3. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp khử trùng hạt, tạo cây con nuôi cấy in vitro
Mẫu nuôi cấy là hạt đậu Nho nhe trưởng thành có thể nhiễm nấm mốc và vi khuẩn vì vậy cần phải khử trùng để loại bỏ.
Chọn khoảng 100-150 hạt đậu Nho nhe: hạt mẩy, vỏ bóng mịn, rốn hạt rõ, hạt có màu vàng nâu. Tiến hành khử trùng trong box cấy. Hạt đậu Nho nhe được chọn tráng qua nước cất vô trùng 2-3 lần sau đó khử trùng bề mặt bằng cách lắc nhẹ trong cồn 70 độ với thời gian 1 phút, sau đó tráng lại bằng nước cất khử trùng 3 lần. Thêm dung dịch Javen, lắc đều trong 20-25 phút, sau đó rửa bằng nước cất khử trùng 3 đến 4 lần. Thí nghiệm với các nồng độ Javen và thời gian khác nhau như sau để tìm kết quả tốt nhất:
Javen 50%, trong thời gian 15 phút, 20 phút, 25 phút; Javen 60%, trong thời gian 15 phút, 20 phút, 25 phút; Javen 70%, trong thời gian 15 phút, 20 phút, 25 phút;
Môi trường hạt nảy mầm: Hạt sau khi khử trùng được thấm khô bằng giấy thấm khử trùng và cấy vào bình tam giác chứa môi trường nảy mầm GM bảng 2.1 có bổ sung agar 9g/l, sucrose 30g/l. Nuôi bình hạt trong phòng nuôi
cấy có ánh sáng 2000 lux, nhiệt độ 25 ± 2oC, thời gian chiếu sáng 12 giờ/ ngày.
Ngày tuổi của hạt nảy mầm được tính kể từ khi gieo hạt. Khảo sát khả năng nảy mầm hạt sau 7 ngày, theo dõi tỷ lệ nảy mầm của hạt.
2.2.2. Tái sinh chồi đậu Nho nhe thông qua mô sẹo
Hạt đậu Nho nhe sau khi gieo nảy mầm (6-7 ngày tuổi), lựa chọn các cây con có lá thật, kích thước 3-4 cm, tiến hành dùng kéo thu lá, cắt bỏ viền lá và gân chính. Sau đó cắt thành những mảnh lá có kích thước khoảng 0,5 x 1cm đặt vào môi trường cảm ứng mô sẹo gồm: MS, sucrose 30g/l, agar 9g/l, pH=5,8, 2,4-D (0-4mg/l). Cấy mật độ 6 mẫu/ bình môi trường loại 250ml.
Mẫu được chia thành hai lô, ở lô thứ nhất, mẫu nuôi cấy dưới ánh sáng
đèn neon với cường độ chiếu sáng 2000 lux, nhiệt độ 25 ± 2oC, thời gian chiếu
sáng 12 giờ/ ngày. Ở lô thứ hai, mẫu được nuôi cấy 7 ngày trong tối, sau đó được đưa ra nuôi cấy 2 tuần dưới điều kiện phòng nuôi cấy (ánh sáng 2000 lux,
mô sẹo, đánh giá chất lượng mô sẹo trên các công thức thí nghiệm. Công thức đối chứng sử dụng môi trường MS, sucrose 30g/l, agar 9g/l, không bổ sung các chất kích thích sinh trưởng.
Đánh giá tỷ lệ tạo mô sẹo thu được sau 3 tuần nuôi cấy theo công thức:
Ci (%) = 𝑁𝑐𝑝
𝑁𝑡 x 100%
Trong đó:
Ncp: Số lá tạo mô sẹo
Nt: Tổng số lá nuôi cấy
Ci: Tỷ lệ tạo mô sẹo
Sau 3 tuần nuôi cấy, các mô sẹo tốt nhất tạo ra từ lá trên môi trường cảm ứng mô sẹo được cấy chuyển sang môi trường cảm ứng chồi SIM bảng 2.1.
