CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Các phương pháp sử dụng trong phòng thí nghiệm
* Phương pháp thu và bảo quản mẫu lá
Mẫu lá sử dụng cho nghiên cứu là lá bánh tẻ, không già và không quá non. Lá sau khi thu đƣợc bỏ vào túi giấy và bảo quản trong thùng mát suốt quá trình vận chuyển để tránh trƣờng hợp lá bị hấp hơi và bị ủng, héo. Sau đó
đƣợc rửa sạch, lau khô, gói trong túi giấy và bảo quản ở nhiệt độ lạnh -20o
C đến -84oC, hoặc bảo quản khô bằng silicagel ở nhiệt độ môi trƣờng trong túi nilon để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
A- Mẫu lá tươi trước khi bảo quản (bên trái) và mẫu lá bảo quản khô (bên phải)
B- Mẫu lá bảo quản khô bằng silicagel ở nhiệt độ môi trường trong túi nilon.
C- Mẫu lá tươi bảo quản ở -20oC; mẫu lá non (bên trái), mẫu lá bánh tẻ (bên phải)
Hình 2.3. Mẫu lá bảo quản
* Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ mẫu lá
ADN tổng số của bạch đàn đƣợc tách chiết bằng phƣơng pháp CTAB có cải tiến bao gồm các bƣớc sau:
- Cân 200mg mẫu lá và nghiền cẩn thận trong nitơ lỏng thành dạng bột mịn, chuyển ngay vào ống eppendorf 2ml.
- Thêm 0,9 ml đệm tách (CTAB 4%), trộn đều, ủ ở 650C trong 60 phút,
15 phút lắc ống 1 lần.
- Thêm 0,8ml C:I (24:1), đảo đều trong 10 phút. - Ly tâm 12.000rpm trong 15 phút
- Hút dịch nổi sang ống mới, thêm 0,6ml C:I (24:1), đảo đều trong 10 phút, ly tâm 12.000rpm trong 15 phút
- Hút dịch nổi sang ống mới, thêm 0,8ml isopropanol lạnh, ủ ở -200C trong 2h
- Ly tâm 12.000rpm trong 15 phút. Thu tủa
- Thêm 0,6ml ethanol 70% lạnh, ly tâm 8000rpm trong 6 phút. - Làm khô tủa, hòa tan trong đệm TE
- Đo độ sạch của ADN bằng phƣơng pháp quang phổ kế
- Bảo quản ADN tổng số trong -200C để phục vụ các nghiên cứu tiếp theo.
* Phương pháp đo nồng độ bằng quang phổ kế
Sau khi tách chiết sẽ đƣợc đo nồng độ trên máy đo quang phổ UV-1601 (UV-Visible Spectrophotometer, Shimadzu).
Nguyên lý:
-Dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng ở bƣớc sóng 260nm của các base purine và pyrimidine, ngƣời ta sẽ đo đƣợc giá trị mật độ quang ở bƣớc sóng
260nm (OD260nm – Optical Density 260nm) của các mẫu và cho phép xác định
nồng độ trong mẫu dựa vào tƣơng quan sau: một đơn vị OD260nm tƣơng ứng
với một nồng độ là 50ng/µl cho một dung dịch sợi đôi. Do đó nồng độ trong mẫu đƣợc tính theo công thức sau:
C(ng/µl) = OD260nm 50 Độ pha loãng
-Để kiểm tra độ sạch của dung dịch, ngƣời ta đo thêm giá trị OD ở bƣớc
sóng 280nm (OD280nm). Ở bƣớc sóng 280nm, các protein có mức hấp thụ cao
nhất, nhƣng các protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bƣớc sóng 260nm nhƣ các axit nucleic và do đó làm sai lệch giá trị thật của nồng độ axit nucleic. Một dung dịch axit nucleic đƣợc xem là sạch (không tạp nhiễm protein) khi tỉ số
OD260nm/ OD280nm nằm trong khoảng 1,8 – 2,0.
Các bƣớc tiến hành:
-Lấy 1ml dung môi hòa tan (TE pH 8,0 hoặc nƣớc khử ion vô trùng) cho vào cuvette đo làm đối chứng.
-Cho 5µl dung dịch cần đo nồng độ vào 995µl dung môi hòa tan (pha loãng 200 lần). Sau đó cho vào cuvette và đo OD ở bƣớc sóng 260nm và 280nm.
-Dựa vào nồng độ để pha loãng ra nồng độ 25ng/µl bằng nƣớc cất 3 lần để chuẩn bị chạy PCR với các mồi RAPD theo công thức:
N1 × V1 = N2 × V2
Trong đó: N1: Nồng độ ban đầu N2: Nồng độ cần pha
V1: Thể tích cần lấy để pha V2: Thể tích cần pha
-In kết quả đo đƣợc.
* Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
-Pha
- 0,2ml
-
.
-Đặt các ống vào máy PCR, khởi động, cài đặt chu kì và cho máy chạy.
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR
Thành phần Thể tích (µl)
ADN 3
dNTPs (10 mM) 1
Buffer dream Taq 2,5
Mồi xuôi (10 pmol/µl) 1
Mồi ngƣợc (10 pmol/µl) 1
Taq ADN polymerase (5 u/µl) 0,2
dH2O 11,3
Hình 2.4. Chu trình nhiệt phản ứng PCR
* Phương pháp điện di trên gel agarose 0,8%
Các bƣớc tiến hành:
-Cân 0,8g agarose, đong 100ml TAE 1X cho vào bình Duran.
-Đun trong lò vi sóng cho đến khi gel tan hoàn toàn tạo thành một dung
dịch đồng nhất.
