III. Công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học B.thuringiensis
3.2. Lên men chìm
Đây là công nghệ lên men hiện đại, đạt hiệu quả cao. Trong đó, vi khuẩn được nuôi cấy trong các nồi lên men có thể tích lên đến vài chục mét khối. Được thổi khí qua máy nén trong điều kiện vô trùng. Thiết bị được trang bị
hệ điều khiển tự động cung cấp khí, nhiệt độ, điều chỉnh pH. Thời gian nuôi
cấy khoảng 2 – 3 ngày. Mật độ tế bào trong dịch lên men có thể lên đến
hàng tỷ trong 1 ml dịch nuôi cấy.
Công nghệ lên men chìm bao gồm các công đoạn chính như sau:
- Chuẩn bị giống vi sinh vật: giống phải đảm bảo là giống chuẩn có hoạt
lực diệt sâu cao, không bị tạp nhiễm. Trước khi đưa vào sản xuất giống được
hoạt hóa đảm bảo các tế bào đang ở giai đoạn sinh trưởng mạnh.
- Chuẩn bị môi trường lên men: môi trường dinh dưỡng phải đảm bảo
cung cấp đầy đủ dưỡng chất, được vô trùng và điều chỉnh pH về giá trị thích
hợp (với hầu hết các chủng Bacillus thuringiensis có pH thích hợp từ 6,5-7,5).
- Lên men thu hồi sản phẩm: các thông số lên men như tốc độ thổi khí,
tốc độ khuấy được cài đặt theo đặc tính của từng chủng vi sinh vật. Thời điểm
kết thúc quá trình lên men được xác định là thời điểm 95% tế bào đã chuyển
hóa thành bào tử và tinh thể độc.
- Thu hồi sản phẩm (downstream processing): dịch nuôi cấy có thể đóng chai dùng trực tiếp ở dạng lỏng hay qua ly tâm thu sinh khối rồi thêm phụ gia, sấy… hoàn thành dạng bột.
Quy trình sản xuất chế phẩm Bacillus thuringiensis bằng phương pháp lên men chìm theo sơ đồ sau :
Ống thạch nghiêng Giống cấp 1 Giống cấp 2 Chuẩn bị môi trường Lên men Kết thúc lên men Tách nước Bổ sung phụ gia chất bảo quản Bổ sung phụ gia chất bảo quản Chế phẩm lỏng Đóng chai, nhãn Chế phẩm thấm nước
Sấy phun Bao gói,nhãn
CHƯƠNG 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Sâu tơ (Plutella xylostella) ở độ tuổi 2 được cung cấp bởi Viện Bảo
vệ thực vật quốc gia.
Các mẫu đất thu thập được từ một số vùng: Tân Cương, Túc Duyên, Trại Cau của tỉnh Thái nguyên.
2.1.2. Hóa chất và thiết bị Hóa chất
1.Thuốc nhuộm Coomassie brilliant blue (CBB) 2. Dung dịch tẩy: 40ml methanol
50ml nước cất 10ml axit axetic
Pha CBB: 0,133g tinh thể CBB + 100ml dung dịch tẩy.
Hóa chất sử dụng trong nuôi cấy:
Tên hóa chất Nguồn gốc, hãng cung cấp
Agar Hạ Long, Việt Nam
Cao thịt Sigma, Đức
Pepton Phytech, USA
NaCl Merck, Đức
Kit huyết thanh miễn dịch chuẩn: typ huyết thanh H3a, 3b, 3c thu nhận từ Phòng Di truyền Vi sinh vật.
Các máy móc và thiết bị nghiên cứu gồm:
Tủ lạnh 8ºC, lò vi sóng, tủ ấm, cân điện tử 10ˉ¹, bếp đun, máy li tâm (Fresco, Đức), máy voltex (Ika, Đức), máy lắc (Gerharat, Đức), tủ lạnh sâu
(Frigo, Đan Mạch), …các thiết bị này thuộc Phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học Đại học Khoa học Thái Nguyên và trung tâm giống và bảo tồn nguồn gen vi sinh vật, Viện công nghệ Sinh học.
