III. Công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học B.thuringiensis
3.1.3. Phân loại Bt bằng phương pháp huyết thanh
Vi khuẩn Bt được chia thành nhiều dưới loài khác nhau, mỗi dưới loài mang các đặc điểm riêng biệt. Trong số các dưới loài Bt thì dưới loài Bt. var.
kustaki có khả năng diệt côn trùng bộ cánh vảy. Chính vì vậy chúng tôi tiến
hành sàng lọc dưới loài Bt. var. kustaki từ các chủng phân lập bằng cách sử dụng typ huyết thanh H3a, 3b,3c
Với kit huyết thanh miễn dịch chuẩn nhận từ phòng Di truyền Vi sinh vật Tế bào sinh
dưỡng Bào tử Tinh thể độc
chúng tôi tiến hành sàng lọc các chủng Bt. var. kustaki bằng cách sử dụng typ huyết thanh H3a, 3b, 3c.
Với phương pháp phân loại được trình bày ở phần 2.3.3, kết quả là 39 trên tổng số 81 chủng nghiên cứu được khẳng định thuộc dưới loài kustaki thông qua phản ứng ngưng kết với typ huyết thanh H3a, 3b, 3c
Hình 3.3. Hình ảnh ngưng kết của chủng TC 2.5 (2) và chủng đối chứng 4D4(1)
3.2. Thử nghiệm hoạt tính diệt sâu tơ (Plutella xylostella) của các chủng
Bacillus thiringiensis phân lập
Các chủng Bt phân lập được pha loãng tới nồng độ 1x105 và 1x107 bt/ml bằng nước cất vô trùng. Thử nghiệm theo phương pháp nhúng đĩa lá của Thiery và Frachon như đã trình bày ở phần vật liệu và phương pháp nghiên cứu. Chúng tôi lựa chọn thử hoạt tính cho 5 chủng Bt var kustaki phân lập.
Tỷ lệ sâu chết được theo dõi trong 3 ngày. Kết quả thử nghiệm được trình bày trong bảng sau:
Bảng 3.2. Kết quả thử hoạt tính diệt sâu tơ sau 3 ngày thử nghiệm
STT Tên chủng Tỷ lệ sâu chết (%)
105 bào tử/ml 107 bào tử/ml 1 Đối chứng 0 0 2 TrC 1.3 76,66 83,33 3 TC2.7 86,66 93,33 4 TC 2.5 100 100 5 TD 1.8 70 83,33 6 TD 1.6 86,66 100
Từ bảng 3.2 cho thấy: sau 3 ngày thử nghiệm hoạt tính diệt sâu của các chủng nghiên cứu là khá cao. Ở nồng độ 107 baò tử, tỷ lệ sâu chết từ tất cả các chủng thí nghiệm đều trên 80%. Có hai chủng đạt tỷ lệ diệt sâu 100% trong đó chủng TC 2.5 diệt 100% số sâu thí nghiệm ở ngay nồng độ 105 baò tử. Từ kết quả của thí nghiệm trên chúng tôi lựa chọn chủng TC 2,5 để tiến hành nghiên cứu tạo chế phẩm diệt sâu sinh học.
3.3. Sản xuất thử nghiệm chế phẩm Bt trong phòng thí nghiệm
3.3.1. Ảnh hưởng của điều kiện lên men đến sinh trưởng của chủng TC2.5
3.3.1.1. Ảnh hưởng của pH
Vi khuẩn Bacillus thuringiensis cũng giống như tất cả các vi sinh vật khác, do có cấu trúc bé nhỏ và đơn giản nên chịu tác động trực tiếp của các yếu tố ngoại cảnh, trong đó, pH là một trong những tác nhân ảnh hưởng trực tiếp tới sinh trưởng và hình thành các sản phẩm lên men của vi sinh vật. Để xác định pH thích hợp cho sinh trưởng của Bacillus thuringiensis, các thí nghiệm được tiến hành như sau: dịch lên men, được điều chỉnh về các độ pH: 5,0; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 9,0. Tiến hành các thí nghiệm trong bình nón 500 ml với dung
tích môi trường 100 ml, nhiệt độ lên men 30oC, thời gian lên men 48 giờ, tốc độ lắc 200 vòng/phút. Kết quả nghiên cứu được thể hiện ở bảng 3.5.
