3. Nội dung nghiên cứu
3.2. Tái sinh in vitro cây đậu Nho nhe
3.2.1. Tái sinh chồi đậu Nho nhe từ mô sẹo
Sử dụng mảnh lá cho thí nghiệm cảm ứng tạo mô sẹo. Lá đậu Nho nhe 6 ngày tuổi được cắt thành các mảnh nhỏ có kích thước khoảng 0,5 x 1cm, cấy trên môi trường cảm ứng tạo mô sẹo gồm: MS, sucrose 30g/l, agar 9g/l; pH= 5,8, 2,4-D (0-4mg/l), mẫu được chia thành 2 lô thí nghiệm. Ở lô thứ nhất, mẫu nuôi cấy dưới ánh sáng đèn neon với cường độ chiếu sáng 2000 lux, nhiệt độ
25 ± 2oC. Ở lô thứ hai, mẫu được nuôi cấy 7 ngày trong tối, sau đó được đưa ra
nuôi cấy 2 tuần dưới điều kiện phòng nuôi cấy (ánh sáng 2000 lux, nhiệt độ 25
± 2oC, thời gian chiếu sáng 12 giờ/ ngày).
Sau 3 tuần nuôi cấy, ở lô thứ 2 với 2,4-D nồng độ từ 0,5-3,5mg/l tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo là rất cao 95-100%, hầu hết tất cả các mẫu lá đều tạo mô sẹo tuy nhiên tính chất mô sẹo có sự khác nhau ở các nồng độ. Cụ thể ở nồng độ 0,5mg/l; 1,5mg/l các mô sẹo đều màu trắng, đặc và có nhiều rễ không thích hợp cho quá trình tái sinh. Ở các nồng độ 2,0-3,5mg/l tỷ lệ tạo mô sẹo giảm dần song tính chất mô sẹo đều không thích hợp cho quá trình tái sinh. Ở công thức đối chứng và 2,4-D nồng độ 4mg/l không tạo mô sẹo.
Xét đồng thời các chỉ tiêu cho thấy 2,4-D nồng độ 1,0mg/l là công thức thích hợp nhất cho quá trình tạo mô sẹo từ mảnh lá ở cây đậu Nho nhe.
Trong đó, ở lô thứ nhất các mẫu nuôi cấy đặt trong điều kiện phòng nuôi
cấy ánh sáng đèn neon với cường độ chiếu sáng 2000 lux, nhiệt độ 25 ± 2oC
Hình 3.2. Hình ảnh mô sẹo tạo từ mảnh lá sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường bổ sung 2,4-D 1mg/l
Các mô sẹo có chất lượng tốt nhất được thu từ mảnh lá được cấy chuyển sang môi trường cảm ứng tạo chồi SIM ở bảng 2.1. Sau 4 tuần theo dõi, ở các nồng độ BAP, kinetine khác nhau (0,5-2mg/l), các mẫu cấy đều không có khả năng tái sinh, các mẫu cấy trở nên đen và mủn (Hình 3.3.).
Hình 3.3. Mô sẹo nuôi cấy trên môi trường SIM sau 4 tuần
3.2.2. Tái sinh chồi đậu Nho nhe từ nách lá mầm và chồi ngọn
Tái sinh chồi từ lá mầm
Đối với nhóm đậu đỗ nói riêng và nhóm cây hai lá mầm nói chung thì việc sử dụng nách lá mầm làm vật liệu tái sinh đa chồi được xem như một phương pháp nhanh chóng và tương đối hiệu quả đem lại tỷ lệ đa chồi cao. Nách lá mầm đã được nghiên cứu trên nhiều đối tượng đặc biệt là các loại thuộc họ
Đậu: đậu Xanh [20], [30], đậu tương [25], Vigna mugo [35], lạc [39]…. Xuất phát từ những nghiên cứu trước, chúng tôi đã sử dụng lá mầm của cây đậu Nho nhe (3-4 ngày tuổi) để tạo đa chồi, mẫu cấy được cấy trên môi trường cảm ứng tạo đa chồi bảng 2.1, với các nồng độ khác nhau từ 0,5-2mg/l để thăm dò nồng độ thích hợp.
