2.2.1. Phương pháp vi sinh
2.2.1.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn
Vi khuẩn lactic được phân lập từ các hạt kefir trên môi trường MRS có bổ sung 0,5% CaCO3. Lấy 10 gram mẫu nghiền trong 90 ml nước muối sinh lý NaCl 0,85%. Các thao tác được thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Mẫu được ngâm trong 30 phút để hòa tan mẫu và giải phóng tế bào vào nước muối sinh lý. Hút phần dịch nổi và tiến hành pha loãng cấp độ 10, sau đó lấy 100ml các dịch mẫu pha loãng từ nồng độ 10- 6 đến 10-2, đưa lên đĩa petri chứa môi trường thích hợp, cấy gạt và nuôi ở 30°C trong 2 ngày. Chọn lọc vi khuẩn lactic dựa vào hình thái khuẩn lạc. Những dòng vi khuẩn được chấp nhận khi có hình dạng khuẩn lạc trắng đục, không màu, bờ láng, lồi, bìa nguyên hoặc chia thùy. Các khuẩn lạc này nằm trên đường cấy chuyển và không lẫn với các khuẩn lạc có màu sắc và hình thái khác lạ.
Sau khi được làm sạch, những chủng phân lập sẽ được kiểm tra hình thái và kiểm tra độ thuần dưới kính hiển vi quang học. Tiến hành định danh sơ bộ bằng
cách nhuộm Gram và thử catalase (Ashmaig et al. 2009). Vi khuẩn lactic được xác định: có hình tròn hoặc hình que, không sinh bào tử, Gram dương, catalase âm tính và phân giải được CaCO3.
2.2.1.2. Phương pháp đánh giá khả năng tạo sinh khối vi khuẩn lactic
▪ Xác định mật độ tế bào: đếm trực tiếp số lượng tế bào trên buồng đếm hồng
cầu. Lượng tế bào vi khuẩn được tính theo công thức: N (CFU/ml) = a × 0,25 × 106
Trong đó: a là số tế bào vi khuẩn trung bình đếm được trong 1 ô (1 ô có 16 ô nhỏ).
▪ Đo độ đục của sinh khối: Ly tâm 2 ml dịch lên men (chứa vi khuẩn) ở 8000
v/p trong 5 phút. Sinh khối vi khuẩn thu được tiếp tục được rửa (ly tâm 8000 v/p trong 5 phút) 2 lần bằng nước vô trùng. Hòa sinh khối với 1,5 ml nước cất. Đo độ đục (OD) của sinh khối ở λ = 600 nm. OD đo được càng lớn chứng tỏ sinh khối thu được càng nhiều.
2.2.1.3. Phương pháp định tên chủng giống
Việc xác định tên loài của chủng lựa chọn dựa vào trình tự đoạn gen mã hóa16S rRNA.
Tách chiết DNA tổng số: Vi khuẩn được nuôi trên môi trường LB dịch thể trong 20-24 giờ ở 37°C, 160 rpm. Tế bào thu được sau khi ly tâm, bỏ dịch được tách DNA tổng số bằng E.N.Z.A Bacterial DNA kit (Omega). DNA tổng số được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR.
- Phản ứng PCR: Đoạn gen 16S rRNA được khuếch đại bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 27F, 5' AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 3'; và 1492R 5' TACGGYTACCTTGTTACGACTT 3' trên máy Eppendorf™ Mastercycler™ pro PCR System (Thermo Fisher Scientific, Mỹ) với chu trình nhiệt như sau: 94C trong 3 phút; 30 chu kỳ (94 C trong 30 giây, 52 C trong 30 giây và 72 C trong 1 phút); 72 C trong 10 phút và bảo quản ở 20 C. Sau khi tinh sạch, sản phẩm PCR được đọc trình tự trên hệ thống 3730xl DNA Analyzer (Thermo Scienctific, Mỹ)
theo phương pháp Sanger. Trình tự gen 16S rRNA được so sánh với các trình tự đã công bố sử dụng cơ sở dữ liệu của EzBioCloud. Cây phân loại được thiết lập dựa trên phương pháp thống kê Neighbor-Joining (NJ) thông qua chương trình MEGA7. Giá trị bootstrap xuất hiện ở mỗi nhánh được thiết lập từ sau 1000 lần lặp lại.
2.2.2. Phương pháp phân tích hóa lý
2.2.2.1. Phương pháp xác định hàm lượng đường khử
Hàm lượng đường khử được xác định theo phương pháp DNS.
▪ Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử axit
dinitrosalicylic DNS. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng với nồng độ đường khử trong phạm vi nhất định. Dựa trên đồ thị đường chuẩn đối với glucoza tinh khiết tính được hàm lượng đường khử trong mẫu phân tích.
