III. Công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học B.thuringiensis
2.2.4. Phương pháp lên men vi sinh vật
2.2.4.1. Chuẩn bị dịch giống
Một vòng que cấy vi khuẩn Bacillus thuringiensis từ ống giống được đưa vào bình tam giác 500 ml có chứa 100 ml môi trường MTCS vô trùng. Nuôi lắc
ở 300C, 200 vòng/phút, thời gian nhân giống 8 - 10 giờ. Dịch nuôi cấy (chứa các tế bào đang ở giai đoạn sinh trưởng) được sử dụng để làm giống cho các thí nghiệm tiếp theo [34].
2.2.4.2 Lên men vi khuẩn Bacillus thuringiensis trong bình tam giác
Sử dụng bình tam giác 500 ml chứa 100 ml môi trường vô trùng bổ sung 1% dịch giống. Lên men trong máy lắc ổn nhiệt ở 30 ± 0,10C, tốc độ lắc 200 vòng/phút, thời gian nuôi 48giờ [34].
2.2.5. Phương pháp tính tần suất
- Tần số (n) là số lần xuất hiện của mỗi giá trị trong mẫu số liệu.
- Tần suất (f) là tỉ số giữa tần số n và kích thước mẫu N:
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập, tuyển chọn và phân loại các chủng Bacillus thuringiensis
3.1.1. Phân lập các chủng B. thuringiensis
Để phân lập và tuyển chọn được chủng B.thuringiensis có hoạt tính diệt côn trùng bộ 2 cánh (Diptera), 30 mẫu đất, lá được thu thập tại 3 địa điểm: đất đồi chè Tân Cương, đất trồng rau Túc Duyên, đất trồng hoa mầu Trại Cau của tỉnh Thái Nguyên. Mẫu đất được sử dụng để phân lập theo phương pháp trình bày ở mục 2.2.1. Các khuẩn lạc riêng rẽ, đặc trưng cho nhóm Bc – Bt được tách ra từ mẫu phân lập tương ứng với các mẫu đất nghiên cứu sau đó tiến hành quan sát dưới kính hiển vi quang học ở vật kính dầu. Tiêu bản được nhuộm đơn với Fushin. Qua đó, lựa chọn được các chủng Bt có khả năng hình thành bào tử và tinh thể. Khuẩn lạc Bt có đặc điểm: tròn, có màu trắng sữa, có mép nhăn hoặc không (Hình 3.1). Các mẫu đất được tiến hành phân lập theo phương pháp đã nêu ở trên. Sau 3 ngày nuôi cấy, trên đĩa thạch chứa môi trường MPA mọc lên một số khuẩn lạc khác nhau, trong đó chủ yếu khuẩn lạc của các loài sinh bào tử thuộc chi bacillus
Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn Bt
Khuẩn lạc Bt
Từ 30 mẫu đất thu thập tại Thái Nguyên, chúng tôi đã phân lập được 152 chủng thuộc chi Bacillus. Trong đó, đã xác định được 81 chủng Bacillus
thuringiensis sinh tinh thể sau khi nhuộm và quan sát trên kính hiển vi quang
học ở vật kính dầu. Có 23 trên tổng số 30 mẫu đất chứa vi khuẩn Bacillus thuringiensis. Tần suất xuất hiện là 0,76 và chỉ số Bt là 0,53. So với các tài liệu đã công bố của Ngô Đình Bính và cộng sự thì tần suất xuất hiện và chỉ số Bt ở Việt Nam lần luợt là 0,63 và 0,3. Trong khi đó, số liệu này trên thế giới đã được công bố là: 0,38 -0,85 [20]. 0,2 – 0,5 [17], Như vậy, các mẫu đất mà chúng tôi phân lập có chỉ số Bt là khá cao.
Tiến hành làm tiêu bản những khuẩn lạc có hình thái bên ngoài đặc trưng cho nhóm vi khuẩn Bacillus quan sát được trên các đĩa phân lập và nhuộm với thuốc nhuộm Fushin bazơ để quan sát dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 1000 lần để kiểm tra khả năng hình thành bào tử và tinh thể.