Sau khi cấy trên môi trường cảm ứng chồi SIM, mẫu cấy trở lên xanh hơn, diện tích bề mặt lá mầm, nách lá mầm tăng nhanh. Sau 2 tuần, ở khu vực gây tổn thương bằng kim nhọn sùi lên có màu trắng đục (Hình 3.4A). Sau 4 tuần, màu sắc của lá mầm trở nên vàng hơn, các vết sùi khô lại, có màu nâu, ngừng phát triển (Hình 3.4B). Sau 6-8 tuần, lá mầm chuyển sang màu vàng, các khối mô sùi đen lại và chết, không có hiện tượng cảm ứng chồi (Hình 3.4C).
A (Sau 2 tuần) B (Sau 4 tuần) C (Sau 6-8 tuần)
Hình 3.4. Nách lá mầm được nuôi cấy trên môi trường cảm ứng chồi SIM Trong thí nghiệm này, mỗi công thức được tiến hành trên 30 mẫu, thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Sau 8 tuần, toàn bộ các mẫu cấy đều chết và không có hiện tượng cảm ứng chồi. Từ kết quả thí nghiệm trên có thể nhận thấy rằng chưa tìm được công thức tạo đa chồi phù hợp với vật liệu nách lá mầm.
Tái sinh chồi từ chồi ngọn
Hạt đậu Nho nhe sau khi gieo nảy mầm (5-6 ngày tuổi), tiến hành dùng kéo cắt lấy đoạn ngọn (3-4 cm) ra khỏi bình, tiếp đó cắt lấy phần chồi ngọn (0,5-1 cm), cắt bỏ lá giữ lại phần cuống lá và chồi ngọn. Sau đó các mẫu cấy được cấy vào môi trường cảm ứng chồi SIM ở bảng 2.1, theo dõi và đánh giá tỷ lệ đa chồi sau 8 tuần nuôi cấy.
Sau khi cấy mẫu trên môi trường cảm ứng chồi SIM, mẫu cấy trở nên xanh hơn và phát triển nhanh về chiều cao. Sau 2 tuần nuôi cấy, mặt cắt của chồi ngọn được tiếp xúc trực tiếp với môi trường cảm ứng tạo chồi bắt đầu có hiện tượng sùi trắng, khối mô sùi có đường kính khoảng 1cm, các mẫu cấy tăng nhanh về chiều cao và số lượng lá, chồi nách và chồi ngọn xuất hiện. Sau 4 tuần, số lượng chồi và chiều cao chồi ở các mẫu cấy tăng đáng kể. Từ tuần 6 đến tuần 8, số lượng chồi ở mẫu cấy không tăng nhiều, chủ yếu phát triển về chiều cao chồi và số lượng lá.
Sau 8 tuần theo dõi cho thấy hầu hết chồi ngọn đều có khả năng tạo cảm ứng chồi. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn chồi ngọn là vật liệu thích hợp để nghiên cứu tái sinh chồi, với tỷ lệ đa chồi tương đối cao.
Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng 2 chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin là BAP và kinetin để tái sinh chồi từ chồi ngọn của cây đậu Nho nhe. Tuy nhiên, sau 8 tuần theo dõi thì việc sử dụng kinetine để tạo đa
chồi không hiệu quả bằng BAP ở các nồng độ tương ứng và việc bổ sung thêm
10% nước dừa vào môi trường nuôi cấy cũng làm tăng đáng kể tỷ lệ tạo đa chồi cũng như chất lượng chồi (Hình 3.6.). Cụ thể: ở các nồng độ 0,5mg/l; 1mg/l; 1,5mg/l; 2mg/l tỷ lệ đa chồi ở BAP lần lượt là 54,44%; 63,8%; 84,44%; 42,23% còn với kinetine tỷ lệ đa chồi lần lượt là 26,70%; 40%; 50%; 16,67%. Có thể thấy tỷ lệ đa chồi của kinetine thấp hơn rất nhiều so với BAP. Từ kết quả trên chúng tôi chọn chất kích thích sinh trường là BAP để tái sinh đa chồi từ chồi.