Ngoài ra chúng tôi còn sử dụng một số dụng cụ khác phục vụ cho quá trình nghiên cứu như: đĩa petri, bình tam giác, pipet…
Môi trường:
Các loại môi trường đã sử dụng trong quá trình thực hiện thí nghiệm: 1.Môi trường phân lập và giữ giống MPA:
Cao thịt: 3-5g NaCl: 5g Pepton: 10g H2 O: 1l Thạch: 20g pH: 7-7,2
2.Môi trường Craige dùng để phân lập chủng có khả năng chuyển động: Cao thịt: 3-5g NaCl: 5g
Pepton: 10g H2 O: 1l Thạch: 8g pH: 7-7,2 3. Môi trường lỏng MPB nuôi cấy Bt để thử huyết thanh: Cao thịt: 3-5g NaCl: 5g Pepton: 10g H2 O: 1l pH: 7-7,2
4. Môi trường lên men vi khuẩn Bt
Sử dụng môi trường LB có bổ sung các thành phần dưới đây:
- Muối khoáng: MgSO4.7H2O; CaCl2; KH2PO4; K2HPO4; NaCl, MnCl. Nồng độ khảo sát 0,1 g/l; 0,5 g/l; riêng MnSO4 ở nồng độ 0,01 và 0,05 g/l.
- Chất hữu cơ: bột đậu tương, cám gạo, bột ngô (nồng độ khảo sát 1 g/l và 3 g/l).
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp phân lập Bacillus thuringiensis
Mẫu đất được phân lập theo phương pháp của Ohba và Aizawa, 1986. Cân 1g đất cho vào bình tam giác 100ml chứa 10ml nước cất vô trùng, lắc ở 220
vòng/phút trong 10 phút. Lấy dịch ra cho vào ống eppendorf đun cách thủy ở 70oC trong 10 phút. Dịch đã xử lý pha loãng với nước cất vô trùng ở các nồng độ 10-2, 10-3, 10-4,10-5, 10-6. Hút 100µl dịch pha loãng trang lên đĩa Petri chứa môi trường MPA. Ở mỗi nồng độ pha loãng cấy 3 đĩa nuôi trong 72 giờ ở 28oC [2].
Sau 72 giờ nuôi cấy chọn những khuẩn lạc riêng rẽ mọc trên môi trường và làm tiêu bản để quan sát hình thái tế bào, bào tử, tinh thể trên kính hiển vi đối pha hoặc nhuộm bằng thuốc nhuộm tinh thể, quan sát ở vật kính dầu.
2.2.2. Phân loại Bacillus thuringiensis bằng phương pháp huyết thanh miễn dịch miễn dịch
Bộ huyết thanh miễn dịch chuẩn được thu nhận từ các chủng Bacillus
thuringiensis chuẩn theo phương pháp của Barjac và Bonnefoi, 1962 [12].
Các chủng Bacillus thuringiensis được cấy vào ống craige (ống thủy tinh nhỏ, được cắm thẳng đứng vào môi trường Craige chứa trong ống nghiệm), nuôi ở tủ 280C trong 24 - 48 giờ. Những tế bào có khả năng chuyển động sẽ di chuyển lên phía trên bề mặt môi trường giữa ống Craige và ống nghiệm. Vi khuẩn phát triển ở bề mặt này sẽ được cấy vào ống nghiệm có chứa 2 ml môi trường LB, lắc ở 70 - 75 vòng/phút trong 12 giờ. Phản ứng ngưng kết với kháng huyết thanh tương ứng được quan sát trên kính hiển vi: lấy 2 µl dịch nuôi cấy nhỏ trên phiến kính lõm để kiểm tra khả năng chuyển động của vi khuẩn, sau đó nhỏ tiếp 2 µl huyết thanh chuẩn (đã pha loãng) và quan sát dưới kính hiển vi [2].Thử lần lượt với các typ huyết thanh khác, cho đến khi vi khuẩn mất khả năng chuyển động tức là phản ứng ngưng kết xảy ra.
