thuận của từng thông số cần thẩm định
a. Giới hạn phát hiện (LOD)
Pha loãng bậc 2 vắc xin Synflorix™ ở các độ pha 1/20, 1/40, 1/80, 1/160… ; tiến hành 6 lần thử nghiệm trên cùng một lô vắc xin ở các độ pha khác nhau và làm thử nghiệm đúp (2 mẫu) cho mỗi lần thử nghiệm [10],[37].
Đánh giá kết quả: Độ pha loãng cao nhất mà vẫn cho phản ứng dương tính là giới hạn phát hiện của quy trình.
b. Độ mạnh của quy trình
Độ mạnh của quy trình đánh giá thông qua kết quả của độ lặp lại và độ chính xác trung gian. Khi quy trình đạt độ lặp lại và độ chính xác trung gian thì quy trình đã đạt được độ mạnh [10],[37].
- Độ lặp lại: 1 người làm thử nghiệm trong khoảng thời gian ngắn, tiến hành 6 lần thử nghiệm trên cùng 1 lô mẫu thử vắc xin Synflorix™ và làm thử nghiệm đúp (2 mẫu) cho mỗi lần thử nghiệm
Đánh giá kết quả:
+ Các týp kháng nguyên cho phản ứng dương tính ở các lần thử nghiệm. + Các giá trị OD trung bình của 6 lần thử nghiệm nằm trong khoảng TB
2SD, CV ≤ 20% [10],[37]. * Cách tính hệ số biến thiên
Xác định hệ số biến thiên cho mỗi mẫu theo công thức CV = SD/TB * 100%
Trong đó:
CV: Hệ số biến thiên
SD: Độ lệch chuẩn giữa các lần thử nghiệm
Dựa vào kết quả xác định hệ số biến thiên của các mẫu thử nghiệm để tính khoảng tin cậy 95% của hệ số biến thiên chung cho các mẫu.
- Độ chính xác trung gian: 2 người làm thử nghiệm trong khoảng thời gian khác nhau, mỗi người tiến hành 6 lần thử nghiệm trên cùng 1 lô mẫu thử vắc xin Synflorix™ và làm thử nghiệm đúp (2 mẫu) cho mỗi lần thử nghiệm
Đánh giá kết quả:
+ Với từng người thực hiện, các týp kháng nguyên đều cho phản ứng dương tính ở các lần thử nghiệm.
+ Không có sự khác biệt có ý nghĩa thông kê giữa kết quả của 2 người (p > 0.05, với độ tin cậy 95%), sử dụng phần mềm SPSS [3].
c. Độ đặc hiệu
Do bản chất của phương pháp ELISA là sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể nên chỉ có kháng nguyên đặc hiệu mới có thể kết hợp với kháng thể chuẩn đã biết [10],[37].
Để đánh giá khả năng nhận dạng từng týp kháng nguyên phế cầu khi mẫu thử có các thành phần khác nhau, nhóm nghiên cứu chuẩn bị các mẫu thử như sau:
- Vắc xin Synflorix™ (Mẫu thử 1).
- Vắc xin thương hàn Vi (Typhim Vi) lô số L0035-2 (đã được pha loãng để có hàm lượng 1,0 μg/ml) được thêm vào vắc xin Synflorix™ theo tỉ lệ 1:1 để có hàm lượng kháng nguyên Vi là 1,0 μg/ml (Mẫu thử 2).
- Vắc xin thương hàn Vi (Typhim Vi) lô số L0035-2 đã được pha loãng có hàm lượng kháng nguyên Vi là 1,0 μg/ml (Mẫu thử 3).
Do 7/10 kháng nguyên phế cầu có hàm lượng 1,0 μg/ml, nên nhóm nghiên cứu sẽ chọn hàm lượng kháng nguyên Vi để tiến hành thử nghiệm là 1,0 μg/ml.
Đánh giá kết quả:
+ Dương tính tại các giếng nhỏ mẫu thử vắc xin Synflorix™ (mẫu thử 1), mẫu thử vắc xin Synflorix™ có thêm kháng nguyên Vi (mẫu thử 2).
+ Âm tính tại giếng chỉ nhỏ mẫu thử 3 - vắc xin thương hàn Vi (Typhim Vi).
