3. Nội dung nghiên cứu
2.2.6. Phương pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu
Sử dụng bộ phần mềm SPSS để phân tích các trị số thống kê như trung bình mẫu, sai số và so sánh sự khác nhau giữa các trị số trung bình ở mức ý nghĩa α = 0,05.
Chương 3.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ KHỬ TRÙNG HẠT ĐẬU NHO NHE
Vô trùng mẫu cấy là bước đầu tiên đóng vai trò quyết định sự thành công
của việc xây dựng hệ thống tái sinh in vitro. Vì vậy, cần lựa chọn phương pháp
khử trùng và loại hóa chất thích hợp để loại bỏ hoàn toàn các nguồn vi khuẩn, nấm mốc, virus khỏi mẫu trước khi đưa vào môi trường nuôi cấy. Có rất nhiều loại hóa chất được sử dụng để khử trùng. Tuy nhiên, nồng độ khử trùng thích hợp cho các đối tượng khác nhau là hoàn toàn khác nhau.
Hạt đậu Nho nhe là loại hạt nhỏ, giàu chất dinh dưỡng điều kiện lý tưởng cho các loại vi sinh vật, nấm mốc phát triển. Vì vậy, việc nghiên cứu đưa ra công thức khử trùng tối ưu là rất cần thiết để chuẩn bị mẫu cho quá trình nuôi cấy in vitro tiếp theo. Phương pháp khử trùng thích hợp phải đảm bảo được các yêu cầu, tỷ lệ hạt bị nhiễm thấp, thân mầm to, mập và chồi sinh trưởng phát triển tốt.
Chúng tôi đã tiến hành vô trùng sơ bộ hạt đậu Nho nhe bằng cách lắc nhẹ
hạt trong cồn 700 1 phút và javen ở các nồng độ 50%, 60%, 70% với ngưỡng
thời gian khác nhau 15, 20, 25 phút. Sau khi khử trùng, hạt được cấy vào môi trường MS có bổ sung sucrose 30 g/l và agar 9 g/l. Ðánh giá khả năng thu được mẫu sạch và khả năng nảy mầm của hạt là bước tiếp theo để tìm ra công thức khử trùng tốt nhất.
Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, đối với công thức khử trùng 1, sử dụng dung dịch Javen pha loãng 50% cho thấy tỷ lệ mẫu nhiễm rất cao, tỷ lệ nảy mầm thấp. Cụ thể với thời gian khử trùng là 15, 20, 25 phút tỷ lệ mẫu nhiễm lần lượt là 30%, 23%, 17%, tỷ lệ nảy mầm lần lượt 70%, 77%, 82%. Nếu tăng thời gian khử trùng tỷ lệ mẫu nhiễm có thể sẽ giảm nhưng tỷ lệ mẫu nhiễm độc sẽ tăng ảnh hưởng tới khả năng nảy mầm của hạt cũng như chất lượng chồi.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ Javen và thời gian khử trùng đến sự nảy mầm của hạt đậu Nho nhe sau 7 ngày nuôi cấy
CT Javen (%) Thời gian khử trùng (phút) Số mẫu (hạt) Kết quả Mẫu nhiễm (%) Mẫu chết (%) Mẫu sạch (%) Nảy mầm (%) Javen 50% CT1 50 15 100 30 0 70 70 CT2 50 20 100 23 0 77 77 CT3 50 25 100 17 1 83 82 Javen 60% CT1 60 15 100 8 1 92 91 CT2 60 20 100 1 1 99 98 CT3 60 25 100 1 9 99 90 Javen 70% CT1 70 15 100 1 15 99 84 CT2 70 20 100 0 24 100 76 CT3 70 25 100 0 35 100 65
Ở công thức khử trùng 3, sử dụng dung dịch Javen pha loãng 70% cho thấy khi tăng thời gian khử trùng lên tỷ lệ mẫu nhiễm rất thấp nhưng tỷ lệ mẫu chết tăng cao. Cụ thể với thời gian khử trùng là 15, 20, 25 phút số tỷ lệ mẫu
chết lần lượt là 15%, 24%, 35% mặc dù tỷ lệ mẫu sạch ở thời gian 20, 25 phút là 100%. Như vậy, đây chưa phải nồng độ thích hợp để khử trùng hạt.
