3. Nội dung nghiên cứu
3.2.3. Ảnh hưởng của BAP đến tái sinh chồi từ chồi ngọn in vitro
BAP thuộc nhóm kích thích sinh trưởng cytokinin. Về vai trò sinh lý, các chất thuộc nhóm cytokinin đều có tác dụng kích thích phân chia tế bào rất mạnh thông qua việc hoạt hóa tổng hợp axit nucleic và protein, đây là tính đặc trưng nhất [7]. Chính vì vậy, BAP thường được sử dụng để cảm ứng tạo chồi, kéo dài thời gian hoạt động của mô phân sinh, hạn chế sự già hóa của tế bào đồng thời thúc đẩy sự phân hóa chồi, kích thích chồi phát triển ở nhiều loài thực vật khác nhau. Theo nhiều nghiên cứu cho thấy, nồng độ BAP thay đổ từ 1,0 – 3,0 mg/l thích hợp cho nhiều loại mô nuôi cấy. Ở các nồng độ cao hơn hoặc thấp hơn đều biểu hiện hiệu quả kích thích kém. Với nồng độ cao sẽ hoạt hóa hình thành chồi bất định.
Khả năng cảm ứng tạo chồi và số lượng chồi trung bình/ một mẫu là những
thông số dùng để đánh giá tính thích ứng của giống trong hệ thống nuôi cấy in
vitro.Theo dõi thí nghiệm và đánh giá kết quả sau các khoảng thời gian nuôi cấy. Kết quả theo dõi các chỉ tiêu thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.2. và hình 3.8.
Sau khi cấy trên môi trường cảm ứng chồi, mẫu cấy tăng nhanh về chiều cao, vết cắt tiếp xúc trực tiếp với mặt thạch sùi to dần. Sau 2 tuần nuôi cấy các chồi chính và mầm chồi được hình thành trực tiếp từ khu vực vết sùi tại vết cắt. Sau 4 tuần nuôi cấy tiếp theo trên môi trường cảm ứng chồi, chồi chính phát triển mạnh mẽ, thân và lá của chồi mập, xanh và khỏe, kích thước chồi chính đạt 3-4 cm. Lúc này chồi chính đã có thể được tách khỏi cụm chồi chuyển qua môi trường ra rễ, các mầm chồi đã nảy chồi và hình thành lá. Tiếp tục nuôi các cụm chồi này trên môi trường cảm ứng chồi các chồi tăng nhanh về chiều dài, đồng thời số lượng lá cũng tăng đáng kể và xòe rộng (Hình 3.8C).
A B C D Hình 3.8. Hình ảnh chồi đậu Nho nhe trên môi trường chứa BAP 1,5mg/l
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh chồi của đậu Nho nhe Công thức Nồng độ BAP (mg/l)
Số chồi/mẫu Chiều cao chồi (cm)
Chất lượng chồi Sau 2 tuần ĐC 0 1,00a ± 0,00 1,58 ± 0,16 CT1 0,5 1,67b ± 0,18 1,09 ± 0,12 - CT2 1 1,60b ± 0,17 1,32 ± 0,07 - CT3 1,5 1,70b ± 0,14 1,31 ± 0,08 + CT4 2 1,10a ± 0,09 0,79 ± 0,06 - Sau 4 tuần ĐC 0 1,00a ± 0,00 1,88 ± 0,18 CT1 0,5 2,70b ± 0,28 2,46 ± 0,32 - CT2 1 2,50b ± 0,32 1,50 ± 0,06 - CT3 1,5 3,77c ± 0,41 1,60 ± 0,07 + CT4 2 1,40a ± 0,14 1,06 ± 0,08 - Sau 6 tuần ĐC 0 1,00a ± 0,00 2,36 ± 0,17 CT1 0,5 2,80b ± 0,26 2,78 ± 0,32 - CT2 1 3,03b ± 0,42 1,68 ± 0,10 - CT3 1,5 3,97c ± 0,39 2,29 ± 0,11 + CT4 2 1,50a ± 0,16 1,44 ± 0,10 - Sau 8 tuần ĐC 0 1,00a ± 0,00 2,51 ± 0,17 CT1 0,5 2,87b ± 0,26 2,80 ± 0,31 - CT2 1 3,07b ± 0,42 2,04 ± 0,14 - CT3 1,5 4,07c ± 0,39 3,03 ± 0,14 + CT4 2 1,63a ± 0,16 1,81 ± 0,12 -
Ghi chú: Các chữ cái khác nhau trong từng cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở mức α=0,05 bởi phương pháp Test Ducan. Chất lượng chồi: (-): chồi yếu, có màu vàng hoặc trắng; (+): chồi khỏe, mập, có màu xanh.
đều có khả năng tái sinh chồi trên môi trường nghiên cứu. Khả năng tạo đa chồi có sự khác biệt trên các môi trường khi thay đổi nồng độ BAP. Trên môi trường đối chứng không có chất điều hòa sinh trưởng, các mẫu cấy không có dấu hiệu cảm ứng tạo chồi. Điều đó cho thấy, các đoạn chồi ngọn của đậu Nho nhe không có đủ các chất điều hòa sinh trưởng nội sinh cần thiết mà phải cần được cung cấp từ bên ngoài môi trường để cảm ứng tạo chồi. Trên môi trường nuôi cấy có bổ sung BAP với nồng độ tăng dần từ 0,5mg/l đến 2,0mg/l, quan sát thấy số chồi/mẫu tăng, cao nhất là môi trường nuôi cấy có bổ sung BAP 1,5mg/l, hiệu quả tạo đa chồi sau 4 tuần nuôi cấy đạt 3,77 chồi/mẫu, sau 6 tuần mẫu nuôi cấy là 3,97 chồi/mẫu. Sau 8 tuần nuôi cấy là 4,07 chồi/ mẫu. Các công thức thí nghiệm còn lại cho số chồi/mẫu đạt từ 1,40 đến 2,70 chồi/ mẫu (sau 4 tuần nuôi cấy), 1,50 đến 3,03 chồi/ mẫu (sau 6 tuần nuôi cấy), 1,63 đến 3,07 chồi/ mẫu (sau 8 tuần nuôi cấy).
Kết quả theo dõi chỉ tiêu về chiều cao chồi cho thấy, khi tăng nồng độ BAP (0,5mg/l đến 2,0mg/l) thì chiều cao chồi tăng dần, tăng cao nhất là môi trường MS có bổ sung BAP 1,5mg/l. Sau 4 tuần, chiều cao chồi tăng từ 1,31 – 1,60 cm; sau 6 tuần tăng từ 1,60 – 2,29 cm, sau 8 tuần tăng từ 2,29 – 3,03cm. Các công thức thí nghiệm đều thu được kết quả tạo đa chồi so với đối chứng.
Xét đồng thời các chỉ tiêu nghiên cứu trong giai đoạn tạo đa chồi cây đậu Nho nhe thì môi trường thích hợp nhất trong các nồng độ thăm dò, cho hiệu quả tạo chồi cao nhất là MS + sucrose 30g/l + agar 9,0g/l có bổ sung BAP 1,5mg/l, cho hệ số tạo chồi cao đạt 4,07chồi/mẫu, sự sinh trưởng phát triển của chồi khỏe, chất lượng chồi tốt.
Hình 3.9. Cụm chồi nuôi cấy trên môi trường tái sinh chồi với BAP 1,5mg/l sau 4 tuần