2.3.5.Cách tính toán giá trị cut-off cho từng thông số
- Giá trị cut-off đóng vai trò quan trọng trong quá trình đánh giá kết quả thử nghiệm cả chứng dương và mẫu thử; vì vậy giá trị cut-off đã được nhà sản xuất nghiên cứu và có công thức tính toán; tùy vào từng thông số mà nhóm nghiên cứu tính toán giá trị cut-off như sau:
Bảng 2.3. Công thức tính giá trị cut-off cho từng thông số
STT Thông số Cách tính giá trị cut-off
1 Giới hạn phát hiện
Chứng dương:
Cut-off = [Giá trị OD trung bình của giếng A11-B11]*6 Mẫu thử:
Cut-off = [Giá trị OD trung bình của giếng C11-D11]*6
2 Độ mạnh
Chứng dương:
Cut-off = [Giá trị OD trung bình của giếng A11-B11]*6 Mẫu thử:
Cut-off = [Giá trị OD trung bình của giếng C11-D11]*6
3 Độ đặc hiệu
Chứng dương:
Cut-off = [Giá trị OD trung bình của giếng A11-B11]*6 Mẫu thử 1:
Cut-off = [Giá trị OD trung bình của giếng C11-D11]*6 Mẫu thử 2:
Cut-off = [Giá trị OD trung bình của giếng E11-F11]*6 Mẫu thử 3:
CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ
3.1. Giới hạn phát hiện
Nhóm nghiên cứu thực hiện 6 lần thử nghiệm đối với mỗi týp kháng nguyên phế cầu có trong vắc xin Synflorix™ ở các độ pha loãng 1/20, 1/40, 1/80,... (pha loãng bậc 2).
Bảng 3.1. Giới hạn phát hiện của thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 1 qua 6 lần thử nghiệm.
Lần thử nghiệm Kết quả ở các độ pha loãng Cut-off
1/40 1/80 1/160 1 0,443 0,279 0,168 0,186 2 0,460 0,318 0,179 0,258 3 0,491 0,375 0,111 0,210 4 0,560 0,327 0,113 0,222 5 0,401 0,321 0,152 0,282 6 0,491 0,306 0,126 0,276
Với độ pha loãng 1/40, 1/80: Các kết quả nhận dạng kháng nguyên týp 1 đều lớn hơn giá trị cut-off. Như vậy vắc xin Synflorix™ ở các độ pha này dương tính với kháng nguyên týp 1.
Ở độ pha 1/160: Các kết quả nhận dạng kháng nguyên týp 1 đều nhỏ hơn giá trị cut-off. Vậy ở độ pha này, vắc xin Synflorix™ âm tính với kháng nguyên týp 1 (bảng 3.1).
Bảng 3.2. Giới hạn phát hiện của thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 4 qua 6 lần thử nghiệm
Lần thử nghiệm Kết quả ở các độ pha loãng Cut-off
1/160 1/320 1/640 1 0,460 0,224 0,151 0,186 2 0,465 0,292 0,125 0,258 3 0,475 0,261 0,105 0,210 4 0,486 0,256 0,197 0,222 5 0,438 0,312 0,172 0,282 6 0,457 0,288 0,193 0,276
Ở độ pha 1/640: Các kết quả nhận dạng kháng nguyên týp 4 đều nhỏ hơn giá trị cut-off. Vậy ở độ pha này, vắc xin Synflorix™ âm tính với kháng nguyên týp 4 (bảng 3.2).
Các kết quả nhận dạng kháng nguyên týp 4 của độ pha loãng 1/160, 1/320: Đều lớn hơn giá trị cut-off. Như vậy vắc xin Synflorix™ ở các độ pha này dương tính với kháng nguyên týp 4.
Vậy độ pha loãng 1/320 là giới hạn phát hiện của kháng nguyên týp 4.
Bảng 3.3. Giới hạn phát hiện của thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 7F qua 6 lần thử nghiệm
Lần thử nghiệm Kết quả ở các độ pha loãng Cut-off
1/20 1/40 1/80 1 0,317 0,239 0,175 0,186 2 0,387 0,267 0,161 0,258 3 0,376 0,231 0,167 0,210 4 0,335 0,234 0,154 0,222 5 0,391 0,288 0,161 0,282 6 0,318 0,294 0,170 0,276
Nhìn bảng 3.3, giới hạn phát hiện của kháng nguyên týp 7F là ở độ pha loãng 1/40 vì các kết quả nhận dạng kháng nguyên týp 7F của độ pha loãng 1/40: Đều lớn hơn giá trị cut-off (vắc xin Synflorix™ ở độ pha này dương tính với kháng nguyên týp 7F). Còn ở độ pha 1/80: Các kết quả nhận dạng kháng nguyên týp 7F đều nhỏ hơn giá trị cut-off (vắc xin Synflorix™ âm tính với kháng nguyên týp 7F).