Hình 3.6. Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ tạo đa chồi của chồi ngọn dưới tác động của BAP và kinetin sau 8 tuần
BAP, nồng độ 0,5mg/l, 54.44 BAP, nồng độ 1 mg/l, 63.8 BAP, nồng độ 1,5 mg/l, 84.44 BAP, nồng độ 2 mg/l, 42.23 BAP + 10% ND, nồng độ 0,5mg/l, 64.47 BAP + 10% ND, nồng độ 1 mg/l, 73.34 BAP + 10% ND, nồng độ 1,5 mg/l, 87.8 BAP + 10% ND, nồng độ 2 mg/l, 51.13 Kinetin, nồng độ 0,5mg/l, 26.70 Kinetin, nồng độ 1 mg/l, 40 Kinetin, nồng độ 1,5 mg/l, 50 Kinetin, nồng độ 2 mg/l, 16.67 Tỷ lệ tạ o đ a ch ồi (%) BAP BAP + 10% ND Kinetin
A B
Hình 3.7. Tái sinh chồi từ chồi ngọn trên môi trường SIM sau 4 tuần. A: Kinetine 1,5mg/l; B: BAP 1,5mg/l
Từ kết quả trên cho thấy, ở đậu Nho nhe việc sử dụng kinetin để tạo đa chồi không hiệu quả bằng BAP ở các nồng độ tương ứng. Ở các nồng độ nghiên cứu, tỷ lệ tạo đa chồi của kinetin đều thấp hơn BAP. Từ kết quả trên chúng tôi chọn chất kích thích sinh trường là BAP để tái sinh đa chồi từ chồi ngọn của cây đậu Nho nhe.
3.2.3. Ảnh hưởng của BAP đến tái sinh chồi từ chồi ngọn in vitro
BAP thuộc nhóm kích thích sinh trưởng cytokinin. Về vai trò sinh lý, các chất thuộc nhóm cytokinin đều có tác dụng kích thích phân chia tế bào rất mạnh thông qua việc hoạt hóa tổng hợp axit nucleic và protein, đây là tính đặc trưng nhất [7]. Chính vì vậy, BAP thường được sử dụng để cảm ứng tạo chồi, kéo dài thời gian hoạt động của mô phân sinh, hạn chế sự già hóa của tế bào đồng thời thúc đẩy sự phân hóa chồi, kích thích chồi phát triển ở nhiều loài thực vật khác nhau. Theo nhiều nghiên cứu cho thấy, nồng độ BAP thay đổ từ 1,0 – 3,0 mg/l thích hợp cho nhiều loại mô nuôi cấy. Ở các nồng độ cao hơn hoặc thấp hơn đều biểu hiện hiệu quả kích thích kém. Với nồng độ cao sẽ hoạt hóa hình thành chồi bất định.
Khả năng cảm ứng tạo chồi và số lượng chồi trung bình/ một mẫu là những
thông số dùng để đánh giá tính thích ứng của giống trong hệ thống nuôi cấy in
vitro.Theo dõi thí nghiệm và đánh giá kết quả sau các khoảng thời gian nuôi cấy. Kết quả theo dõi các chỉ tiêu thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.2. và hình 3.8.
Sau khi cấy trên môi trường cảm ứng chồi, mẫu cấy tăng nhanh về chiều cao, vết cắt tiếp xúc trực tiếp với mặt thạch sùi to dần. Sau 2 tuần nuôi cấy các chồi chính và mầm chồi được hình thành trực tiếp từ khu vực vết sùi tại vết cắt. Sau 4 tuần nuôi cấy tiếp theo trên môi trường cảm ứng chồi, chồi chính phát triển mạnh mẽ, thân và lá của chồi mập, xanh và khỏe, kích thước chồi chính đạt 3-4 cm. Lúc này chồi chính đã có thể được tách khỏi cụm chồi chuyển qua môi trường ra rễ, các mầm chồi đã nảy chồi và hình thành lá. Tiếp tục nuôi các cụm chồi này trên môi trường cảm ứng chồi các chồi tăng nhanh về chiều dài, đồng thời số lượng lá cũng tăng đáng kể và xòe rộng (Hình 3.8C).