-Để nguội đến khoảng 50 - 600
C, thêm 5 l ethidium bromide (10mg/ml) và lắc đều.
-Chuẩn bị khay và lƣợc. Đổ dung dịch agarose vào khay sao cho không có bọt khí. Chờ khoảng 45 - 60 phút gel đông.
-Đặt khay gel vào bể điện di, rút lƣợc. Đổ 0,5X TBE ngập mặt gel.
-Tra sản phẩm PCR đã đƣợc trộn với Loading Dye Buffer vào giếng
(tỷ lệ 5 ADN:1Dye). Thời gian và điện thế sử dụng để điện di dài hay ngắn phụ thuộc vào kích thƣớc của cặp mồi SSR cần kiểm tra. Các mẫu chạy với ladder 100bp.
-Soi gel trên máy soi cực tím và chụp ảnh bản gel.
* Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide 4,5%
Chuẩn bị kính:
-Lau kỹ bề mặt hai tấm kính 3 lần bằng nƣớc cất, sau đó lau lại 3 lần
bằng ethanol 70%, để khô sau mỗi lần lau. 94oC 94oC 1 phút 50-60oC 10 phút 72oC 1 phút 35chu kỳ 72oC 40C ∞ 1 phút 3 phút
-Lau tấm kính ngắn với giấy lụa tẩm dung dịch chống bám dính Rain-X. Để 5 phút cho khô dung dịch.
Chú ý. Tránh làm dính dung dịch này lên tấm kính dài.
- Lau tấm kính dài với dung dịch dính đƣợc tạo thành bằng cách thêm 2,5 l Bind Silane vào 1ml chứa 95% ethanol và 5% glacial acetic acid.
-Để cho tấm kính khô.
-Lắp ghép 2 tấm kính lại với nhau, sử dụng nẹp Sigma 0,4mm.
Chuẩn bị gel polyacrylamide:
-Đổ 60ml dung dịch gel 4,5% acrylamide vào 1 cốc đong 100ml. Thêm
180 l 10% APS (ammonium persulfate) và 60 l TEMED (N,N,N’,N’- Tetraethyl - ethylendiamine), trộn đều.
-Đổ từ từ dung dịch gel vào giữa hai tấm kính sao cho không có bọt khí.
-Cài lƣợc vào giữa hai tấm kính (răng lƣợc hƣớng ra phía ngoài). Dùng
kẹp cố định lƣợc.
-Để gel polyme hóa trong 1 - 2 giờ.
Điện di:
-Tháo lƣợc và loại bỏ hết các mảnh gel thừa bám trên mặt tấm kính.
-Lắp ráp bộ điện di. Cho 1 lít đệm TBE 0,5X vào buồng đệm trên và dƣới. -Rút lƣợc, dùng xylanh đuổi hết bọt khí ở bề mặt phía trong giữa 2 tấm kính.
-Chạy tiền điện di (prerun) với cƣờng độ dòng điện là 50 - 60A, công
suất 92 - 100W cho bản gel nóng lên 500C thì load mẫu.
-Trộn sản phẩm PCR với 5 l Loading dye SSR. Biến tính các sản phẩm
PCR ở 950C trong 10 phút, rồi ngay lập tức đặt vào trong đá và phủ đá lên
-Tra vào mỗi giếng 5 l sản phẩm PCR đã đƣợc làm biến tính, các mẫu chạy với ladder 100 bp.
Thời gian tra mẫu không quá dài để tránh bản gel bị nguội.
-Tiến hành điện di với công suất 60W, thời gian chạy ngắn hay dài tùy
kích thƣớc từng mồi sử dụng.
Nhuộm bạc:
+ Chuẩn bị các dung dịch
-Dung dịch cố định/dừng phản ứng (Fix/Stop solution): gồm có 100ml
glacial acetic acid và 900ml nƣớc cất.
-Dung dịch nhuộm (Staining solution) đƣợc tạo thành bằng cách hòa tan
1g bạc nitrat (AgNO3) vào 1 lít nƣớc cất, sau đó bổ sung thêm 1,5ml formaldehyd (H2CO) 37%.
-Dung dịch hiện (Developing solution): Hòa tan 30g natri cacbonat (Na2CO3) trong 1 lít nƣớc cất và làm lạnh ở 40
C.
Chú ý. (Trƣớc khi sử dụng thêm 1,5ml formaldehyd (H2CO) 37% và 400 l natri thiosulfat 10% (Na2S2O.5H2O).
+ Tiến hành nhuộm
Sau khi chạy điện đi, tháo gỡ tấm kính bám gel và tiến hành các bƣớc sau: -Cố định gel: Đặt tấm kính vào khay sao cho mặt bám gel hƣớng lên trên, đổ dung dịch cố định/dừng phản ứng và lắc nhẹ trong khoảng 30 phút. Sau đó lấy gel ra khỏi dung dịch. Chú ý: Giữ lại dung dịch này để dùng cho bƣớc sau.
-Rửa gel bằng nƣớc cất 2 lần, mỗi lần 3 phút. Cho gel vào dung dịch nhuộm, lắc nhẹ trong 30 phút. Thêm formaldehyd và sodium thiolsufat vào
dung dịch hiện. Lấy gel ra khỏi dung dịch nhuộm, rửa nhanh bằng nƣớc cất trong 5 - 10 giây.
-Đƣa gel vào dung dịch hiện và lắc nhẹ đến khi các băng xuất hiện. Cho
gel vào dung dịch cố định/dừng phản ứng ở trên trong 3 - 6 phút. Rửa lại gel bằng nƣớc cất. Để gel khô tự nhiên sau đó ghi nhận kết quả.