3.1.2. Sự đa dạng hình thái tinh thể các chủng B. thuringiensis phân lập
Các protein tinh thể của Bt có 4 dạng: hình lưỡng tháp, hình ovan, hình lập phương và hình không xác định. Các chủng khác nhau có khả năng sinh ra tinh thể có hình dạng khác nhau. Bằng phương pháp quan sát sơ bộ trực tiếp trên kính hiển vi quang học ở vật kính dầu với tiêu bản nhuộm đơn bằng fushin, chúng tôi tiến hành phân loại hình dạng tinh thể cho các chủng Bt phân lập (bảng 3.1)
Bảng 3.1. Sự phân bố hình dạng tinh thể của các chủng Bacillus thuringiensis STT Hình dạng Số chủng Tỉ lệ (%) 1 Hình lưỡng tháp 42 51,58 2 Hình cầu 17 21 3 Hình lập phương 15 18,51 4 Hình cầu, hình lưỡng tháp 4 4,93 5 Hình lập phương, hình cầu 1 1,23 6 Cầu-Lưỡng tháp-Lập phương 2 2,45
Từ số liệu thống kê ở bảng 3.1 ta thấy các chủng Bt phân lập đều sinh tinh thể, trong đó các chủng sinh tinh thể hình lưỡng tháp chiếm ưu thế (51,58%). Ngoài ra ta thấy còn có các chủng Bt sinh ra 2 loại tinh thể (6,16%) và 3 loại tinh thể (2,45%). Điều này thể hiện tính đa dạng về hình dạng tinh thể của chủng Bt phân lập tại Thái Nguyên và qua đó cho thấy Bt có phổ diệt côn trùng rộng từ côn trùng bộ cánh vảy, bộ cánh cứng, bộ hai cánh tới giun tròn thực vật.
Hình 3.2. Hình ảnh tế bào sinh dưỡng, bào tử và tinh thể của vi khuẩn Bt quan sát dưới kính hiển vi quang học độ phóng đại 1000 vật kính dầu
3.1.3. Phân loại Bt bằng phương pháp huyết thanh
Vi khuẩn Bt được chia thành nhiều dưới loài khác nhau, mỗi dưới loài mang các đặc điểm riêng biệt. Trong số các dưới loài Bt thì dưới loài Bt. var.
kustaki có khả năng diệt côn trùng bộ cánh vảy. Chính vì vậy chúng tôi tiến
hành sàng lọc dưới loài Bt. var. kustaki từ các chủng phân lập bằng cách sử dụng typ huyết thanh H3a, 3b,3c
Với kit huyết thanh miễn dịch chuẩn nhận từ phòng Di truyền Vi sinh vật Tế bào sinh
dưỡng Bào tử Tinh thể độc
chúng tôi tiến hành sàng lọc các chủng Bt. var. kustaki bằng cách sử dụng typ huyết thanh H3a, 3b, 3c.
Với phương pháp phân loại được trình bày ở phần 2.3.3, kết quả là 39 trên tổng số 81 chủng nghiên cứu được khẳng định thuộc dưới loài kustaki thông qua phản ứng ngưng kết với typ huyết thanh H3a, 3b, 3c
Hình 3.3. Hình ảnh ngưng kết của chủng TC 2.5 (2) và chủng đối chứng 4D4(1)
3.2. Thử nghiệm hoạt tính diệt sâu tơ (Plutella xylostella) của các chủng
Bacillus thiringiensis phân lập
Các chủng Bt phân lập được pha loãng tới nồng độ 1x105 và 1x107 bt/ml bằng nước cất vô trùng. Thử nghiệm theo phương pháp nhúng đĩa lá của Thiery và Frachon như đã trình bày ở phần vật liệu và phương pháp nghiên cứu. Chúng tôi lựa chọn thử hoạt tính cho 5 chủng Bt var kustaki phân lập.