Ở công thức khử trùng 2, với dung dịch javen pha loãng 60% tỷ lệ mẫu nhiễm giảm đáng kể đồng thời tỷ lệ mẫu sạch và tỷ lệ hạt nảy mầm tăng cao. Ở thời gian khử trùng là 15 phút thì tỷ mẫu nhiễm là 8%, thời gian 20, 25 phút thì tỷ lệ mẫu sạch nảy mầm rất cao lần lượt là 98%, 90% tuy nhiên mẫu chết lại xuất hiện ở thời gian khử trùng 25 phút với tỷ lệ 9%. Như vậy, từ số liệu trên cho thấy công thức khử trùng thích hợp nhất là javen 60% với thời gian khử trùng là 20 phút.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, javen nồng độ 60% với thời gian 20 phút là điều kiện thích hợp nhất cho khử trùng hạt đậu Nho nhe, tỷ lệ mẫu sạch 100%, khả năng hạt bị chết thấp đảm bảo tỷ lệ nảy mầm cao 98% và chất lượng chồi tốt. Trong thực tế hạt đậu là đối tượng khó khử trùng, nếu khử trùng bằng Javen ở nồng độ quá cao và thời gian quá dài thì tỷ lệ hạt bị tổn thương, bị chết cao, hạt nảy mầm kém và không đồng đều. Ngược lại, nếu nồng độ Javen thấp thì không đủ liều lượng để làm sạch cũng như diệt các vi sinh vật, nấm mốc nên tỷ lệ nhiễm sau khi cấy cao.
3.2. TÁI SINH IN VITRO CÂY ĐẬU NHO NHE
3.2.1. Tái sinh chồi đậu Nho nhe từ mô sẹo
Sử dụng mảnh lá cho thí nghiệm cảm ứng tạo mô sẹo. Lá đậu Nho nhe 6 ngày tuổi được cắt thành các mảnh nhỏ có kích thước khoảng 0,5 x 1cm, cấy trên môi trường cảm ứng tạo mô sẹo gồm: MS, sucrose 30g/l, agar 9g/l; pH= 5,8, 2,4-D (0-4mg/l), mẫu được chia thành 2 lô thí nghiệm. Ở lô thứ nhất, mẫu nuôi cấy dưới ánh sáng đèn neon với cường độ chiếu sáng 2000 lux, nhiệt độ
25 ± 2oC. Ở lô thứ hai, mẫu được nuôi cấy 7 ngày trong tối, sau đó được đưa ra
nuôi cấy 2 tuần dưới điều kiện phòng nuôi cấy (ánh sáng 2000 lux, nhiệt độ 25
± 2oC, thời gian chiếu sáng 12 giờ/ ngày).
Sau 3 tuần nuôi cấy, ở lô thứ 2 với 2,4-D nồng độ từ 0,5-3,5mg/l tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo là rất cao 95-100%, hầu hết tất cả các mẫu lá đều tạo mô sẹo tuy nhiên tính chất mô sẹo có sự khác nhau ở các nồng độ. Cụ thể ở nồng độ 0,5mg/l; 1,5mg/l các mô sẹo đều màu trắng, đặc và có nhiều rễ không thích hợp cho quá trình tái sinh. Ở các nồng độ 2,0-3,5mg/l tỷ lệ tạo mô sẹo giảm dần song tính chất mô sẹo đều không thích hợp cho quá trình tái sinh. Ở công thức đối chứng và 2,4-D nồng độ 4mg/l không tạo mô sẹo.
Xét đồng thời các chỉ tiêu cho thấy 2,4-D nồng độ 1,0mg/l là công thức thích hợp nhất cho quá trình tạo mô sẹo từ mảnh lá ở cây đậu Nho nhe.
