Quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu trong vắc xin

SynflorixTM bằng phương pháp ELISA

Hình 2.11. Tóm tắt quy trình nhận dạng týp kháng nguyên phế cầu

1. Kháng nguyên được gắn lên phiến. 2. Cố định kháng nguyên trên phiến. 3. Gắn kháng thể đặc hiệu

4. Bổ sung phức hợp protein A- peroxidase, protein A này là thụ thể cho Fc của phân tử IgG (kháng thể đặc hiệu).

5. Bổ sung cơ chất, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên.

1.5.1.1. Chuẩn bị mẫu và phủ phiến

Lấy mẫu thử: Hỗn 1,5 ml mẫu vắc xin.

Pha loãng 10 lần mẫu thử và chứng dương bằng dung dịch đệm cacbonat 0,05M.

- Nhỏ 100 l dung dịch chứng dương đã pha loãng vào các giếng A1A11, B1B11.

- Nhỏ 100 l dung dịch mẫu thử đã pha loãng vào các giếng C1C11, D1D11.

- Ủ phiến ở 37oC trong 2h.

1.5.1.2. Sau phủ phiến

- Dùng dung dịch rửa phiến PBS Tween 20 để rửa phiến bằng tay, thể tích rửa cho mỗi giếng là 200 l. Lặp lại 4 lần.

- Nhỏ 200 l Dung dịch hậu phủ phiến (post-coating) PBS Tween 20 – BSA 1% vào tất cả các giếng.

- Ủ phiến ở 37oC trong 30 phút.

1.5.1.3. Gắn kháng thể đặc hiệu

- Dùng dung dịch rửa phiến PBS Tween 20 để rửa phiến bằng tay, thể tích rửa cho mỗi giếng là 200 l. Lặp lại 4 lần.

- Pha loãng các kháng thể đặc hiệu bằng dung dịch post-coating. - Nhỏ 100 l dung dịch post-coating vào các giếng A11 - D11.

- Nhỏ 100 l dung dịch kháng thể kháng từng týp đã pha loãng vào các giếng:

o Giếng A1 đến D1: kháng thể kháng týp1. o Giếng A2 đến D2: kháng thể kháng týp4. o Giếng A3 đến D3: kháng thể kháng týp7F. o Giếng A4 đến D4: kháng thể kháng týp14. o Giếng A5 đến D5: kháng thể kháng týp19F. o Giếng A6 đến D6: kháng thể kháng týp5. o Giếng A7 đến D7: kháng thể kháng týp9V. o Giếng A8 đến D8: kháng thể kháng týp18C. o Giếng A9 đến D9: kháng thể kháng týp6B. o Giếng A10 đến D10: kháng thể kháng týp23F. - Ủ phiến ở 37oC trong 1 giờ.

1.5.1.4. Gắn dung dịch cộng hợp

- Pha loãng 5000 lần Protein A-peroxidase bằng dung dịch post-coating. - Dùng dung dịch rửa phiến PBS Tween 20 để rửa phiến bằng tay, thể tích rửa cho mỗi giếng là 200 l. Lặp lại 4 lần.

- Nhỏ 100 l dung dịch cộng hợp đã pha loãng vào các giếng. - Ủ phiến ở 37oC trong 30 phút.

1.5.1.5. Phản ứng hiện màu

- Dùng dung dịch rửa phiến PBS Tween 20 để rửa phiến bằng tay, thể tích rửa cho mỗi giếng là 200 l. Lặp lại 4 lần.

- Nhỏ 100 l dung dịch TMB vào các giếng.

- Ủ phiến ở nhiệt độ phòng trong 20 phút, tránh ánh sáng.

1.5.1.6. Dừng phản ứng

- Nhỏ 50 l dung dịch H2SO4 1N.

- Đo quang ở bước sóng 450 nm và 620 nm.

1.5.1.7. Đọc kết quả

- Ghi các giá trị OD.

- Giá trị cut-off = 6  giá trị trung bình của OD các giếng ở cột 11.

- Phản ứng dương tính - có mặt từng týp kháng nguyên: khi giá trị trung bình của OD ở mẫu thử (tương ứng với từng cột nhỏ kháng thể đặc hiệu đối với từng týp) lớn hơn giá trị cut-off.

- Thử nghiệm có giá trị: dương tính (có mặt) đối với từng týp kháng nguyên trong chứng dương.