Tỷ lệ sâu chết được theo dõi trong 3 ngày. Kết quả thử nghiệm được trình bày trong bảng sau:
Bảng 3.2. Kết quả thử hoạt tính diệt sâu tơ sau 3 ngày thử nghiệm
STT Tên chủng Tỷ lệ sâu chết (%)
105 bào tử/ml 107 bào tử/ml 1 Đối chứng 0 0 2 TrC 1.3 76,66 83,33 3 TC2.7 86,66 93,33 4 TC 2.5 100 100 5 TD 1.8 70 83,33 6 TD 1.6 86,66 100
Từ bảng 3.2 cho thấy: sau 3 ngày thử nghiệm hoạt tính diệt sâu của các chủng nghiên cứu là khá cao. Ở nồng độ 107 baò tử, tỷ lệ sâu chết từ tất cả các chủng thí nghiệm đều trên 80%. Có hai chủng đạt tỷ lệ diệt sâu 100% trong đó chủng TC 2.5 diệt 100% số sâu thí nghiệm ở ngay nồng độ 105 baò tử. Từ kết quả của thí nghiệm trên chúng tôi lựa chọn chủng TC 2,5 để tiến hành nghiên cứu tạo chế phẩm diệt sâu sinh học.
3.3. Sản xuất thử nghiệm chế phẩm Bt trong phòng thí nghiệm
3.3.1. Ảnh hưởng của điều kiện lên men đến sinh trưởng của chủng TC2.5
3.3.1.1. Ảnh hưởng của pH
Vi khuẩn Bacillus thuringiensis cũng giống như tất cả các vi sinh vật khác, do có cấu trúc bé nhỏ và đơn giản nên chịu tác động trực tiếp của các yếu tố ngoại cảnh, trong đó, pH là một trong những tác nhân ảnh hưởng trực tiếp tới sinh trưởng và hình thành các sản phẩm lên men của vi sinh vật. Để xác định pH thích hợp cho sinh trưởng của Bacillus thuringiensis, các thí nghiệm được tiến hành như sau: dịch lên men, được điều chỉnh về các độ pH: 5,0; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 9,0. Tiến hành các thí nghiệm trong bình nón 500 ml với dung
tích môi trường 100 ml, nhiệt độ lên men 30oC, thời gian lên men 48 giờ, tốc độ lắc 200 vòng/phút. Kết quả nghiên cứu được thể hiện ở bảng 3.5.
Bảng 3.3 Ảnh hưởng của pH ban đầu đến sinh trưởng của chủng TC 2.5
Độ pH môi trường Mật độ tế bào (CFU/ml) 5,0 2,3 x106 6,0 1,5 x108 6,5 2,2x108 7,0 2,4 x108 7,5 4,5x108 8,0 1,1 x107 9,0 5,5 x106
Kết quả nghiên cứu ở bảng 3. 3 cho thấy chủng TC 2.5 sinh trưởng tốt trên môi trường trung tính. Ở thí nghiệm có pH ban đầu thấp (pH5) và pH cao (pH9) khả năng sinh trưởng của TC 2.5 không tốt, mật độ tế bào chỉ đạt 106 CFU/ml, tương đương với mật độ cấp giống ban đầu, thấp hơn hàng trăm lần so với mật độ tế bào đạt được ở các thí nghiệm có pH trung tính. Ở các thí nghiệm có pH ban đầu từ 6,5 – 7,5 mật độ tế bào đạt được trong dịch canh trường sau 48 giờ lên men tương đương nhau. Như vậy, vi khuẩn Bacillus
thuringiensis sinh trưởng tốt trong môi trường có pH ban đầu từ 6,5 – 7,5.
3.3.1.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Trong tự nhiên tuỳ thuộc nhóm vi sinh vật, mà nhiệt độ sinh trưởng khác nhau. Ở nhiệt độ thích hợp, vi sinh vật sinh trưởng mạnh, tạo nhiều sinh khối và các sản phẩm phụ. Ngược lại, nhiệt độ không thích hợp sẽ gây ức chế sự phát triển hoặc tiêu diệt vi sinh vật. Do vậy, cần xác định nhiệt độ tốt ưu cho quá trình lên men. Thí nghiệm được thực hiện ở các nhiệt độ: 20oC, 25oC, 30oC, 35oC, 40oC, 45oC.
