xin SynflorixTM
là vắc xin mới nhập khẩu vào Việt Nam nên việc kiểm soát chất lượng phải rất chặt chẽ; Và thử nghiệm nhận dạng là một trong thử nghiệm cần thiết phải kiểm tra, ngay cả từ nguyên liệu đầu cho đến thành phẩm cuối cùng;
Tuy phương pháp kiểm định nhận dạng cho vắc xin polysacchide cộng hợp có trong Dược điển Châu Âu nhưng trong Dược điển không ghi rõ phương pháp sử dụng chỉ nói chung là phương pháp miễn dịch và không có quy trình chi tiết cụ thể, mặt khác quy trình nhận dạng 10 kháng nguyên cho vắc xin SynflorixTM tại NICVB chưa sẵn có, quy trình này được thực hiện theo theo phương pháp ELISA của nhà sản xuất, không được chuyển giao giữa nhà sản xuất và Viện kiểm định. Để quy trình nhận dạng được công nhận theo WHO và ISO17025; chính vì vậy quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu trong vắc xin SynflorixTM
cần thẩm định toàn phần. Thẩm định toàn phần cho thử nghiệm nhận dạng cần các thông số (theo bảng 1.1):
+ Giới hạn phát hiện + Độ mạnh
CHƢƠNG 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Quy trình “Nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu trong vắc xin Synflorix™”.
2.2. Vật liệu nghiên cứu
+ Mẫu thử:
- Vắc xin Synflorix™ do GSK sản xuất lô ASPNA620AE, hạn sử dụng: 31/05/2017; dùng để đánh giá độ đặc hiệu, độ mạnh và giới hạn phát hiện của quy trình.
- Vắc xin thương hàn Vi (Typhim Vi) do Sanofi pasteur sản xuất lô: L0035-2, hạn sử dụng: 01/01/2017; dùng để đánh giá độ đặc hiệu của quy trình. + Mẫu chuẩn, hóa chất:
Bảng 2.1. Mẫu chuẩn, hóa chất sử dụng cho thí nghiệm
TT Tên hóa chất Hãng Code
1 NaHCO3 Merck 1.06329 2 Na2CO3 Merck 1.06404 3 Na2HPO4 Merck 1.06586 4 Tween 20 Merck 8.22148 5 H2SO4 Merck 1007312500 6 Dung dịch TMB Bio-rad 172-1072 7 KCl Merck 1.04936 8 KH2PO4 Merck 1.04873 9 BSA Merck 1.12018
TT Tên hóa chất Hãng Code
10 Protein A –peroxidase Sigma P8651
11 Kháng nguyên chuẩn GSK DSPNA022A
12 Kháng huyết thanh đặc hiệu týp 1 GSK RWN1804A02 13 Kháng huyết thanh đặc hiệu týp 4 GSK RWN1806A01 14 Kháng huyết thanh đặc hiệu týp 5 GSK RWN1808A01 15 Kháng huyết thanh đặc hiệu týp 6B GSK RWN1537A04 16 Kháng huyết thanh đặc hiệu týp 7F GSK RWN1810A01 17 Kháng huyết thanh đặc hiệu týp 9V GSK RWN1742A02 18 Kháng huyết thanh đặc hiệu týp 14 GSK RWN1812A03 19 Kháng huyết thanh đặc hiệu týp 18C GSK RWN1815A03 20 Kháng huyết thanh đặc hiệu týp 19F GSK RWN1816A03 21 Kháng huyết thanh đặc hiệu týp 23F GSK RWN1455A01
Mọi dụng cụ và thiết bị đều đã được hiệu chuẩn.
Bảng 2.2. Dụng cụ, thiết bị sử dụng cho thí nghiệm
TT Tên thiết bị Hãng Mã NICVB Hạn hiệu chuẩn
1. Máy đọc ELISA Bio-rad 680 12/2015
2. Tủ ấm 370C Memmert IC 07 12/2015
3. Micropipet 1000 µl Eppendorf 4780475 12/2015 4. Micropipet 200 µl Eppendorf 476444 12/2015 5. Micropipet đa kênh 300 µl Eppendorf 1586225 12/2015
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
Phương pháp nghiên cứu: Thực nghiệm.