Mỗi công thức thí nghiệm tiến hành trên 30 mẫu. Đánh giá tái sinh chồi theo công thức:
Rc = 𝑁𝑟
𝑁𝑠𝑣(%) Trong đó
Rc: Tỷ lệ tái sinh chồi (%);
Nr: Tổng số mô tái sinh chồi;
Nsv: Tổng số mô nuôi cấy;
2.2.3.Tái sinh đa chồi đậu Nho nhe thông qua nách lá mầm và chồi ngọn
(1) Nách lá mầm:
Hạt đậu Nho nhe sau khi gieo nảy mầm (3-4 ngày tuổi) thì tiến hành dùng dao cắt bỏ phần thân và rễ mầm, vết cắt dưới mắt lá mầm khoảng 2-3mm. Tách đôi 2 lá mầm thành 2 mẫu cấy riêng biệt sao cho phần thân mầm còn lại được chia đều cho 2 lá mầm. Cắt ngang bỏ phần đuôi lá mầm, tiếp đến hủy bỏ chồi chính và gây tổn thương nách lá mầm bằng cách dùng mũi dao nhọn chích nhẹ
mẫu cấy. Sau đó các mẫu cấy được cấy úp nghiêng 45 độ trên môi trường cảm ứng chồi SIM bảng 2.1. Cấy với mật độ 6 mẫu/ bình môi trường loại 250ml, nuôi cấy trong 8 tuần.
(2) Chồi ngọn:
Hạt đậu Nho nhe sau khi gieo nảy mầm (5-6 ngày tuổi), tiến hành dùng kéo cắt lấy đoạn ngọn (3-4cm) ra khỏi bình, tiếp đó cắt lấy phần chồi ngọn (0,5- 1cm), cắt bỏ lá giữ lại phần cuống lá và chồi ngọn. Sau đó các mẫu cấy được cấy vào môi trường cảm ứng chồi SIM bảng 2.1. Cấy với mật độ 6 mẫu/ bình môi trường loại 250ml, nuôi cấy trong 8 tuần.
Đánh giá tỷ lệ tạo đa chồi trên từng vật liệu nghiên cứu (nách lá mầm, chồi ngọn) sau 8 tuần theo công thức:
Ci (%) = 𝑁𝑐𝑝
𝑁𝑡 x 100%
Trong đó:
Ci: Tỷ lệ tái sinh chồi ;
Ncp: Tổng số mẫu tái sinh chồi ;
Nt: Tổng số mẫu nuôi cấy ;
2.2.4. Môi trường ra rễ
Khi chồi đạt chiều cao từ 4-5cm, chuyển sang môi trường ra rễ RM bảng 2.2. để tạo cây hoàn chỉnh. Mỗi bình cấy từ 3-4 mẫu. Đánh giá khả năng hình thành và phát triển rễ của cây tái sinh sau 8 tuần.
Bảng 2.1. Thành phần các loại môi trường nuôi cấy dùng cho hệ thống tái sinh cây đậu Nho nhe
Loại môi trường Ký
hiệu Thành phần cơ bản
Cảm ứng nảy mầm GM MS*;sucrose 30g/l; agar 9g/l; pH = 5,8
Cảm ứng tạo đa chồi SIM
MS*; BAP (0,5, 1, 1,5, 2mg/l); sucrose 30g/l; agar 9g/l; nước dừa 10%; pH = 5,8 MS*; Kinetine (0,5, 1, 1,5, 2mg/l); sucrose 30g/l; agar 9g/l; pH = 5,8
Cảm ứng ra rễ RM MS*; IBA (0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5mg/l);
sucrose 30g/l; agar 9g/l; pH = 5,8
Chú thích: MS*: Môi trường cơ bản của Murashige và Skoog, 1962 [23]. Các khâu nuôi cấy từ tạo cảm ứng đa chồi đến khi ra rễ được tiến hành ở
nhiệt độ dao động trong khoảng 25oC ± 2oC, dưới ánh sáng đèn của phòng cây
với cường độ 2000 lux, thời gian chiếu sáng 12 giờ/ ngày.