2.2.3. Phương pháp thử hoạt tính sinh học
2.2.3.1. Định lượng mật độ bào tử, tinh thể
Chủng Bacillus thuringiensis phân lập được được đem cấy thảm trên đĩa peptri chứa môi trường MPA và nuôi trong tủ ấm 280C trong 3-4 ngày sau đó thu lại toàn bộ sinh khối. Sinh khối được xử lý nhiệt ở 700C trong 10 phút. Dịch
đã xử lý nhiệt được pha loãng ở các nồng độ 10-6 đến 10-9, lấy 100µl mỗi nồng độ pha loãng được cấy thảm trên đĩa petri chứa môi trường MPA. Nuôi ở 280C sau 24 giờ đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa có độ pha loãng nhỏ nhất. Số lượng bào tử được tính theo công thức [9].
CFU= n.a.10
n : Số khuẩn lạc trung bình tạo thành trong 100µl dịch pha loãng.
a : nồng độ pha loãng.
2.2.3.2. Phương pháp thử hoạt tính sinh học của vi khuẩn Bt
Loại sâu thử: sâu tơ, sâu xanh, sâu khoang, sâu đục thân ở độ tuổi 2: từ 2-7 ngày tuổi,kích thước 3.5mm. Tiến hành theo phương pháp của Park và các cộng sự (1997): lá bắp cải, su hào tươi được cắt thành các miếng nhỏ, nhúng vào hỗn hợp dịch bào tử, tinh thể delta endotoxin có mật độ 1x108 CFU/ml, để khô trong box vô trùng, sau đó đặt lá vào đĩa petri và cho vào mỗi đĩa 10 con sâu, mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần. Các thí nghiệm được thực hiện ở nhiệt độ phòng nơi khô ráo thoáng mát. Theo dõi tỷ lệ sâu chết sau: 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ, 120 giờ [3], [18]. Tiến hành mẫu đối chứng: lá rau rửa sạch cho vào đĩa petri vô trùng, cho 10 con sâu vào đĩa petri đậy nắp và theo dõi tương tự như các mẫu thí nghiệm. Độ diệt sâu hữu hiệu được tính theo công thức của Abbott
A=(C - T)/C.100
Trong đó: A: % sâu chết. T: tỷ lệ sâu sống ở mẫu thí nghiệm
C: tỷ lệ sâu sống ở mẫu đối chứng cùng thời điểm đó
2.2.4. Phương pháp lên men vi sinh vật
2.2.4.1. Chuẩn bị dịch giống
Một vòng que cấy vi khuẩn Bacillus thuringiensis từ ống giống được đưa vào bình tam giác 500 ml có chứa 100 ml môi trường MTCS vô trùng. Nuôi lắc
ở 300C, 200 vòng/phút, thời gian nhân giống 8 - 10 giờ. Dịch nuôi cấy (chứa các tế bào đang ở giai đoạn sinh trưởng) được sử dụng để làm giống cho các thí nghiệm tiếp theo [34].
2.2.4.2 Lên men vi khuẩn Bacillus thuringiensis trong bình tam giác
Sử dụng bình tam giác 500 ml chứa 100 ml môi trường vô trùng bổ sung 1% dịch giống. Lên men trong máy lắc ổn nhiệt ở 30 ± 0,10C, tốc độ lắc 200 vòng/phút, thời gian nuôi 48giờ [34].
2.2.5. Phương pháp tính tần suất
- Tần số (n) là số lần xuất hiện của mỗi giá trị trong mẫu số liệu.