Bảng 3.4. Giới hạn phát hiện của thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 14 qua 6 lần thử nghiệm
Lần thử nghiệm
Kết quả ở các độ pha loãng
Cut-off 1/40 1/80 1/160 1 0,690 0,332 0,167 0,186 2 0,722 0,384 0,180 0,258 3 0,712 0,421 0,204 0,210 4 0,730 0,490 0,215 0,222 5 0,710 0,482 0,181 0,282 6 0,702 0,474 0,201 0,276
Với độ pha loãng 1/40, 1/80: Các kết quả nhận dạng kháng nguyên týp 14 đều lớn hơn giá trị cut-off. Như vậy vắc xin Synflorix™ ở các độ pha này dương tính với kháng nguyên týp 14.
Ở độ pha 1/160: Các kết quả nhận dạng kháng nguyên týp 14 đều nhỏ hơn giá trị cut-off. Vậy ở độ pha này, vắc xin Synflorix™ âm tính với kháng nguyên týp 14 (bảng 3.4).
Bảng 3.5. Giới hạn phát hiện của thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 19F qua 6 lần thử nghiệm
Lần thử nghiệm
Kết quả ở các độ pha loãng
Cut-off 1/160 1/320 1/640 1 0,388 0,252 0,162 0,186 2 0,379 0,227 0,175 0,258 3 0,410 0,237 0,166 0,210 4 0,404 0,245 0,163 0,222 5 0,438 0,293 0,165 0,282 6 0,407 0,289 0,160 0,276
Ở độ pha 1/640: Các kết quả nhận dạng kháng nguyên týp 19F đều nhỏ hơn giá trị cut-off. Vậy ở độ pha này, vắc xin Synflorix™ âm tính với kháng nguyên týp 19F (bảng 3.5).
Các kết quả nhận dạng kháng nguyên týp 19F của độ pha loãng 1/160, 1/320: Đều lớn hơn giá trị cut-off. Như vậy vắc xin Synflorix™ ở các độ pha này dương tính với kháng nguyên týp 19F.
Vậy độ pha loãng 1/320 là giới hạn phát hiện của kháng nguyên týp 19F.
Bảng 3.6. Giới hạn phát hiện của thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 5 qua 6 lần thử nghiệm
Lần thử nghiệm
Kết quả ở các độ pha loãng
Cut-off 1/320 1/640 1/1280 1 0,587 0,318 0,145 0,186 2 0,520 0,317 0,139 0,258 3 0,697 0,365 0,169 0,210 4 0,684 0,375 0,172 0,222 5 0,510 0,303 0,178 0,282 6 0,512 0,310 0,120 0,276
Nhìn bảng 3.6, giới hạn phát hiện của kháng nguyên týp 5 là ở độ pha loãng 1/640 vì các kết quả nhận dạng kháng nguyên týp 5 của độ pha loãng 1/640: Đều lớn hơn giá trị cut-off (vắc xin Synflorix™ ở độ pha này dương tính với kháng nguyên týp 5). Còn ở độ pha 1/1280: Các kết quả nhận dạng kháng nguyên týp 5 đều nhỏ hơn giá trị cut-off (vắc xin Synflorix™ âm tính với kháng nguyên týp 5).
Bảng 3.7. Giới hạn phát hiện của thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 9V qua 6 lần thử nghiệm
Lần thử nghiệm Kết quả ở các độ pha loãng Cut-off
1/160 1/320 1/640 1 0,526 0,327 0,113 0,186 2 0,510 0,309 0,116 0,258 3 0,556 0,393 0,107 0,210 4 0,594 0,382 0,195 0,222 5 0,599 0,339 0,137 0,282 6 0,506 0,358 0,180 0,276
Với độ pha loãng 1/160, 1/320: Các kết quả nhận dạng kháng nguyên týp 9V đều lớn hơn giá trị cut-off. Như vậy vắc xin Synflorix™ ở các độ pha này dương tính với kháng nguyên týp 9V.