A B C D Hình 3.8. Hình ảnh chồi đậu Nho nhe trên môi trường chứa BAP 1,5mg/l
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh chồi của đậu Nho nhe Công thức Nồng độ BAP (mg/l)
Số chồi/mẫu Chiều cao chồi (cm)
Chất lượng chồi Sau 2 tuần ĐC 0 1,00a ± 0,00 1,58 ± 0,16 CT1 0,5 1,67b ± 0,18 1,09 ± 0,12 - CT2 1 1,60b ± 0,17 1,32 ± 0,07 - CT3 1,5 1,70b ± 0,14 1,31 ± 0,08 + CT4 2 1,10a ± 0,09 0,79 ± 0,06 - Sau 4 tuần ĐC 0 1,00a ± 0,00 1,88 ± 0,18 CT1 0,5 2,70b ± 0,28 2,46 ± 0,32 - CT2 1 2,50b ± 0,32 1,50 ± 0,06 - CT3 1,5 3,77c ± 0,41 1,60 ± 0,07 + CT4 2 1,40a ± 0,14 1,06 ± 0,08 - Sau 6 tuần ĐC 0 1,00a ± 0,00 2,36 ± 0,17 CT1 0,5 2,80b ± 0,26 2,78 ± 0,32 - CT2 1 3,03b ± 0,42 1,68 ± 0,10 - CT3 1,5 3,97c ± 0,39 2,29 ± 0,11 + CT4 2 1,50a ± 0,16 1,44 ± 0,10 - Sau 8 tuần ĐC 0 1,00a ± 0,00 2,51 ± 0,17 CT1 0,5 2,87b ± 0,26 2,80 ± 0,31 - CT2 1 3,07b ± 0,42 2,04 ± 0,14 - CT3 1,5 4,07c ± 0,39 3,03 ± 0,14 + CT4 2 1,63a ± 0,16 1,81 ± 0,12 -
Ghi chú: Các chữ cái khác nhau trong từng cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở mức α=0,05 bởi phương pháp Test Ducan. Chất lượng chồi: (-): chồi yếu, có màu vàng hoặc trắng; (+): chồi khỏe, mập, có màu xanh.
đều có khả năng tái sinh chồi trên môi trường nghiên cứu. Khả năng tạo đa chồi có sự khác biệt trên các môi trường khi thay đổi nồng độ BAP. Trên môi trường đối chứng không có chất điều hòa sinh trưởng, các mẫu cấy không có dấu hiệu cảm ứng tạo chồi. Điều đó cho thấy, các đoạn chồi ngọn của đậu Nho nhe không có đủ các chất điều hòa sinh trưởng nội sinh cần thiết mà phải cần được cung cấp từ bên ngoài môi trường để cảm ứng tạo chồi. Trên môi trường nuôi cấy có bổ sung BAP với nồng độ tăng dần từ 0,5mg/l đến 2,0mg/l, quan sát thấy số chồi/mẫu tăng, cao nhất là môi trường nuôi cấy có bổ sung BAP 1,5mg/l, hiệu quả tạo đa chồi sau 4 tuần nuôi cấy đạt 3,77 chồi/mẫu, sau 6 tuần mẫu nuôi cấy là 3,97 chồi/mẫu. Sau 8 tuần nuôi cấy là 4,07 chồi/ mẫu. Các công thức thí nghiệm còn lại cho số chồi/mẫu đạt từ 1,40 đến 2,70 chồi/ mẫu (sau 4 tuần nuôi cấy), 1,50 đến 3,03 chồi/ mẫu (sau 6 tuần nuôi cấy), 1,63 đến 3,07 chồi/ mẫu (sau 8 tuần nuôi cấy).
Kết quả theo dõi chỉ tiêu về chiều cao chồi cho thấy, khi tăng nồng độ BAP (0,5mg/l đến 2,0mg/l) thì chiều cao chồi tăng dần, tăng cao nhất là môi trường MS có bổ sung BAP 1,5mg/l. Sau 4 tuần, chiều cao chồi tăng từ 1,31 – 1,60 cm; sau 6 tuần tăng từ 1,60 – 2,29 cm, sau 8 tuần tăng từ 2,29 – 3,03cm. Các công thức thí nghiệm đều thu được kết quả tạo đa chồi so với đối chứng.
Xét đồng thời các chỉ tiêu nghiên cứu trong giai đoạn tạo đa chồi cây đậu Nho nhe thì môi trường thích hợp nhất trong các nồng độ thăm dò, cho hiệu quả tạo chồi cao nhất là MS + sucrose 30g/l + agar 9,0g/l có bổ sung BAP 1,5mg/l, cho hệ số tạo chồi cao đạt 4,07chồi/mẫu, sự sinh trưởng phát triển của chồi khỏe, chất lượng chồi tốt.