2.3.1. Thiết kế thử nghiệm
Để triển khai nghiên cứu thẩm định thử nghiệm nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu trong vắc xin Synflorix™ cần thực hiện các bước sau:
Phân loại thẩm định quy trình
Đây là phương pháp do nhà sản xuất cung cấp vì vậy quy trình thực hiện cho phương pháp này phải được thẩm định và thuộc loại thẩm định toàn phần.
Xác định thông số cần thẩm định và cỡ mẫu nghiên cứu:
Theo quy định của WHO đối với thẩm định toàn phần, thử nghiệm nhận dạng cần thẩm định 3 thông số là:
+ Độ mạnh + Độ đặc hiệu
+ Giới hạn phát hiện
2.3.2. Cỡ mẫu
Thử nghiệm nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu trong vắc xin Synflorix™ là phương pháp in vitro; vì vậy theo quy định việc thẩm định thử nghiệm theo nguyên tắc đối với từng thông số phải được tiến hành với ít nhất là 6 lần thử nghiệm và làm thử nghiệm đúp (2 mẫu) cho mỗi lần thử nghiệm.
2.3.3. Quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu trong vắc xin
SynflorixTM bằng phương pháp ELISA
Hình 2.11. Tóm tắt quy trình nhận dạng týp kháng nguyên phế cầu
1. Kháng nguyên được gắn lên phiến. 2. Cố định kháng nguyên trên phiến. 3. Gắn kháng thể đặc hiệu
4. Bổ sung phức hợp protein A- peroxidase, protein A này là thụ thể cho Fc của phân tử IgG (kháng thể đặc hiệu).
5. Bổ sung cơ chất, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên.
1.5.1.1. Chuẩn bị mẫu và phủ phiến
Lấy mẫu thử: Hỗn 1,5 ml mẫu vắc xin.
Pha loãng 10 lần mẫu thử và chứng dương bằng dung dịch đệm cacbonat 0,05M.
- Nhỏ 100 l dung dịch chứng dương đã pha loãng vào các giếng A1A11, B1B11.
- Nhỏ 100 l dung dịch mẫu thử đã pha loãng vào các giếng C1C11, D1D11.
- Ủ phiến ở 37oC trong 2h.
1.5.1.2. Sau phủ phiến
- Dùng dung dịch rửa phiến PBS Tween 20 để rửa phiến bằng tay, thể tích rửa cho mỗi giếng là 200 l. Lặp lại 4 lần.
- Nhỏ 200 l Dung dịch hậu phủ phiến (post-coating) PBS Tween 20 – BSA 1% vào tất cả các giếng.
- Ủ phiến ở 37oC trong 30 phút.
1.5.1.3. Gắn kháng thể đặc hiệu
- Dùng dung dịch rửa phiến PBS Tween 20 để rửa phiến bằng tay, thể tích rửa cho mỗi giếng là 200 l. Lặp lại 4 lần.
- Pha loãng các kháng thể đặc hiệu bằng dung dịch post-coating. - Nhỏ 100 l dung dịch post-coating vào các giếng A11 - D11.
- Nhỏ 100 l dung dịch kháng thể kháng từng týp đã pha loãng vào các giếng:
o Giếng A1 đến D1: kháng thể kháng týp1. o Giếng A2 đến D2: kháng thể kháng týp4. o Giếng A3 đến D3: kháng thể kháng týp7F. o Giếng A4 đến D4: kháng thể kháng týp14. o Giếng A5 đến D5: kháng thể kháng týp19F. o Giếng A6 đến D6: kháng thể kháng týp5. o Giếng A7 đến D7: kháng thể kháng týp9V. o Giếng A8 đến D8: kháng thể kháng týp18C. o Giếng A9 đến D9: kháng thể kháng týp6B. o Giếng A10 đến D10: kháng thể kháng týp23F. - Ủ phiến ở 37oC trong 1 giờ.