Ở độ pha 1/640: Các kết quả nhận dạng kháng nguyên týp 9V đều nhỏ hơn giá trị cut-off. Vậy ở độ pha này, vắc xin Synflorix™ âm tính với kháng nguyên týp 9V (bảng 3.7).
Do đó giới hạn phát hiện của kháng nguyên týp 9V là ở độ pha loãng 1/320.
Bảng 3.8. Giới hạn phát hiện của thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 18C qua 6 lần thử nghiệm
Lần thử nghiệm Kết quả ở các độ pha loãng Cut-off
1/20 1/40 1/80 1 0,477 0,321 0,124 0,186 2 0,528 0,387 0,143 0,258 3 0,465 0,307 0,126 0,210 4 0,578 0,291 0,175 0,222 5 0,451 0,338 0,101 0,282 6 0,465 0,359 0,171 0,276
Với độ pha loãng 1/20, 1/40: Các kết quả nhận dạng kháng nguyên týp 18C đều lớn hơn giá trị cut-off. Như vậy vắc xin Synflorix™ ở các độ pha này dương tính với kháng nguyên týp 18C.
Ở độ pha 1/80: Các kết quả nhận dạng kháng nguyên týp 18C đều nhỏ hơn giá trị cut-off. Vậy ở độ pha này, vắc xin Synflorix™ âm tính với kháng nguyên týp 18C (bảng 3.8).
Do đó giới hạn phát hiện của kháng nguyên týp 18C là ở độ pha loãng 1/40.
Bảng 3.9. Giới hạn phát hiện của thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 6B qua 6 lần thử nghiệm
Lần thử nghiệm Kết quả ở các độ pha loãng Cut-off
1/40 1/80 1/160 1 0,608 0,373 0,183 0,186 2 0,714 0,472 0,191 0,258 3 0,692 0,387 0,198 0,210 4 0,634 0,418 0,204 0,222 5 0,669 0,469 0,195 0,282 6 0,616 0,392 0,230 0,276
Ở độ pha 1/160: Các kết quả nhận dạng kháng nguyên týp 6B đều nhỏ hơn giá trị cut-off. Vậy ở độ pha này, vắc xin Synflorix™ âm tính với kháng nguyên týp 6B (bảng 3.9).
Các kết quả nhận dạng kháng nguyên týp 6B của độ pha loãng 1/40, 1/80: Đều lớn hơn giá trị cut-off. Như vậy vắc xin Synflorix™ ở các độ pha này dương tính với kháng nguyên týp 6B.
Vậy độ pha loãng 1/80 là giới hạn phát hiện của kháng nguyên týp 6B
Bảng 3.10. Giới hạn phát hiện của thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 23F qua 6 lần thử nghiệm
Lần thử nghiệm Kết quả ở các độ pha loãng Cut-off
1/40 1/80 1/160 1 0,564 0,324 0,158 0,186 2 0,704 0,429 0,189 0,258 3 0,598 0,303 0,192 0,210 4 0,642 0,317 0,156 0,222 5 0,614 0,478 0,260 0,282 6 0,687 0,499 0,188 0,276
Bảng 3.10 cho thấy giới hạn phát hiện của kháng nguyên týp 23F là ở độ pha loãng 1/80 vì các kết quả nhận dạng kháng nguyên týp 23F của độ pha loãng 1/80: Đều lớn hơn giá trị cut-off (vắc xin Synflorix™ ở độ pha này dương tính với kháng nguyên týp 23F). Còn ở độ pha 1/160: Các kết quả nhận dạng kháng nguyên týp 23F đều nhỏ hơn giá trị cut-off (vắc xin Synflorix™ âm tính với kháng nguyên týp 23F).
Hình 3.1. Kết quả xác định giới hạn phát hiện của 10 týp kháng nguyên phế cầu
3.2. Độ mạnh + Độ lặp lại:
Chúng tôi để 1 người làm 6 lần thử nghiệm trên cùng 1 lô mẫu thử vắc xin Synflorix™.