Hình 3.9. Cụm chồi nuôi cấy trên môi trường tái sinh chồi với BAP 1,5mg/l sau 4 tuần
3.2.4. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của chồi in vitro
Giai đoạn ra rễ là công đoạn cuối cùng trong quy trình tái sinh. Hoàn thiện
giai đoạn này chúng ta sẽ thu được những cây tái sinh in vitro hoàn chỉnh.Giai
đoạn này, người ta thường sử dụng chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin để kích thích sự ra rễ của chồi. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng IBA để xác định ảnh hưởng của nó đến sự hình thành rễ của chồi cây đậu Nho nhe. IBA là chất thuộc nhóm kích thích sinh trưởng auxin có khả năng kích thích sự ra rễ, đặc biệt là rễ bất định ở cành giâm, cành chiết, mô nuôi cấy.
Sau 8 tuần nuôi cấy trong môi trường cảm ứng tạo đa chồi, chúng tôi tiến hành lựa chọn các chồi mập có chiều cao từ 4-5cm, lá nhiều, có màu xanh đậm được chuyển sang môi trường ra rễ được bổ sung nồng độ IBA khác nhau 0,1mg/l; 0,2mg/l; 0,3mg/l; 0,4mg/l; 0,5mg/l. Sau 1 tuần đầu tiên, rễ đầu tiên bắt đầu xuất hiện trên môi trường IBA 0,3mg/l. Sau 2 tuần, rễ xuất hiện ở tất cả môi trường IBA nghiên cứu nhưng chất lượng rễ ở các môi trường không giống nhau (Hình 3.10A). Sau 4 tuần, chiều dài của rễ tăng đáng kể, có thêm nhiều rễ phụ (Hình 3.10B). Từ 6-8 tuần, số lượng rễ hầu như không tăng thêm mà chủ yếu phát triển về chiều dài và số lượng các rễ phụ (Hình 3.10C).
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ của chồi tái sinh Công thức Nồng ðộ IBA (mg/l) Số rễ Chiều dài rễ (cm) Chất lýợng rễ Sau 2 tuần Mso 0 2,50a ± 0,26 1,97a ± 0,16 Xấu CT1 0,1 2,60a ± 0,28 1,18c ± 0,07 Xấu CT2 0,2 2,67a ± 0,14 1,54b ± 0,09 Tốt CT3 0,3 4,07b ± 0,35 1,69b ± 0,09 Tốt CT4 0,4 2,80a ± 0,27 1,16c ± 0,07 Xấu CT5 0,5 1,03c ± 0,11 0,79d ± 0,07 Xấu Sau 4 tuần Mso 0 2,57a ± 0,26 2,76a ± 0,17 Xấu CT1 0,1 2,60a ± 0,28 2,59a ± 0,15 Xấu CT2 0,2 3,17b ± 0,13 2,59a ± 0,09 Tốt CT3 0,3 4,23c ± 0,32 2,70a ± 0,08 Tốt CT4 0,4 2,93b ± 0,26 2,55a ± 0,14 Xấu CT5 0,5 2,00a ± 0,22 1,70b ± 0,14 Xấu Sau 6 tuần Mso 0 2,57a ± 0,26 2,98a ± 0,18 Xấu CT1 0,2 2,60b ± 0,28 2,83a ± 0,17 Xấu CT2 0,1 3,50a ± 0,16 3,26a ± 0,10 Tốt CT3 0,3 4,50c ± 0,28 3,67b ± 0,08 Tốt CT4 0,4 3,30b ± 0,31 2,89a ± 0,16 Xấu CT5 0,5 2,17b ± 0,26 2,76c ± 0,21 Xấu Sau 8 tuần Mso 0 2,57a ± 0,26 3,09a ± 0,18 Xấu CT1 0,2 2,73a ± 0,28 3,21a ± 0,22 Xấu CT2 0,1 3,63c ± 0,18 3,38a ± 0,10 Tốt CT3 0,3 4,70d ± 0,27 4,46b ± 0,08 Tốt CT4 0,4 3,33b ± 0,25 3,27a ± 0,20 Xấu CT5 0,5 2,27a ± 0,28 2,88a ± 0,22 Xấu