Bảng 3.3 Ảnh hưởng của pH ban đầu đến sinh trưởng của chủng TC 2.5
Độ pH môi trường Mật độ tế bào (CFU/ml) 5,0 2,3 x106 6,0 1,5 x108 6,5 2,2x108 7,0 2,4 x108 7,5 4,5x108 8,0 1,1 x107 9,0 5,5 x106
Kết quả nghiên cứu ở bảng 3. 3 cho thấy chủng TC 2.5 sinh trưởng tốt trên môi trường trung tính. Ở thí nghiệm có pH ban đầu thấp (pH5) và pH cao (pH9) khả năng sinh trưởng của TC 2.5 không tốt, mật độ tế bào chỉ đạt 106 CFU/ml, tương đương với mật độ cấp giống ban đầu, thấp hơn hàng trăm lần so với mật độ tế bào đạt được ở các thí nghiệm có pH trung tính. Ở các thí nghiệm có pH ban đầu từ 6,5 – 7,5 mật độ tế bào đạt được trong dịch canh trường sau 48 giờ lên men tương đương nhau. Như vậy, vi khuẩn Bacillus
thuringiensis sinh trưởng tốt trong môi trường có pH ban đầu từ 6,5 – 7,5.
3.3.1.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Trong tự nhiên tuỳ thuộc nhóm vi sinh vật, mà nhiệt độ sinh trưởng khác nhau. Ở nhiệt độ thích hợp, vi sinh vật sinh trưởng mạnh, tạo nhiều sinh khối và các sản phẩm phụ. Ngược lại, nhiệt độ không thích hợp sẽ gây ức chế sự phát triển hoặc tiêu diệt vi sinh vật. Do vậy, cần xác định nhiệt độ tốt ưu cho quá trình lên men. Thí nghiệm được thực hiện ở các nhiệt độ: 20oC, 25oC, 30oC, 35oC, 40oC, 45oC.
Nhiệt độ lên men (oC) Mật độ tế bào (CFU/ml) 20 6,5 x 107 25 2,8 x 108 30 5,49 x 108 35 4,3 x 108 40 8,5 x 107 45 2,3 x 106
Kết quả nghiên cứu ở bảng 3.4 cho thấy: nhiệt độ có ảnh hưởng mạnh đến sinh trưởng của chủng TC 2.5. Chủng TC 2.5 sinh trưởng mạnh nhất trong khoảng nhiệt độ từ 25 – 35oC, ở nhiệt độ này mật độ tế bào, bào tử đạt 4,19x108
CFU/ml. Kết quả nghiên cứu này cũng phù hợp với các kết quả nghiên cứu của Ngô Đình Bính và các cộng sự về ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của
Bacillus thuringiensis. Theo đó, nhiệt độ sinh trưởng tốt nhất của vi khuẩn
Bacillus thuringiensis là 28±1oC (Ngô Đình Bính,2011; Tien et al., 2013; Trang
et al., 2012). Ở nhiệt độ dưới 20oC vi khuẩn B. thuringiensis sinh trưởng chậm, trên 40oC bắt đầu ức chế sự sinh trưởng.
3.3.2. Lên men TC 2.5 tạo chế phẩm
Sau khi nghiên cứu sơ bộ các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men tiến hành lên men sản xuất tạo chế phẩm trong điều kiện PH=7, nhiệt độ: 30oC, lắc ở 200 vòng/phút trong thời gian 72 giờ. Sau khi kết thúc lên men thu sinh khối và đặt trong tủ âm rồi tiến hành đông khô, thu được chế phẩm dạng bột.
Hình 3.4. Chế phẩm Bt dạng bột sau khi lên men.
3.3.3. Thử nghiệm hoạt tính diệt sâu tơ của chế phẩm Bt – TC2.5
Để đánh giá hoạt tính sinh học của chế phẩm Bt-TC 2.5 chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm thử hoạt tính diệt sâu tơ của chế phẩm Các thí nghiệm được tiến
hành trong cùng một điều kiện nhiệt độ, ánh sáng thông thường, bố trí thí nghiệm được trình bày trong chương 2. (Vật liệu và phương pháp nghiên cứu).