2.2.5. Ra cây và chế độ chăm sóc
Các bình nuôi cấy chứa cây tái sinh hoàn chỉnh được chuyển ra khỏi phòng nuôi cấy để trong phòng có ánh sáng và nhiệt độ bình thường 2-3 ngày để cây thích nghi. Sau đó mở nút bông, cho nước vào ngâm, lắc nhẹ cho thạch rời khỏi rễ cây. Dùng panh kẹp nhẹ kéo cây ra khỏi bình tam giác, rửa hết thạch bám quanh rễ bằng nước sạch sau đó trồng trên các loại giá thể khác nhau bảng 2.2. Pha loãng dung dịch MS cơ bản 10 lần tưới nhẹ vào gốc, cứ 5 tiếng tưới 1 lần. Sử dụng mái che chắn cho cây khỏi các tác động trực tiếp từ môi trường tự nhiên (nắng, mưa, gió…). Sau khi cây sống ra rễ và lá mới, có thể đưa ra ngoài vườn ươm.
Bảng 2.2. Giá thể nuôi cây Công thức Giá thể Tỷ lệ CT1 Đất thịt 100% CT2 Đất : Trấu 2:1 CT3 Đất : Cát 2:1 CT4 Cát : Trấu 1:1
2.2.6. Phương pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu
Sử dụng bộ phần mềm SPSS để phân tích các trị số thống kê như trung bình mẫu, sai số và so sánh sự khác nhau giữa các trị số trung bình ở mức ý nghĩa α = 0,05.
Chương 3.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ KHỬ TRÙNG HẠT ĐẬU NHO NHE
Vô trùng mẫu cấy là bước đầu tiên đóng vai trò quyết định sự thành công
của việc xây dựng hệ thống tái sinh in vitro. Vì vậy, cần lựa chọn phương pháp
khử trùng và loại hóa chất thích hợp để loại bỏ hoàn toàn các nguồn vi khuẩn, nấm mốc, virus khỏi mẫu trước khi đưa vào môi trường nuôi cấy. Có rất nhiều loại hóa chất được sử dụng để khử trùng. Tuy nhiên, nồng độ khử trùng thích hợp cho các đối tượng khác nhau là hoàn toàn khác nhau.
Hạt đậu Nho nhe là loại hạt nhỏ, giàu chất dinh dưỡng điều kiện lý tưởng cho các loại vi sinh vật, nấm mốc phát triển. Vì vậy, việc nghiên cứu đưa ra công thức khử trùng tối ưu là rất cần thiết để chuẩn bị mẫu cho quá trình nuôi cấy in vitro tiếp theo. Phương pháp khử trùng thích hợp phải đảm bảo được các yêu cầu, tỷ lệ hạt bị nhiễm thấp, thân mầm to, mập và chồi sinh trưởng phát triển tốt.
Chúng tôi đã tiến hành vô trùng sơ bộ hạt đậu Nho nhe bằng cách lắc nhẹ
hạt trong cồn 700 1 phút và javen ở các nồng độ 50%, 60%, 70% với ngưỡng
thời gian khác nhau 15, 20, 25 phút. Sau khi khử trùng, hạt được cấy vào môi trường MS có bổ sung sucrose 30 g/l và agar 9 g/l. Ðánh giá khả năng thu được mẫu sạch và khả năng nảy mầm của hạt là bước tiếp theo để tìm ra công thức khử trùng tốt nhất.
Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, đối với công thức khử trùng 1, sử dụng dung dịch Javen pha loãng 50% cho thấy tỷ lệ mẫu nhiễm rất cao, tỷ lệ nảy mầm thấp. Cụ thể với thời gian khử trùng là 15, 20, 25 phút tỷ lệ mẫu nhiễm lần lượt là 30%, 23%, 17%, tỷ lệ nảy mầm lần lượt 70%, 77%, 82%. Nếu tăng thời gian khử trùng tỷ lệ mẫu nhiễm có thể sẽ giảm nhưng tỷ lệ mẫu nhiễm độc sẽ tăng ảnh hưởng tới khả năng nảy mầm của hạt cũng như chất lượng chồi.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ Javen và thời gian khử trùng đến sự nảy mầm của hạt đậu Nho nhe sau 7 ngày nuôi cấy
CT Javen (%) Thời gian khử trùng (phút) Số mẫu (hạt) Kết quả Mẫu nhiễm (%) Mẫu chết (%) Mẫu sạch (%) Nảy mầm (%) Javen 50% CT1 50 15 100 30 0 70 70 CT2 50 20 100 23 0 77 77 CT3 50 25 100 17 1 83 82 Javen 60% CT1 60 15 100 8 1 92 91 CT2 60 20 100 1 1 99 98 CT3 60 25 100 1 9 99 90 Javen 70% CT1 70 15 100 1 15 99 84 CT2 70 20 100 0 24 100 76 CT3 70 25 100 0 35 100 65
Ở công thức khử trùng 3, sử dụng dung dịch Javen pha loãng 70% cho thấy khi tăng thời gian khử trùng lên tỷ lệ mẫu nhiễm rất thấp nhưng tỷ lệ mẫu chết tăng cao. Cụ thể với thời gian khử trùng là 15, 20, 25 phút số tỷ lệ mẫu
chết lần lượt là 15%, 24%, 35% mặc dù tỷ lệ mẫu sạch ở thời gian 20, 25 phút là 100%. Như vậy, đây chưa phải nồng độ thích hợp để khử trùng hạt.