Trong đó, ở lô thứ nhất các mẫu nuôi cấy đặt trong điều kiện phòng nuôi
cấy ánh sáng đèn neon với cường độ chiếu sáng 2000 lux, nhiệt độ 25 ± 2oC
Hình 3.2. Hình ảnh mô sẹo tạo từ mảnh lá sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường bổ sung 2,4-D 1mg/l
Các mô sẹo có chất lượng tốt nhất được thu từ mảnh lá được cấy chuyển sang môi trường cảm ứng tạo chồi SIM ở bảng 2.1. Sau 4 tuần theo dõi, ở các nồng độ BAP, kinetine khác nhau (0,5-2mg/l), các mẫu cấy đều không có khả năng tái sinh, các mẫu cấy trở nên đen và mủn (Hình 3.3.).
Hình 3.3. Mô sẹo nuôi cấy trên môi trường SIM sau 4 tuần
3.2.2. Tái sinh chồi đậu Nho nhe từ nách lá mầm và chồi ngọn
Tái sinh chồi từ lá mầm
Đối với nhóm đậu đỗ nói riêng và nhóm cây hai lá mầm nói chung thì việc sử dụng nách lá mầm làm vật liệu tái sinh đa chồi được xem như một phương pháp nhanh chóng và tương đối hiệu quả đem lại tỷ lệ đa chồi cao. Nách lá mầm đã được nghiên cứu trên nhiều đối tượng đặc biệt là các loại thuộc họ
Đậu: đậu Xanh [20], [30], đậu tương [25], Vigna mugo [35], lạc [39]…. Xuất phát từ những nghiên cứu trước, chúng tôi đã sử dụng lá mầm của cây đậu Nho nhe (3-4 ngày tuổi) để tạo đa chồi, mẫu cấy được cấy trên môi trường cảm ứng tạo đa chồi bảng 2.1, với các nồng độ khác nhau từ 0,5-2mg/l để thăm dò nồng độ thích hợp.
Sau khi cấy trên môi trường cảm ứng chồi SIM, mẫu cấy trở lên xanh hơn, diện tích bề mặt lá mầm, nách lá mầm tăng nhanh. Sau 2 tuần, ở khu vực gây tổn thương bằng kim nhọn sùi lên có màu trắng đục (Hình 3.4A). Sau 4 tuần, màu sắc của lá mầm trở nên vàng hơn, các vết sùi khô lại, có màu nâu, ngừng phát triển (Hình 3.4B). Sau 6-8 tuần, lá mầm chuyển sang màu vàng, các khối mô sùi đen lại và chết, không có hiện tượng cảm ứng chồi (Hình 3.4C).
A (Sau 2 tuần) B (Sau 4 tuần) C (Sau 6-8 tuần)
Hình 3.4. Nách lá mầm được nuôi cấy trên môi trường cảm ứng chồi SIM Trong thí nghiệm này, mỗi công thức được tiến hành trên 30 mẫu, thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Sau 8 tuần, toàn bộ các mẫu cấy đều chết và không có hiện tượng cảm ứng chồi. Từ kết quả thí nghiệm trên có thể nhận thấy rằng chưa tìm được công thức tạo đa chồi phù hợp với vật liệu nách lá mầm.
Tái sinh chồi từ chồi ngọn
Hạt đậu Nho nhe sau khi gieo nảy mầm (5-6 ngày tuổi), tiến hành dùng kéo cắt lấy đoạn ngọn (3-4 cm) ra khỏi bình, tiếp đó cắt lấy phần chồi ngọn (0,5-1 cm), cắt bỏ lá giữ lại phần cuống lá và chồi ngọn. Sau đó các mẫu cấy được cấy vào môi trường cảm ứng chồi SIM ở bảng 2.1, theo dõi và đánh giá tỷ lệ đa chồi sau 8 tuần nuôi cấy.
Sau khi cấy mẫu trên môi trường cảm ứng chồi SIM, mẫu cấy trở nên xanh hơn và phát triển nhanh về chiều cao. Sau 2 tuần nuôi cấy, mặt cắt của chồi ngọn được tiếp xúc trực tiếp với môi trường cảm ứng tạo chồi bắt đầu có hiện tượng sùi trắng, khối mô sùi có đường kính khoảng 1cm, các mẫu cấy tăng nhanh về chiều cao và số lượng lá, chồi nách và chồi ngọn xuất hiện. Sau 4 tuần, số lượng chồi và chiều cao chồi ở các mẫu cấy tăng đáng kể. Từ tuần 6 đến tuần 8, số lượng chồi ở mẫu cấy không tăng nhiều, chủ yếu phát triển về chiều cao chồi và số lượng lá.