1.5.1.4. Gắn dung dịch cộng hợp
- Pha loãng 5000 lần Protein A-peroxidase bằng dung dịch post-coating. - Dùng dung dịch rửa phiến PBS Tween 20 để rửa phiến bằng tay, thể tích rửa cho mỗi giếng là 200 l. Lặp lại 4 lần.
- Nhỏ 100 l dung dịch cộng hợp đã pha loãng vào các giếng. - Ủ phiến ở 37oC trong 30 phút.
1.5.1.5. Phản ứng hiện màu
- Dùng dung dịch rửa phiến PBS Tween 20 để rửa phiến bằng tay, thể tích rửa cho mỗi giếng là 200 l. Lặp lại 4 lần.
- Nhỏ 100 l dung dịch TMB vào các giếng.
- Ủ phiến ở nhiệt độ phòng trong 20 phút, tránh ánh sáng.
1.5.1.6. Dừng phản ứng
- Nhỏ 50 l dung dịch H2SO4 1N.
- Đo quang ở bước sóng 450 nm và 620 nm.
1.5.1.7. Đọc kết quả
- Ghi các giá trị OD.
- Giá trị cut-off = 6 giá trị trung bình của OD các giếng ở cột 11.
- Phản ứng dương tính - có mặt từng týp kháng nguyên: khi giá trị trung bình của OD ở mẫu thử (tương ứng với từng cột nhỏ kháng thể đặc hiệu đối với từng týp) lớn hơn giá trị cut-off.
- Thử nghiệm có giá trị: dương tính (có mặt) đối với từng týp kháng nguyên trong chứng dương.
2.3.4. Xây dựng quy trình thẩm định cho từng thông số và tiêu chuẩn chấp thuận của từng thông số cần thẩm định thuận của từng thông số cần thẩm định
a. Giới hạn phát hiện (LOD)
Pha loãng bậc 2 vắc xin Synflorix™ ở các độ pha 1/20, 1/40, 1/80, 1/160… ; tiến hành 6 lần thử nghiệm trên cùng một lô vắc xin ở các độ pha khác nhau và làm thử nghiệm đúp (2 mẫu) cho mỗi lần thử nghiệm [10],[37].
Đánh giá kết quả: Độ pha loãng cao nhất mà vẫn cho phản ứng dương tính là giới hạn phát hiện của quy trình.
b. Độ mạnh của quy trình
Độ mạnh của quy trình đánh giá thông qua kết quả của độ lặp lại và độ chính xác trung gian. Khi quy trình đạt độ lặp lại và độ chính xác trung gian thì quy trình đã đạt được độ mạnh [10],[37].
- Độ lặp lại: 1 người làm thử nghiệm trong khoảng thời gian ngắn, tiến hành 6 lần thử nghiệm trên cùng 1 lô mẫu thử vắc xin Synflorix™ và làm thử nghiệm đúp (2 mẫu) cho mỗi lần thử nghiệm
Đánh giá kết quả:
+ Các týp kháng nguyên cho phản ứng dương tính ở các lần thử nghiệm. + Các giá trị OD trung bình của 6 lần thử nghiệm nằm trong khoảng TB
2SD, CV ≤ 20% [10],[37]. * Cách tính hệ số biến thiên
Xác định hệ số biến thiên cho mỗi mẫu theo công thức CV = SD/TB * 100%
Trong đó:
CV: Hệ số biến thiên
SD: Độ lệch chuẩn giữa các lần thử nghiệm
Dựa vào kết quả xác định hệ số biến thiên của các mẫu thử nghiệm để tính khoảng tin cậy 95% của hệ số biến thiên chung cho các mẫu.