Nhiệt độ lên men (oC) Mật độ tế bào (CFU/ml) 20 6,5 x 107 25 2,8 x 108 30 5,49 x 108 35 4,3 x 108 40 8,5 x 107 45 2,3 x 106
Kết quả nghiên cứu ở bảng 3.4 cho thấy: nhiệt độ có ảnh hưởng mạnh đến sinh trưởng của chủng TC 2.5. Chủng TC 2.5 sinh trưởng mạnh nhất trong khoảng nhiệt độ từ 25 – 35oC, ở nhiệt độ này mật độ tế bào, bào tử đạt 4,19x108
CFU/ml. Kết quả nghiên cứu này cũng phù hợp với các kết quả nghiên cứu của Ngô Đình Bính và các cộng sự về ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của
Bacillus thuringiensis. Theo đó, nhiệt độ sinh trưởng tốt nhất của vi khuẩn
Bacillus thuringiensis là 28±1oC (Ngô Đình Bính,2011; Tien et al., 2013; Trang
et al., 2012). Ở nhiệt độ dưới 20oC vi khuẩn B. thuringiensis sinh trưởng chậm, trên 40oC bắt đầu ức chế sự sinh trưởng.
3.3.2. Lên men TC 2.5 tạo chế phẩm
Sau khi nghiên cứu sơ bộ các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men tiến hành lên men sản xuất tạo chế phẩm trong điều kiện PH=7, nhiệt độ: 30oC, lắc ở 200 vòng/phút trong thời gian 72 giờ. Sau khi kết thúc lên men thu sinh khối và đặt trong tủ âm rồi tiến hành đông khô, thu được chế phẩm dạng bột.
Hình 3.4. Chế phẩm Bt dạng bột sau khi lên men.
3.3.3. Thử nghiệm hoạt tính diệt sâu tơ của chế phẩm Bt – TC2.5
Để đánh giá hoạt tính sinh học của chế phẩm Bt-TC 2.5 chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm thử hoạt tính diệt sâu tơ của chế phẩm Các thí nghiệm được tiến
hành trong cùng một điều kiện nhiệt độ, ánh sáng thông thường, bố trí thí nghiệm được trình bày trong chương 2. (Vật liệu và phương pháp nghiên cứu).
Quá quá trình thử hoạt tính cho thấy, 100% sâu chết sau 3 ngày nghiên
cứu sau khi ăn lá cây có chứa chế phẩm BT- TC2.5. Như vậy, chủng TC2.5 sau
khi lên men tạo chế phẩm ở các điều kiện như trên vẫn giữ được hoạt tính diệt
(A): Sâu tơ chết do ăn lá cây được tẩm dịch chế phẩm Bt – TC25
(B): Sâu tơ vẫn còn sống ở lô đối chứng dương với lá cây ngâm trong nuớc cất
Hình 3.5. Thử hoạt tính diệt sâu tơ với chế phẩm Bt-TC2.5 sau 3 ngày thí nghiệm
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận
1) Đã thử nghiệm hoạt tính diệt sâu của 5 chủng Bt var. kustaki. Kết quả cho thấy, ở nồng độ 107 bào tử/ml thì hoạt tính diệt sâu là rất cao trong đó chủng TC 2.5 có khả năng diệt 100% sâu thử nghiệm ngay ở nồng độ 105. Chủng TC 2.5 được lựa chọn để lên men tạo chế phẩm diệt sâu tơ.
2), Đã xác định được khoảng nhiệt độ 28±1oC và độ pH từ 6,5 – 7,5 thích hợp cho lên men chế phẩn Bt thử nghiệm. .
3) Đã thành công trong việc tạo ra chế phẩm Bt-TC2.5 có hoạt tính diệt sâu tơ cao.
2. Kiến nghị
Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn chủng TC 2.5 và tối ưu hoá quy trình lên men sản xuất chế phẩm Bt ở quy mô công nghiệp.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu Tiếng Việt
1. Đái Duy Ban (2006), Công nghệ gen, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật. 2. Ngô Đình Bính, Nguyễn Quang Châu, Nguyễn Ánh Nguyệt (2002), Thu nhận huyết thanh miễn dịch cho phân loại Bacillus thuringiensis, Kỷ yếu 2001 -2002, Viện Công nghệ Sinh học, trang 296 – 302.
3. Ngô Đình Bính (2005),Giáo trình thuốc trừ sâu sinh học.
4. Nguyễn Xuân Cảnh, Nguyễn Ánh Nguyệt, Nguyễn Thanh Hạnh, Nguyễn Quỳnh Châu, Ngô Đình Bính (2004), Nghiên cứu sự đa dạng sinh học của vi khuẩn Bacillus thuringiensis ở Việt Nam. Báo cáo khoa học, nghiên cứu cơ bản trong Khoa học sự sống định hướng Nông lâm nghệp miền núi, Thái Nguyên 2004, NXB KHKT. trang 59 – 62.