▪ Dụng cụ: Máy so màu, 10 ống nghiệm loại 20ml, 10 ống nghiệm loại 5ml, 1
bình định mức 100ml, máy đo độ ẩm, cuvet, giấy lọc.
▪ Hóa chất:
- Axit dinitrosalicylic DNS
- Muối tactarat kép KNaC4H4O6.4H2O - NaOH dung dịch 2M
Cân 0,25g DNS và 75g KNaC4H4O6.4H2O trong 50 ml NaOH 2M (4g NaOH trong 50 ml nước cất) định mức tới 250 ml bằng nước cất, bảo quản trong bình nâu ở 4°C trong 2 tuần.
▪ Tiến hành:
- Dựng đường chuẩn glucoza: Cân glucoza tinh khiết 99% sấy 105°C tới khô tuyệt đối rồi cân 1g phân tích hòa tan đường glucoza bằng nước cất và định mức tới 100 ml.
Nồng độ glucose chuẩn (mg/l) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 Số ml dung dịch glucose 1 g/l 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 Số ml nước cất 10 9,9 9,8 9,7 9,6 9,5 9,4 9,3 9,2 9,1 Sau đó lấy 100 µl các nồng độ pha loãng trên vào ống nghiệm 5ml (hoặc eppendorf) thêm 1000 µl DNS lắc kỹ, đun cách thủy 10 phút làm lạnh nhanh đến nhiệt độ phòng (100 µl nước cất + 1000 µl DNS làm mẫu trắng chỉnh máy so màu về 0) rồi đo trên máy so mầu với bước sóng 570 nm.
Vẽ đồ thị chuẩn với trục tung là OD, trục hoành là nồng độ đường (mg/ml)
▪ Xác định hàm lượng đường khử trong mẫu:
Pha loãng mẫu sao cho hàm lượng đường khử trong khoảng 0,12- 0,42 mg/ml rồi tiến hành đo xác định như trong phần dùng đồ thị chuẩn.
Dựa vào đồ thị đường chuẩn đã dựng, tra được hàm lượng đường khử trong mẫu phân tích.
Chú ý: Màu của hỗn hợp chỉ tạo ra trong môi trường kiềm, do vậy những mẫu
axit phải được trung hòa trước khi đem phân tích. Các mẫu đã được đun có thể để được một thời gian (20 phút) trước khi đo. Các mẫu không đun sẽ bị phân hủy dần dần.
2.2.2.2. Phương pháp xác định hàm lượng axit tổng (theo axit lactic)
Axit tổng số của một dung dịch là một tiêu chuẩn để đánh giá tất cả những ion hydro (H+) của cả những axit dễ bay hơi và những axit không bay hơi có mặt trong dung dịch.
▪ Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng trung hòa các axit có trong mẫu bằng dung dịch kiềm NaOH 0,1N với chỉ thị là phenolphthalein 0,1%. Từ lượng dịch kiềm tiêu hao, ta tính được lượng axit tổng số có trong mẫu.
▪ Cách tiến hành:
- Hút 20 ml dịch sau lên men vào bình tam giác 100 ml. - Nhỏ 1- 2 giọt phenolphthalein 0,1 % vào, lắc đều.
- Chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N. Vừa chuẩn vừa lắc, đến khi dung dịch chuẩn sang màu hồng nhạt thì dừng lại.
▪ Cách tính hàm lượng axit tổng trong dung dịch:
Những loại axit trong dung dịch được quy về một axit chung là axit lactic (C3H6O3)
C3H6O3 + NaOH → C3H5O3Na + H2O Lượng axit trong dịch sau lên men được tính theo công thức:
m (g/l) = K ×VNaOH
Vmẫu
Trong đó:
m : khối lượng của axit lactic (g/l)
K : hệ số quy đổi ra axit (với axit lactic K = 0,009) VNaOH : thể tích NaOH 0,1N đã dùng (ml)
Vmẫu : thể tích mẫu đã sử dụng (ml)
2.2.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng chất khô hòa tan
Hàm lượng chất khô hòa tan được xác định bằng chiết quang kế (Đức).
2.2.2.4. Phương pháp xác định hàm lượng kefiran (exopolysaccharide)
Phương pháp này dựa trên khả năng không tan trong ethanol và tan trong nước nóng của exopolysaccharide (phương pháp mô tả bởi Cheirsilp).