Ở công thức khử trùng 2, với dung dịch javen pha loãng 60% tỷ lệ mẫu nhiễm giảm đáng kể đồng thời tỷ lệ mẫu sạch và tỷ lệ hạt nảy mầm tăng cao. Ở thời gian khử trùng là 15 phút thì tỷ mẫu nhiễm là 8%, thời gian 20, 25 phút thì tỷ lệ mẫu sạch nảy mầm rất cao lần lượt là 98%, 90% tuy nhiên mẫu chết lại xuất hiện ở thời gian khử trùng 25 phút với tỷ lệ 9%. Như vậy, từ số liệu trên cho thấy công thức khử trùng thích hợp nhất là javen 60% với thời gian khử trùng là 20 phút.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, javen nồng độ 60% với thời gian 20 phút là điều kiện thích hợp nhất cho khử trùng hạt đậu Nho nhe, tỷ lệ mẫu sạch 100%, khả năng hạt bị chết thấp đảm bảo tỷ lệ nảy mầm cao 98% và chất lượng chồi tốt. Trong thực tế hạt đậu là đối tượng khó khử trùng, nếu khử trùng bằng Javen ở nồng độ quá cao và thời gian quá dài thì tỷ lệ hạt bị tổn thương, bị chết cao, hạt nảy mầm kém và không đồng đều. Ngược lại, nếu nồng độ Javen thấp thì không đủ liều lượng để làm sạch cũng như diệt các vi sinh vật, nấm mốc nên tỷ lệ nhiễm sau khi cấy cao.
3.2. TÁI SINH IN VITRO CÂY ĐẬU NHO NHE
3.2.1. Tái sinh chồi đậu Nho nhe từ mô sẹo
Sử dụng mảnh lá cho thí nghiệm cảm ứng tạo mô sẹo. Lá đậu Nho nhe 6 ngày tuổi được cắt thành các mảnh nhỏ có kích thước khoảng 0,5 x 1cm, cấy trên môi trường cảm ứng tạo mô sẹo gồm: MS, sucrose 30g/l, agar 9g/l; pH= 5,8, 2,4-D (0-4mg/l), mẫu được chia thành 2 lô thí nghiệm. Ở lô thứ nhất, mẫu nuôi cấy dưới ánh sáng đèn neon với cường độ chiếu sáng 2000 lux, nhiệt độ
25 ± 2oC. Ở lô thứ hai, mẫu được nuôi cấy 7 ngày trong tối, sau đó được đưa ra
nuôi cấy 2 tuần dưới điều kiện phòng nuôi cấy (ánh sáng 2000 lux, nhiệt độ 25
± 2oC, thời gian chiếu sáng 12 giờ/ ngày).
Sau 3 tuần nuôi cấy, ở lô thứ 2 với 2,4-D nồng độ từ 0,5-3,5mg/l tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo là rất cao 95-100%, hầu hết tất cả các mẫu lá đều tạo mô sẹo tuy nhiên tính chất mô sẹo có sự khác nhau ở các nồng độ. Cụ thể ở nồng độ 0,5mg/l; 1,5mg/l các mô sẹo đều màu trắng, đặc và có nhiều rễ không thích hợp cho quá trình tái sinh. Ở các nồng độ 2,0-3,5mg/l tỷ lệ tạo mô sẹo giảm dần song tính chất mô sẹo đều không thích hợp cho quá trình tái sinh. Ở công thức đối chứng và 2,4-D nồng độ 4mg/l không tạo mô sẹo.