Quá quá trình thử hoạt tính cho thấy, 100% sâu chết sau 3 ngày nghiên
cứu sau khi ăn lá cây có chứa chế phẩm BT- TC2.5. Như vậy, chủng TC2.5 sau
khi lên men tạo chế phẩm ở các điều kiện như trên vẫn giữ được hoạt tính diệt
(A): Sâu tơ chết do ăn lá cây được tẩm dịch chế phẩm Bt – TC25
(B): Sâu tơ vẫn còn sống ở lô đối chứng dương với lá cây ngâm trong nuớc cất
Hình 3.5. Thử hoạt tính diệt sâu tơ với chế phẩm Bt-TC2.5 sau 3 ngày thí nghiệm
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận
1) Đã thử nghiệm hoạt tính diệt sâu của 5 chủng Bt var. kustaki. Kết quả cho thấy, ở nồng độ 107 bào tử/ml thì hoạt tính diệt sâu là rất cao trong đó chủng TC 2.5 có khả năng diệt 100% sâu thử nghiệm ngay ở nồng độ 105. Chủng TC 2.5 được lựa chọn để lên men tạo chế phẩm diệt sâu tơ.
2), Đã xác định được khoảng nhiệt độ 28±1oC và độ pH từ 6,5 – 7,5 thích hợp cho lên men chế phẩn Bt thử nghiệm. .
3) Đã thành công trong việc tạo ra chế phẩm Bt-TC2.5 có hoạt tính diệt sâu tơ cao.
2. Kiến nghị
Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn chủng TC 2.5 và tối ưu hoá quy trình lên men sản xuất chế phẩm Bt ở quy mô công nghiệp.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu Tiếng Việt
1. Đái Duy Ban (2006), Công nghệ gen, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật. 2. Ngô Đình Bính, Nguyễn Quang Châu, Nguyễn Ánh Nguyệt (2002), Thu nhận huyết thanh miễn dịch cho phân loại Bacillus thuringiensis, Kỷ yếu 2001 -2002, Viện Công nghệ Sinh học, trang 296 – 302.
3. Ngô Đình Bính (2005),Giáo trình thuốc trừ sâu sinh học.
4. Nguyễn Xuân Cảnh, Nguyễn Ánh Nguyệt, Nguyễn Thanh Hạnh, Nguyễn Quỳnh Châu, Ngô Đình Bính (2004), Nghiên cứu sự đa dạng sinh học của vi khuẩn Bacillus thuringiensis ở Việt Nam. Báo cáo khoa học, nghiên cứu cơ bản trong Khoa học sự sống định hướng Nông lâm nghệp miền núi, Thái Nguyên 2004, NXB KHKT. trang 59 – 62.
5. Nguyễn Lân Dũng (1981), Sử dụng vi sinh vật để phòng trừ sâu hại cây trồng, NXB KHKT
6. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2003), Vi sinh vật học, NXB giáo dục.
7. Hoàng Thị Lợi (2003), Giáo trình côn trùng học nông nghiệp tập 2, NXB Nông nghiệp Hà Nội, trang 122 – 167.
8. Phan Cự Nhân, Nguyễn Minh Công, Đặng Hữu Lanh. Di truyền học, tập 1,
NXB Đại học Sư Phạm, trang 49 – 53.
9. Khuất Hữu thanh ( 2003), Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen.
NXBKHKT. Trang137 – 140, 206 – 210.
10. Đặng Trọng Lương, Vũ Đức Quang, Nguyễn Hữu Đống, Trần Duy Quý (1999), Thiết kế lại cấu trúc gen Bt để chuyển vào cây hai lá mầm, Báo cáo Hội nghị sinh học toàn quốc, trang 1371-1376.
Tài liệu Tiếng Anh
11. Attathom T, Chanpaisang J, and Hongrattanameteekul W. Bacillus thuringiensis Isolation, Indentification, and Bioasay. 1994. In Bacillus
thuringiensis, Biotechology and Environmental Benefits, pp70 – 86.
12. Barjac D H and Bonnefoi A (1962), Essai de classification biochimique et serologique de 24 souches de Bacillus du type B. Bacillus thuringiensis.
Entomophaga, 7, pp 5 – 31.
13. Barjac D H (1981), Identification of H- serotypes of Bacillus thuringiensis. 36 – 42 Burges H.D. (edited), In microbial control of pests and plant Diseasis 1970 – 1980.
14. Barjac D H & Frachon E (1990), Classification of Bacillus thuringiensis
strains, Entomophaga 35, pp 233 – 240.
16. Cheng X Y, Sardana R, Kaplan H et al. (1998), Agrobacterium transformed rice plants expressing synthetic cryIA(b) and cryIA(c) genes are highly toxic to striped stem borer and yellow stem borer. Pp: 154-172.
17. Chicott, C. N., Wigley, P. J. 1993. Insecticidal activity of Bacillus
thuringiensis crytal protein. Proceedings of the 2nd Canberra Bacillus
thuringiensis meeting. P. 43-52.