Sau 8 tuần theo dõi cho thấy hầu hết chồi ngọn đều có khả năng tạo cảm ứng chồi. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn chồi ngọn là vật liệu thích hợp để nghiên cứu tái sinh chồi, với tỷ lệ đa chồi tương đối cao.
Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng 2 chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin là BAP và kinetin để tái sinh chồi từ chồi ngọn của cây đậu Nho nhe. Tuy nhiên, sau 8 tuần theo dõi thì việc sử dụng kinetine để tạo đa
chồi không hiệu quả bằng BAP ở các nồng độ tương ứng và việc bổ sung thêm
10% nước dừa vào môi trường nuôi cấy cũng làm tăng đáng kể tỷ lệ tạo đa chồi cũng như chất lượng chồi (Hình 3.6.). Cụ thể: ở các nồng độ 0,5mg/l; 1mg/l; 1,5mg/l; 2mg/l tỷ lệ đa chồi ở BAP lần lượt là 54,44%; 63,8%; 84,44%; 42,23% còn với kinetine tỷ lệ đa chồi lần lượt là 26,70%; 40%; 50%; 16,67%. Có thể thấy tỷ lệ đa chồi của kinetine thấp hơn rất nhiều so với BAP. Từ kết quả trên chúng tôi chọn chất kích thích sinh trường là BAP để tái sinh đa chồi từ chồi.
Hình 3.6. Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ tạo đa chồi của chồi ngọn dưới tác động của BAP và kinetin sau 8 tuần
BAP, nồng độ 0,5mg/l, 54.44 BAP, nồng độ 1 mg/l, 63.8 BAP, nồng độ 1,5 mg/l, 84.44 BAP, nồng độ 2 mg/l, 42.23 BAP + 10% ND, nồng độ 0,5mg/l, 64.47 BAP + 10% ND, nồng độ 1 mg/l, 73.34 BAP + 10% ND, nồng độ 1,5 mg/l, 87.8 BAP + 10% ND, nồng độ 2 mg/l, 51.13 Kinetin, nồng độ 0,5mg/l, 26.70 Kinetin, nồng độ 1 mg/l, 40 Kinetin, nồng độ 1,5 mg/l, 50 Kinetin, nồng độ 2 mg/l, 16.67 Tỷ lệ tạ o đ a ch ồi (%) BAP BAP + 10% ND Kinetin
A B
Hình 3.7. Tái sinh chồi từ chồi ngọn trên môi trường SIM sau 4 tuần. A: Kinetine 1,5mg/l; B: BAP 1,5mg/l
Từ kết quả trên cho thấy, ở đậu Nho nhe việc sử dụng kinetin để tạo đa chồi không hiệu quả bằng BAP ở các nồng độ tương ứng. Ở các nồng độ nghiên cứu, tỷ lệ tạo đa chồi của kinetin đều thấp hơn BAP. Từ kết quả trên chúng tôi chọn chất kích thích sinh trường là BAP để tái sinh đa chồi từ chồi ngọn của cây đậu Nho nhe.
3.2.3. Ảnh hưởng của BAP đến tái sinh chồi từ chồi ngọn in vitro
BAP thuộc nhóm kích thích sinh trưởng cytokinin. Về vai trò sinh lý, các chất thuộc nhóm cytokinin đều có tác dụng kích thích phân chia tế bào rất mạnh thông qua việc hoạt hóa tổng hợp axit nucleic và protein, đây là tính đặc trưng nhất [7]. Chính vì vậy, BAP thường được sử dụng để cảm ứng tạo chồi, kéo dài thời gian hoạt động của mô phân sinh, hạn chế sự già hóa của tế bào đồng thời thúc đẩy sự phân hóa chồi, kích thích chồi phát triển ở nhiều loài thực vật khác nhau. Theo nhiều nghiên cứu cho thấy, nồng độ BAP thay đổ từ 1,0 – 3,0 mg/l thích hợp cho nhiều loại mô nuôi cấy. Ở các nồng độ cao hơn hoặc thấp hơn đều biểu hiện hiệu quả kích thích kém. Với nồng độ cao sẽ hoạt hóa hình thành chồi bất định.