Xét đồng thời các chỉ tiêu cho thấy 2,4-D nồng độ 1,0mg/l là công thức thích hợp nhất cho quá trình tạo mô sẹo từ mảnh lá ở cây đậu Nho nhe.
Trong đó, ở lô thứ nhất các mẫu nuôi cấy đặt trong điều kiện phòng nuôi
cấy ánh sáng đèn neon với cường độ chiếu sáng 2000 lux, nhiệt độ 25 ± 2oC
Hình 3.2. Hình ảnh mô sẹo tạo từ mảnh lá sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường bổ sung 2,4-D 1mg/l
Các mô sẹo có chất lượng tốt nhất được thu từ mảnh lá được cấy chuyển sang môi trường cảm ứng tạo chồi SIM ở bảng 2.1. Sau 4 tuần theo dõi, ở các nồng độ BAP, kinetine khác nhau (0,5-2mg/l), các mẫu cấy đều không có khả năng tái sinh, các mẫu cấy trở nên đen và mủn (Hình 3.3.).
Hình 3.3. Mô sẹo nuôi cấy trên môi trường SIM sau 4 tuần
3.2.2. Tái sinh chồi đậu Nho nhe từ nách lá mầm và chồi ngọn
Tái sinh chồi từ lá mầm
Đối với nhóm đậu đỗ nói riêng và nhóm cây hai lá mầm nói chung thì việc sử dụng nách lá mầm làm vật liệu tái sinh đa chồi được xem như một phương pháp nhanh chóng và tương đối hiệu quả đem lại tỷ lệ đa chồi cao. Nách lá mầm đã được nghiên cứu trên nhiều đối tượng đặc biệt là các loại thuộc họ
Đậu: đậu Xanh [20], [30], đậu tương [25], Vigna mugo [35], lạc [39]…. Xuất phát từ những nghiên cứu trước, chúng tôi đã sử dụng lá mầm của cây đậu Nho nhe (3-4 ngày tuổi) để tạo đa chồi, mẫu cấy được cấy trên môi trường cảm ứng tạo đa chồi bảng 2.1, với các nồng độ khác nhau từ 0,5-2mg/l để thăm dò nồng độ thích hợp.
Sau khi cấy trên môi trường cảm ứng chồi SIM, mẫu cấy trở lên xanh hơn, diện tích bề mặt lá mầm, nách lá mầm tăng nhanh. Sau 2 tuần, ở khu vực gây tổn thương bằng kim nhọn sùi lên có màu trắng đục (Hình 3.4A). Sau 4 tuần, màu sắc của lá mầm trở nên vàng hơn, các vết sùi khô lại, có màu nâu, ngừng phát triển (Hình 3.4B). Sau 6-8 tuần, lá mầm chuyển sang màu vàng, các khối mô sùi đen lại và chết, không có hiện tượng cảm ứng chồi (Hình 3.4C).
A (Sau 2 tuần) B (Sau 4 tuần) C (Sau 6-8 tuần)
Hình 3.4. Nách lá mầm được nuôi cấy trên môi trường cảm ứng chồi SIM Trong thí nghiệm này, mỗi công thức được tiến hành trên 30 mẫu, thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Sau 8 tuần, toàn bộ các mẫu cấy đều chết và không có hiện tượng cảm ứng chồi. Từ kết quả thí nghiệm trên có thể nhận thấy rằng chưa tìm được công thức tạo đa chồi phù hợp với vật liệu nách lá mầm.
Tái sinh chồi từ chồi ngọn
Hạt đậu Nho nhe sau khi gieo nảy mầm (5-6 ngày tuổi), tiến hành dùng kéo cắt lấy đoạn ngọn (3-4 cm) ra khỏi bình, tiếp đó cắt lấy phần chồi ngọn (0,5-1 cm), cắt bỏ lá giữ lại phần cuống lá và chồi ngọn. Sau đó các mẫu cấy được cấy vào môi trường cảm ứng chồi SIM ở bảng 2.1, theo dõi và đánh giá tỷ lệ đa chồi sau 8 tuần nuôi cấy.