- Tần suất (f) là tỉ số giữa tần số n và kích thước mẫu N:
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập, tuyển chọn và phân loại các chủng Bacillus thuringiensis
3.1.1. Phân lập các chủng B. thuringiensis
Để phân lập và tuyển chọn được chủng B.thuringiensis có hoạt tính diệt côn trùng bộ 2 cánh (Diptera), 30 mẫu đất, lá được thu thập tại 3 địa điểm: đất đồi chè Tân Cương, đất trồng rau Túc Duyên, đất trồng hoa mầu Trại Cau của tỉnh Thái Nguyên. Mẫu đất được sử dụng để phân lập theo phương pháp trình bày ở mục 2.2.1. Các khuẩn lạc riêng rẽ, đặc trưng cho nhóm Bc – Bt được tách ra từ mẫu phân lập tương ứng với các mẫu đất nghiên cứu sau đó tiến hành quan sát dưới kính hiển vi quang học ở vật kính dầu. Tiêu bản được nhuộm đơn với Fushin. Qua đó, lựa chọn được các chủng Bt có khả năng hình thành bào tử và tinh thể. Khuẩn lạc Bt có đặc điểm: tròn, có màu trắng sữa, có mép nhăn hoặc không (Hình 3.1). Các mẫu đất được tiến hành phân lập theo phương pháp đã nêu ở trên. Sau 3 ngày nuôi cấy, trên đĩa thạch chứa môi trường MPA mọc lên một số khuẩn lạc khác nhau, trong đó chủ yếu khuẩn lạc của các loài sinh bào tử thuộc chi bacillus
Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn Bt
Khuẩn lạc Bt
Từ 30 mẫu đất thu thập tại Thái Nguyên, chúng tôi đã phân lập được 152 chủng thuộc chi Bacillus. Trong đó, đã xác định được 81 chủng Bacillus
thuringiensis sinh tinh thể sau khi nhuộm và quan sát trên kính hiển vi quang
học ở vật kính dầu. Có 23 trên tổng số 30 mẫu đất chứa vi khuẩn Bacillus thuringiensis. Tần suất xuất hiện là 0,76 và chỉ số Bt là 0,53. So với các tài liệu đã công bố của Ngô Đình Bính và cộng sự thì tần suất xuất hiện và chỉ số Bt ở Việt Nam lần luợt là 0,63 và 0,3. Trong khi đó, số liệu này trên thế giới đã được công bố là: 0,38 -0,85 [20]. 0,2 – 0,5 [17], Như vậy, các mẫu đất mà chúng tôi phân lập có chỉ số Bt là khá cao.
Tiến hành làm tiêu bản những khuẩn lạc có hình thái bên ngoài đặc trưng cho nhóm vi khuẩn Bacillus quan sát được trên các đĩa phân lập và nhuộm với thuốc nhuộm Fushin bazơ để quan sát dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 1000 lần để kiểm tra khả năng hình thành bào tử và tinh thể.
3.1.2. Sự đa dạng hình thái tinh thể các chủng B. thuringiensis phân lập
Các protein tinh thể của Bt có 4 dạng: hình lưỡng tháp, hình ovan, hình lập phương và hình không xác định. Các chủng khác nhau có khả năng sinh ra tinh thể có hình dạng khác nhau. Bằng phương pháp quan sát sơ bộ trực tiếp trên kính hiển vi quang học ở vật kính dầu với tiêu bản nhuộm đơn bằng fushin, chúng tôi tiến hành phân loại hình dạng tinh thể cho các chủng Bt phân lập (bảng 3.1)
Bảng 3.1. Sự phân bố hình dạng tinh thể của các chủng Bacillus thuringiensis STT Hình dạng Số chủng Tỉ lệ (%) 1 Hình lưỡng tháp 42 51,58 2 Hình cầu 17 21 3 Hình lập phương 15 18,51 4 Hình cầu, hình lưỡng tháp 4 4,93 5 Hình lập phương, hình cầu 1 1,23 6 Cầu-Lưỡng tháp-Lập phương 2 2,45
Từ số liệu thống kê ở bảng 3.1 ta thấy các chủng Bt phân lập đều sinh tinh thể, trong đó các chủng sinh tinh thể hình lưỡng tháp chiếm ưu thế (51,58%). Ngoài ra ta thấy còn có các chủng Bt sinh ra 2 loại tinh thể (6,16%) và 3 loại tinh thể (2,45%). Điều này thể hiện tính đa dạng về hình dạng tinh thể của chủng Bt phân lập tại Thái Nguyên và qua đó cho thấy Bt có phổ diệt côn trùng rộng từ côn trùng bộ cánh vảy, bộ cánh cứng, bộ hai cánh tới giun tròn thực vật.