Khả năng cảm ứng tạo chồi và số lượng chồi trung bình/ một mẫu là những
thông số dùng để đánh giá tính thích ứng của giống trong hệ thống nuôi cấy in
vitro.Theo dõi thí nghiệm và đánh giá kết quả sau các khoảng thời gian nuôi cấy. Kết quả theo dõi các chỉ tiêu thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.2. và hình 3.8.
Sau khi cấy trên môi trường cảm ứng chồi, mẫu cấy tăng nhanh về chiều cao, vết cắt tiếp xúc trực tiếp với mặt thạch sùi to dần. Sau 2 tuần nuôi cấy các chồi chính và mầm chồi được hình thành trực tiếp từ khu vực vết sùi tại vết cắt. Sau 4 tuần nuôi cấy tiếp theo trên môi trường cảm ứng chồi, chồi chính phát triển mạnh mẽ, thân và lá của chồi mập, xanh và khỏe, kích thước chồi chính đạt 3-4 cm. Lúc này chồi chính đã có thể được tách khỏi cụm chồi chuyển qua môi trường ra rễ, các mầm chồi đã nảy chồi và hình thành lá. Tiếp tục nuôi các cụm chồi này trên môi trường cảm ứng chồi các chồi tăng nhanh về chiều dài, đồng thời số lượng lá cũng tăng đáng kể và xòe rộng (Hình 3.8C).
A B C D Hình 3.8. Hình ảnh chồi đậu Nho nhe trên môi trường chứa BAP 1,5mg/l
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh chồi của đậu Nho nhe Công thức Nồng độ BAP (mg/l)
Số chồi/mẫu Chiều cao chồi (cm)
Chất lượng chồi Sau 2 tuần ĐC 0 1,00a ± 0,00 1,58 ± 0,16 CT1 0,5 1,67b ± 0,18 1,09 ± 0,12 - CT2 1 1,60b ± 0,17 1,32 ± 0,07 - CT3 1,5 1,70b ± 0,14 1,31 ± 0,08 + CT4 2 1,10a ± 0,09 0,79 ± 0,06 - Sau 4 tuần ĐC 0 1,00a ± 0,00 1,88 ± 0,18 CT1 0,5 2,70b ± 0,28 2,46 ± 0,32 - CT2 1 2,50b ± 0,32 1,50 ± 0,06 - CT3 1,5 3,77c ± 0,41 1,60 ± 0,07 + CT4 2 1,40a ± 0,14 1,06 ± 0,08 - Sau 6 tuần ĐC 0 1,00a ± 0,00 2,36 ± 0,17 CT1 0,5 2,80b ± 0,26 2,78 ± 0,32 - CT2 1 3,03b ± 0,42 1,68 ± 0,10 - CT3 1,5 3,97c ± 0,39 2,29 ± 0,11 + CT4 2 1,50a ± 0,16 1,44 ± 0,10 - Sau 8 tuần ĐC 0 1,00a ± 0,00 2,51 ± 0,17 CT1 0,5 2,87b ± 0,26 2,80 ± 0,31 - CT2 1 3,07b ± 0,42 2,04 ± 0,14 - CT3 1,5 4,07c ± 0,39 3,03 ± 0,14 + CT4 2 1,63a ± 0,16 1,81 ± 0,12 -
Ghi chú: Các chữ cái khác nhau trong từng cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở mức α=0,05 bởi phương pháp Test Ducan. Chất lượng chồi: (-): chồi yếu, có màu vàng hoặc trắng; (+): chồi khỏe, mập, có màu xanh.
đều có khả năng tái sinh chồi trên môi trường nghiên cứu. Khả năng tạo đa chồi