Sau thời gian nuôi cấy, dịch lên men được ly tâm tốc độ 15.000 v/p/10 phút ở 30°C để thu dịch trong. Hút 10 ml phần dịch trong sang ống facol, bổ sung 20 ml cồn lạnh để ở -20°C trong 24 giờ để làm kết tủa kefiran. Ly tâm 8.000 v/p/10 phút ở 4°C thu kết tủa. Hòa tan phần kết tủa trong 10 ml nước, đun sôi trong 10-15 phút, vortex để hòa tan lượng kefiran trên màng tế bào. Tiếp tục bổ sung 20 ml cồn lạnh, để ở -20°C trong 24 giờ và ly tâm 8.000 v/p/10 phút ở 4°C thu kết tủa. Kết tủa được hòa lại trong 10 ml nước nóng (>95°C) và được ly tâm lần cuối 8.000 v/p/10 phút ở 30°C, thu dịch trong. Dịch này dùng để xác định hàm lượng kefiran trong dịch lên men, được bảo quản ở -20°C cho đến khi phân tích. Sử dụng phương pháp xác định hàm lượng đường DNS để định lượng kefiran.
2.2.3. Phương pháp công nghệ
2.2.3.1. Phương pháp thủy phân bột gạo lứt
Gạo lứt sau khi tiến hành rang và nghiền thành bột sẽ được tiến hành thủy phân qua các bước sau:
- Hòa bột gạo lứt với nước theo tỉ lệ 1:4 và được bổ sung 0,2% enzyme Termamyl rồi đưa lên nhiệt độ 90°C giữ trong 30 phút.
- Sau khi kết thúc giai đoạn dịch hóa, khối dịch được hạ nhiệt độ xuống 52°C. Bổ sung 0,2 % Neutrase thực hiện giai đoạn đạm hóa.
- Tiếp theo, nâng nhiệt độ toàn khối lên 65°C và bổ sung 1,5% Dextrozyme, giữ trong 60 phút để thủy phân toàn bộ tinh bột thành đường.
- Bước cuối, nâng nhiệt độ khối dịch lên 72°C giữ trong 30 phút để thủy phân nốt các dextrin còn lại, rồi lọc thu phần dịch trong.
- Dịch gạo sau quá trình thủy phân được pha loãng về nồng độ thích hợp và hấp thanh trùng 115°C/15 phút, dùng để nuôi cấy vi sinh vật phục vụ cho nghiên cứu.
Các thí nghiệm được tiến hành trong các bình schott 500 ml. Dịch lên men là môi trường gạo lứt đã hồ hóa, được bổ sung dinh dưỡng theo các mục đích thí nghiệm. Chủng vi khuẩn lactic sau khi được hoạt hóa (trong môi trường cấp 1, cấp 2), ly tâm thu sinh khối, được bổ sung vào môi trường lên men. Theo dõi thông số của quá trình lên men theo thời gian.
PHẦN 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic thích hợp cho quá trình lên men gạo lứt giàu kefiran men gạo lứt giàu kefiran
3.1.1. Phân lập và sơ tuyển chủng vi khuẩn lactic
Tiến hành thu thập các mẫu hạt kefir, các hạt kefir trong môi trường sữa tươi không đường được lọc, tách hạt, đem rửa nhẹ bằng nước cất, và tiến hành phân lập. Từ các mẫu hạt Kefir, tiến hành phân lập các chủng vi khuẩn lactic có trong hạt Kefir. Sử dụng môi trường MRS có bổ sung 0,5% CaCO3 để lựa chọn vi khuẩn lactic. Sau khi lựa chọn, các chủng lactic được tiến hành xác định tốc độ sinh trưởng trên môi trường MRS lỏng trong 24 giờ. Kết quả quá trình khảo sát của các chủng vi khuẩn lactic được thể hiện ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1 Hình thái khuẩn lạc, tế bào của các chủng vi khuẩn lactic
TT Kí hiệu Xuất xứ Hình thái khuẩn lạc
1 LK1 Nguyễn Phong
Sắc, Cầu Giấy
Khuẩn lạc tròn, trơn, trắng sữa. Tế bào hình que, kết đôi.
2 Đại La, Hai Bà
Trưng
Khuẩn lạc tròn, trơn, bóng, trắng sữa. Tế bào hình cầu, hơi dài kết đôi.
3 LK3 Nguyễn An
Ninh, Hai Bà Trưng
Khuẩn lạc tròn, lồi, trắng đục. Tế bào hình que, mảnh, đơn lẻ.
4 LK4 Hồng Hà, Hoàn
Kiếm
Khuẩn lạc tròn, trơn, trắng sữa. Tế bào hình que, xếp chuỗi dài.
5 LK5 Kim Đồng, Hai
Bà Trưng
Khuẩn lạc tròn, trơn, trắng sữa. Tế bào hình que, kết đôi.
6 LK6 Nguyễn Ngọc
Nại, Thanh Xuân
Khuẩn lạc tròn, trơn, bóng, trắng sữa. Tế bào hình que, ngắn đơn lẻ, kết đôi.
7 LK7 Nghĩa Tân, Cầu Giấy
Khuẩn lạc tròn, lồi, trắng đục. Tế bào hình que, mảnh, đơn lẻ.