Bảng 3.11. Kết quả 6 lần thử nghiệm nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu Lần thử Nghiệm Týp 1 OD Týp 4 OD Týp 7F OD Týp 14 OD Týp 19F OD Týp 5 OD Týp 9V OD Týp 18C OD Týp 6B OD Týp 23F OD Cut- off 1 1,113 2,116 0,643 1,466 1,425 2,724 2,851 1,031 1,364 1,365 0,282 2 1,092 2,112 0,628 1,339 1415 2,793 2,907 1,068 1,377 1,297 0,318 3 1,084 2,111 0,668 1,395 1,431 2,735 2,865 1,130 1,321 1,276 0,324 4 1,092 2,010 0,713 1,139 1,347 2,736 2,636 1,007 1,369 1,003 0,219 5 1,118 2,118 0,698 1,272 1,293 2,632 2,633 0,935 1,248 1,051 0,309 6 1,070 2,000 0,706 1,141 1,329 2,625 2,570 0,954 1,199 1,075 0,273 Kết luận Dương tính Dương tính Dương tính Dương tính Dương tính Dương tính Dương tính Dương tính Dương tính Dương tính TB + 2 SD 1,131 2,191 0,746 1,560 1,489 2,839 3,036 1,166 1,460 1,483 0,366 TB - 2 SD 1,059 1,965 0,606 1,024 1,257 2,576 2,451 0,876 1,166 0,873 0,209 CV (%) 1,642 2,722 5,213 10,367 4,226 2,431 5,330 7,101 5,609 12,937 13,612
Bảng 3.11 cho thấy: Kết quả của 6 lần thử nghiệm nhận dạng cả 10 týp kháng nguyên phế cầu týp 1, 4, 7F, 14, 19F, 5, 9V, 18C, 6B, 23F trong mẫu thử - vắc xin Synflorix™ đều lớn hơn giá trị cut - off tương ứng nên đều cho kết quả dương tính. Vậy trong mẫu thử - vắc xin Synflorix™ có chứa 10 týp kháng nguyên phế cầu týp 1, 4, 7F, 14, 19F, 5, 9V, 18C, 6B, 23F.
Các kết quả của 6 lần thử nghiệm nhận dạng từng kháng nguyên trong mẫu thử - vắc xin đều nằm trong khoảng TB 2SD và CV < 20%.
Hình 3.2. Kết quả nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu
+ Độ chính xác trung gian:
2 người làm thử nghiệm trong khoảng thời gian khác nhau, mỗi người tiến hành 6 lần thử nghiệm trên cùng 1 lô mẫu thử vắc xin Synflorix™.
Đối chiếu với tiêu chuẩn: Phản ứng dương tính với týp kháng nguyên khi giá trị OD của mẫu thử chứa týp kháng nguyên đó lớn hơn giá trị cut-off. Ở bảng 3.12, kết quả 6 lần thử nghiệm nhận dạng 10 týp kháng nguyên của 2 người đều lớn hơn giá trị cut-off. Như vậy, có mặt 10 kháng nguyên týp 1, 4, 7F, 14, 19F, 5, 9V, 18C, 6B, 23F trong vắc xin Synflorix™. Mặt khác, khi so sánh kết quả của 2 người bằng phần mềm SPSS, ta thu được các giá trị p đều lớn hơn 0.05.
Bảng 3.12. Kết quả 6 lần thử nghiệm nhận dạng 10 týp kháng nguyên do 2 người thực hiện Lần thử Nghiệm Ngƣời thực hiện Týp 1 OD Týp 4 OD Týp 7F OD Týp 14 OD Týp 9F OD Týp 5 OD Týp 9V OD Týp 8C OD Týp 6B OD Týp 23F OD Cut-off 1 1 1,113 2,116 0,643 1,466 1,425 2,724 2,851 1,031 1,364 1,365 0,282 2 1,046 2,178 0,829 1,275 1,388 2,696 2,905 0,994 1,213 1,062 0,366 2 1 1,092 2,112 0,628 1,339 1,415 2,793 2,907 1,068 1,377 1,297 0,318 2 1,109 2,162 0,734 1,296 1,336 2,601 2,852 1,134 1,338 1,098 0,297 3 1 1,084 2,111 0,668 1,395 1,431 2,735 2,865 1,130 1,321 1,276 0,324 2 1,115 2,183 0,872 1,142 1,273 2,588 2,861 1,061 1,332 1,038 0,264 4 1 1,092 2,010 0,713 1,139 1,347 2,736 2,636 1,007 1,369 1,003 0,219