Hình 3.2. Hình ảnh tế bào sinh dưỡng, bào tử và tinh thể của vi khuẩn Bt quan sát dưới kính hiển vi quang học độ phóng đại 1000 vật kính dầu
3.1.3. Phân loại Bt bằng phương pháp huyết thanh
Vi khuẩn Bt được chia thành nhiều dưới loài khác nhau, mỗi dưới loài mang các đặc điểm riêng biệt. Trong số các dưới loài Bt thì dưới loài Bt. var.
kustaki có khả năng diệt côn trùng bộ cánh vảy. Chính vì vậy chúng tôi tiến
hành sàng lọc dưới loài Bt. var. kustaki từ các chủng phân lập bằng cách sử dụng typ huyết thanh H3a, 3b,3c
Với kit huyết thanh miễn dịch chuẩn nhận từ phòng Di truyền Vi sinh vật Tế bào sinh
dưỡng Bào tử Tinh thể độc
chúng tôi tiến hành sàng lọc các chủng Bt. var. kustaki bằng cách sử dụng typ huyết thanh H3a, 3b, 3c.
Với phương pháp phân loại được trình bày ở phần 2.3.3, kết quả là 39 trên tổng số 81 chủng nghiên cứu được khẳng định thuộc dưới loài kustaki thông qua phản ứng ngưng kết với typ huyết thanh H3a, 3b, 3c
Hình 3.3. Hình ảnh ngưng kết của chủng TC 2.5 (2) và chủng đối chứng 4D4(1)
3.2. Thử nghiệm hoạt tính diệt sâu tơ (Plutella xylostella) của các chủng
Bacillus thiringiensis phân lập
Các chủng Bt phân lập được pha loãng tới nồng độ 1x105 và 1x107 bt/ml bằng nước cất vô trùng. Thử nghiệm theo phương pháp nhúng đĩa lá của Thiery và Frachon như đã trình bày ở phần vật liệu và phương pháp nghiên cứu. Chúng tôi lựa chọn thử hoạt tính cho 5 chủng Bt var kustaki phân lập.
Tỷ lệ sâu chết được theo dõi trong 3 ngày. Kết quả thử nghiệm được trình bày trong bảng sau:
Bảng 3.2. Kết quả thử hoạt tính diệt sâu tơ sau 3 ngày thử nghiệm
STT Tên chủng Tỷ lệ sâu chết (%)
105 bào tử/ml 107 bào tử/ml 1 Đối chứng 0 0 2 TrC 1.3 76,66 83,33 3 TC2.7 86,66 93,33 4 TC 2.5 100 100 5 TD 1.8 70 83,33 6 TD 1.6 86,66 100
Từ bảng 3.2 cho thấy: sau 3 ngày thử nghiệm hoạt tính diệt sâu của các chủng nghiên cứu là khá cao. Ở nồng độ 107 baò tử, tỷ lệ sâu chết từ tất cả các chủng thí nghiệm đều trên 80%. Có hai chủng đạt tỷ lệ diệt sâu 100% trong đó chủng TC 2.5 diệt 100% số sâu thí nghiệm ở ngay nồng độ 105 baò tử. Từ kết quả của thí nghiệm trên chúng tôi lựa chọn chủng TC 2,5 để tiến hành nghiên cứu tạo chế phẩm diệt sâu sinh học.
3.3. Sản xuất thử nghiệm chế phẩm Bt trong phòng thí nghiệm
3.3.1. Ảnh hưởng của điều kiện lên men đến sinh trưởng của chủng TC2.5
3.3.1.1. Ảnh hưởng của pH
Vi khuẩn Bacillus thuringiensis cũng giống như tất cả các vi sinh vật khác, do có cấu trúc bé nhỏ và đơn giản nên chịu tác động trực tiếp của các yếu tố ngoại cảnh, trong đó, pH là một trong những tác nhân ảnh hưởng trực tiếp tới sinh trưởng và hình thành các sản phẩm lên men của vi sinh vật. Để xác định pH thích hợp cho sinh trưởng của Bacillus thuringiensis, các thí nghiệm được tiến hành như sau: dịch lên men, được điều chỉnh về các độ pH: 5,0; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 9,0. Tiến hành các thí nghiệm trong bình nón 500 ml với dung
tích môi trường 100 ml, nhiệt độ lên men 30oC, thời gian lên men 48 giờ, tốc độ lắc 200 vòng/phút. Kết quả nghiên cứu được thể hiện ở bảng 3.5.
Bảng 3.3 Ảnh hưởng của pH ban đầu đến sinh trưởng của chủng TC 2.5
Độ pH môi trường Mật độ tế bào