17. Dams. A, L.F., T.E Visick, ADN H.R.Whiteley (1989), A20 – Kilodaltonprotein is required for efficient production of the Bacillus thuringiensis var. israelensis 27 – Kilodalton crystal protein in E. coli. J.
Bacteriol. 171, pp 521 – 5 30.
18. Didier, L.D.. Ameller, ADN M.Marguerite (1993), Lecadet Diverst ty of
Bacillus thuringiensis toxin ADN Genes. Pp 34 -45.
19. Dwu, XL. Cao, Y.Y Bai, ADN AI. Aronson (1991), Sequensing of an operon containing a novel δ-endotoxin gene from Bacillus thuringiensis.
FEMS microbial. Lett. 81 – 31.
toxin and genes (1993), In Bacillus thuringiensis an environmental pesticide Theory and Practice. Dited by P. F. Entwistle, J. S. Cory, M. J. Bailey and S. Higgs, pp 37 – 60.
21. Federici, B.A., Park, H.W. & Bideshi, D.K. 2010. Overview of the Basic Biology of Bacillus thuringiensis with Emphasis on Genetic Engineering of Bacterial Larvicides for Mosquito Control. The Open Toxinology Journal., 3, 83-100.
22. Frankenhuyzen V K. The challenge of Bacillus thuringiensis. In Bacillus
thuringiensis an environmental pesticide: Theory and Practice. Edited by
P. F. Entwistle, J. S. Cory, M. J. Bailey and S. Higgs 1993, pp 1 – 23. 23. http://www.thainguyen.gov.vn
24. http://www.en.wikipedia.org/wiki/Lepidoptera # cite_note-cgillott-5 25. J. Li, D. J. Derbyshire, B. Promdonkoyt and D. J. Ellart (2001), Structural
- endotoxin fromimplicatios for ransformation of Bacillus
thuringiensis.water –soluble to membrane –inserted forms, Biochemical
Society: pp 571- 577.
26. Http: //web.utk.edu
27. Navon, A (2000), Bacillus thuringiensis insecticides in crop protection- reality and prospects, Crop Protection,19, pp 669-676.
28. Lacey, L.A., Frutos, R., Kaya, H.K. & Vail, P (2001), Insect pathogens as biological control agents: Do they have a future? Biological Control, 21, pp: 230-248.
29. Bauce, E., Carisey, N., Dupont, A. & van Frankenhuyzen (2004), Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki aerial spray prescriptions for balsam fir stand protection against spruce.pp: 621-630.
30. Crickmore (2006), Beyond the spore - past and future developments of
Bacillus thuringiensis as a biopesticide. Journal of Applied Microbiology,
31. Hernstadt, C., Soares, G.G., Wilcox, E.R. & Edwards, D.L (1986), A new strain of Bacillus thuringiensis with activity against coleopteran insects.
Bio/Technology, 4, pp 305-308.
32. Barton, K.A., Whiteley, H.R. & Yang, N.S. (1987). Bacillus thuringiensis
delta-endotoxin expressed in transgenic Nicotiana tabacum provides resistance to Lepidopteran insects. Plant Physiology, 85, pp:1103-1109. 32. Perlak, F.J., Deaton, R.W., Armstrong, T.A., Fuchs, R.L., Sims, S.R.,
Greenplate, J.T. & Fischhoff, D.A (1990) Insect resistant cotton plants.
Bio-Technology, 8, 939-943.
33. Fujimoto, H., Itoh, K., Yamamoto, M., Kyozuka, J. & Shimamoto (1993), Insect resistant rice generated by introduction of a modified delta- endotoxin gene of Bacillus thuringiensis. Bio-Technology, 11, pp 1151- 1155.
34. Yezza A., Tyagi R. D., Valero J. R. and Surampalli R. Y. (2005) Bioconversion of industrial wastewater and wastewater sludge in Bacillus Thuringiensis based biopesticides in pilot fermentor, Bioresource Technology. 97, pp. 1850-1857.
35. Yu, H.Y., Li, Y.H. & Ming Wu, K.M ( 2011), Risk Assessment and Ecological Effects of Transgenic Bacillus thuringiensis Crops on Non- Target Organisms. Journal of Integrative Plant Biology, 53, pp 520–538.
36. James, C. 2010. Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops (2010), ISAAA Briefs.
37. James, C (2013), Global status of commercialized biotech/GM crops: 2013.
ISAAA Briefs.
38. Capinera, J.L ( 2001), Handbook of Vegetable Pests. Academic Press pp 729.