- Độ chính xác trung gian: 2 người làm thử nghiệm trong khoảng thời gian khác nhau, mỗi người tiến hành 6 lần thử nghiệm trên cùng 1 lô mẫu thử vắc xin Synflorix™ và làm thử nghiệm đúp (2 mẫu) cho mỗi lần thử nghiệm
Đánh giá kết quả:
+ Với từng người thực hiện, các týp kháng nguyên đều cho phản ứng dương tính ở các lần thử nghiệm.
+ Không có sự khác biệt có ý nghĩa thông kê giữa kết quả của 2 người (p > 0.05, với độ tin cậy 95%), sử dụng phần mềm SPSS [3].
c. Độ đặc hiệu
Do bản chất của phương pháp ELISA là sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể nên chỉ có kháng nguyên đặc hiệu mới có thể kết hợp với kháng thể chuẩn đã biết [10],[37].
Để đánh giá khả năng nhận dạng từng týp kháng nguyên phế cầu khi mẫu thử có các thành phần khác nhau, nhóm nghiên cứu chuẩn bị các mẫu thử như sau:
- Vắc xin Synflorix™ (Mẫu thử 1).
- Vắc xin thương hàn Vi (Typhim Vi) lô số L0035-2 (đã được pha loãng để có hàm lượng 1,0 μg/ml) được thêm vào vắc xin Synflorix™ theo tỉ lệ 1:1 để có hàm lượng kháng nguyên Vi là 1,0 μg/ml (Mẫu thử 2).
- Vắc xin thương hàn Vi (Typhim Vi) lô số L0035-2 đã được pha loãng có hàm lượng kháng nguyên Vi là 1,0 μg/ml (Mẫu thử 3).
Do 7/10 kháng nguyên phế cầu có hàm lượng 1,0 μg/ml, nên nhóm nghiên cứu sẽ chọn hàm lượng kháng nguyên Vi để tiến hành thử nghiệm là 1,0 μg/ml.
Đánh giá kết quả:
+ Dương tính tại các giếng nhỏ mẫu thử vắc xin Synflorix™ (mẫu thử 1), mẫu thử vắc xin Synflorix™ có thêm kháng nguyên Vi (mẫu thử 2).
+ Âm tính tại giếng chỉ nhỏ mẫu thử 3 - vắc xin thương hàn Vi (Typhim Vi).
2.3.5.Cách tính toán giá trị cut-off cho từng thông số
- Giá trị cut-off đóng vai trò quan trọng trong quá trình đánh giá kết quả thử nghiệm cả chứng dương và mẫu thử; vì vậy giá trị cut-off đã được nhà sản xuất nghiên cứu và có công thức tính toán; tùy vào từng thông số mà nhóm nghiên cứu tính toán giá trị cut-off như sau:
Bảng 2.3. Công thức tính giá trị cut-off cho từng thông số
STT Thông số Cách tính giá trị cut-off
1 Giới hạn phát hiện
Chứng dương:
Cut-off = [Giá trị OD trung bình của giếng A11-B11]*6 Mẫu thử:
Cut-off = [Giá trị OD trung bình của giếng C11-D11]*6
2 Độ mạnh
Chứng dương:
Cut-off = [Giá trị OD trung bình của giếng A11-B11]*6 Mẫu thử:
Cut-off = [Giá trị OD trung bình của giếng C11-D11]*6
3 Độ đặc hiệu
Chứng dương:
Cut-off = [Giá trị OD trung bình của giếng A11-B11]*6 Mẫu thử 1:
Cut-off = [Giá trị OD trung bình của giếng C11-D11]*6 Mẫu thử 2:
Cut-off = [Giá trị OD trung bình của giếng E11-F11]*6 Mẫu thử 3:
CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ
3.1. Giới hạn phát hiện
Nhóm nghiên cứu thực hiện 6 lần thử nghiệm đối với mỗi týp kháng nguyên phế cầu có trong vắc xin Synflorix™ ở các độ pha loãng 1/20, 1/40, 1/80,... (pha loãng bậc 2).
Bảng 3.1. Giới hạn phát hiện của thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 1 qua 6 lần thử nghiệm.