5. Nguyễn Lân Dũng (1981), Sử dụng vi sinh vật để phòng trừ sâu hại cây trồng, NXB KHKT
6. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2003), Vi sinh vật học, NXB giáo dục.
7. Hoàng Thị Lợi (2003), Giáo trình côn trùng học nông nghiệp tập 2, NXB Nông nghiệp Hà Nội, trang 122 – 167.
8. Phan Cự Nhân, Nguyễn Minh Công, Đặng Hữu Lanh. Di truyền học, tập 1,
NXB Đại học Sư Phạm, trang 49 – 53.
9. Khuất Hữu thanh ( 2003), Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen.
NXBKHKT. Trang137 – 140, 206 – 210.
10. Đặng Trọng Lương, Vũ Đức Quang, Nguyễn Hữu Đống, Trần Duy Quý (1999), Thiết kế lại cấu trúc gen Bt để chuyển vào cây hai lá mầm, Báo cáo Hội nghị sinh học toàn quốc, trang 1371-1376.
Tài liệu Tiếng Anh
11. Attathom T, Chanpaisang J, and Hongrattanameteekul W. Bacillus thuringiensis Isolation, Indentification, and Bioasay. 1994. In Bacillus
thuringiensis, Biotechology and Environmental Benefits, pp70 – 86.
12. Barjac D H and Bonnefoi A (1962), Essai de classification biochimique et serologique de 24 souches de Bacillus du type B. Bacillus thuringiensis.
Entomophaga, 7, pp 5 – 31.
13. Barjac D H (1981), Identification of H- serotypes of Bacillus thuringiensis. 36 – 42 Burges H.D. (edited), In microbial control of pests and plant Diseasis 1970 – 1980.
14. Barjac D H & Frachon E (1990), Classification of Bacillus thuringiensis
strains, Entomophaga 35, pp 233 – 240.
16. Cheng X Y, Sardana R, Kaplan H et al. (1998), Agrobacterium transformed rice plants expressing synthetic cryIA(b) and cryIA(c) genes are highly toxic to striped stem borer and yellow stem borer. Pp: 154-172.
17. Chicott, C. N., Wigley, P. J. 1993. Insecticidal activity of Bacillus
thuringiensis crytal protein. Proceedings of the 2nd Canberra Bacillus
thuringiensis meeting. P. 43-52.
17. Dams. A, L.F., T.E Visick, ADN H.R.Whiteley (1989), A20 – Kilodaltonprotein is required for efficient production of the Bacillus thuringiensis var. israelensis 27 – Kilodalton crystal protein in E. coli. J.
Bacteriol. 171, pp 521 – 5 30.
18. Didier, L.D.. Ameller, ADN M.Marguerite (1993), Lecadet Diverst ty of
Bacillus thuringiensis toxin ADN Genes. Pp 34 -45.
19. Dwu, XL. Cao, Y.Y Bai, ADN AI. Aronson (1991), Sequensing of an operon containing a novel δ-endotoxin gene from Bacillus thuringiensis.
FEMS microbial. Lett. 81 – 31.
toxin and genes (1993), In Bacillus thuringiensis an environmental pesticide Theory and Practice. Dited by P. F. Entwistle, J. S. Cory, M. J. Bailey and S. Higgs, pp 37 – 60.
21. Federici, B.A., Park, H.W. & Bideshi, D.K. 2010. Overview of the Basic Biology of Bacillus thuringiensis with Emphasis on Genetic Engineering of Bacterial Larvicides for Mosquito Control. The Open Toxinology Journal., 3, 83-100.
22. Frankenhuyzen V K. The challenge of Bacillus thuringiensis. In Bacillus
thuringiensis an environmental pesticide: Theory and Practice. Edited by
P. F. Entwistle, J. S. Cory, M. J. Bailey and S. Higgs 1993, pp 1 – 23. 23. http://www.thainguyen.gov.vn
24. http://www.en.wikipedia.org/wiki/Lepidoptera # cite_note-cgillott-5 25. J. Li, D. J. Derbyshire, B. Promdonkoyt and D. J. Ellart (2001), Structural