Lần thử nghiệm Kết quả ở các độ pha loãng Cut-off
1/40 1/80 1/160 1 0,443 0,279 0,168 0,186 2 0,460 0,318 0,179 0,258 3 0,491 0,375 0,111 0,210 4 0,560 0,327 0,113 0,222 5 0,401 0,321 0,152 0,282 6 0,491 0,306 0,126 0,276
Với độ pha loãng 1/40, 1/80: Các kết quả nhận dạng kháng nguyên týp 1 đều lớn hơn giá trị cut-off. Như vậy vắc xin Synflorix™ ở các độ pha này dương tính với kháng nguyên týp 1.
Ở độ pha 1/160: Các kết quả nhận dạng kháng nguyên týp 1 đều nhỏ hơn giá trị cut-off. Vậy ở độ pha này, vắc xin Synflorix™ âm tính với kháng nguyên týp 1 (bảng 3.1).
Bảng 3.2. Giới hạn phát hiện của thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 4 qua 6 lần thử nghiệm
Lần thử nghiệm Kết quả ở các độ pha loãng Cut-off
1/160 1/320 1/640 1 0,460 0,224 0,151 0,186 2 0,465 0,292 0,125 0,258 3 0,475 0,261 0,105 0,210 4 0,486 0,256 0,197 0,222 5 0,438 0,312 0,172 0,282 6 0,457 0,288 0,193 0,276
Ở độ pha 1/640: Các kết quả nhận dạng kháng nguyên týp 4 đều nhỏ hơn giá trị cut-off. Vậy ở độ pha này, vắc xin Synflorix™ âm tính với kháng nguyên týp 4 (bảng 3.2).
Các kết quả nhận dạng kháng nguyên týp 4 của độ pha loãng 1/160, 1/320: Đều lớn hơn giá trị cut-off. Như vậy vắc xin Synflorix™ ở các độ pha này dương tính với kháng nguyên týp 4.
Vậy độ pha loãng 1/320 là giới hạn phát hiện của kháng nguyên týp 4.
Bảng 3.3. Giới hạn phát hiện của thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 7F qua 6 lần thử nghiệm
Lần thử nghiệm Kết quả ở các độ pha loãng Cut-off
1/20 1/40 1/80 1 0,317 0,239 0,175 0,186 2 0,387 0,267 0,161 0,258 3 0,376 0,231 0,167 0,210 4 0,335 0,234 0,154 0,222 5 0,391 0,288 0,161 0,282 6 0,318 0,294 0,170 0,276
Nhìn bảng 3.3, giới hạn phát hiện của kháng nguyên týp 7F là ở độ pha loãng 1/40 vì các kết quả nhận dạng kháng nguyên týp 7F của độ pha loãng 1/40: Đều lớn hơn giá trị cut-off (vắc xin Synflorix™ ở độ pha này dương tính với kháng nguyên týp 7F). Còn ở độ pha 1/80: Các kết quả nhận dạng kháng nguyên týp 7F đều nhỏ hơn giá trị cut-off (vắc xin Synflorix™ âm tính với kháng nguyên týp 7F).
Bảng 3.4. Giới hạn phát hiện của thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 14 qua 6 lần thử nghiệm
Lần thử nghiệm
Kết quả ở các độ pha loãng
Cut-off 1/40 1/80 1/160 1 0,690 0,332 0,167 0,186 2 0,722 0,384 0,180 0,258 3 0,712 0,421 0,204 0,210 4 0,730 0,490 0,215 0,222 5 0,710 0,482 0,181 0,282 6 0,702 0,474 0,201 0,276
Với độ pha loãng 1/40, 1/80: Các kết quả nhận dạng kháng nguyên týp 14 đều lớn hơn giá trị cut-off. Như vậy vắc xin Synflorix™ ở các độ pha này dương tính với kháng nguyên týp 14.
Ở độ pha 1/160: Các kết quả nhận dạng kháng nguyên týp 14 đều nhỏ hơn giá trị cut-off. Vậy ở độ pha này, vắc xin Synflorix™ âm tính với kháng