8 LK8 Hoàng Hoa
Thám, Ba Đình
Khuẩn lạc tròn, trơn, trắng đục. Tế bào hình que, đơn lẻ, kết đôi.
9 LK9 Liễu Giai, Ba
Đình
Khuẩn lạc tròn, trơn, trắng sữa. Tế bào hình que, xếp chuỗi dài.
10 LK10 Xuân La, Tây
Hồ
Khuẩn lạc tròn, trơn, trắng sữa. Tế bào hình que, kết đôi.
11 LK11 Thụy Khuê, Tây Hồ
Khuẩn lạc tròn, lồi, trắng đục. Tế bào hình que, mảnh, đơn lẻ.
Cảnh, Cầu Giấy xếp chuỗi dài. 13 LK13 Tôn Đức Thắng,
Đống Đa
Khuẩn lạc tròn, trơn, trắng đục. Tế bào hình que, đơn lẻ, kết đôi.
14 LK14 Trần Khát Trân, Hai Bà Trưng
Khuẩn lạc tròn, trơn, trắng sữa. Tế bào hình que, xếp chuỗi dài.
15 LK15 Lý Nam Đế,
Hoàn Kiếm
Khuẩn lạc tròn, trơn, trắng sữa. Tế bào hình que, xếp chuỗi dài.
16 LK16 Mỗ Lao, Hà
Đông
Khuẩn lạc tròn, trơn, trắng sữa. Tế bào hình que, kết đôi.
17 LK17 Dương Nội, Hà Đông
Khuẩn lạc tròn, trơn, trắng sữa. Tế bào hình que, kết đôi.
18 LK18 Xuân Thủy, Cầu Giấy
Khuẩn lạc tròn, trơn, trắng đục. Tế bào hình que, đơn lẻ, kết đôi.
19 LK19 Tam Trinh,
Hoàng Mai
Khuẩn lạc tròn, trơn, trắng đục. Tế bào hình que, đơn lẻ, kết đôi.
20 LK20 Ngọc Hồi,
Hoàng Mai
Khuẩn lạc tròn, trơn, trắng sữa. Tế bào hình que, xếp chuỗi dài.
Tiến hành lên men 20 chủng vi khuẩn lactic đã phân lập trong môi trường MRS ở 30°C trong 48 giờ. Kết thúc lên men, ly tâm thu sinh khối tế bào và phần dịch trong. Đánh giá mức độ tạo sinh khối của mỗi chủng và xác định hàm lượng axit tổng số trong dịch lên men. Kết quả được trình bày trong Hình 3.1.
Hình 3.1. Khả năng tạo sinh khối và axit tổng số của các chủng vi khuẩn lactic
Kết quả cho thấy, trong 20 chủng vi khuẩn lactic được khảo sát, các chủng kí hiệu , LK2, LK6, LK7, LK10, LK18 cho nhiều sinh khối nhất (OD = 1,135- 1,153). Lượng axit tạo thành trong môi trường sau khi lên men ứng với 6 chủng trên dao
0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 LK1 LK2 LK3 LK4 LK5 LK6 LK7 LK8 LK9 LK10 LK11 LK12 LK13 LK14 LK15 LK16 LK17 LK18 LK19 LK20 Ký hiệu chủng OD (600nm) Axit tổng số (g/l)
động trong khoảng 1,15- 1,28 g/l. Các chủng vi khuẩn có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt, tạo sinh khối nhiều sẽ thích hợp cho sinh tổng hợp kefiran hơn các chủng còn lại.
3.1.2. Lựa chọn chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp kefiran cao
Tiếp tục khảo sát khả năng sinh tổng hợp exopolysaccharide của 6 chủng lựa chọn trong môi trường dịch gạo lứt 5°Bx (có bổ sung 1% peptone, 0,5% cao nấm men) ở 30°C trong 48 giờ. Dịch gạo lứt sau khi lên men được xác định pH và hàm lượng kefiran.
Hình 3.2. Khả năng tạo kefiran của các chủng lactic
Kết quả cho thấy, trong môi trường dịch thủy phân gạo lứt, 6 chủng lựa chọn đều có khả năng sinh tổng hợp kefiran. Trong đó, chủng sản sinh ra lượng kefiran nhiều nhất (đạt 2,76 g/l). Các chủng còn lại có lượng kefiran dao động từ 1,81- 2,16 g/l. pH môi trường sau lên men từ các chủng khác nhau đều tương đương nhau (pH = 4,4). Như vậy, chủng LK2 được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2. Định danh chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn được
Đặc điểm hình thái và trình tự gen 16S rRNA của chủng LK2 được thể hiện trong hình 3.3 và hình 3.4. 4.32 4.34 4.36 4.38 4.4 4.42 4.44 4.46 4.48 4.5 4.52 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 LK2 LK6 LK7 LK10 LK12 LK18 g/l Kí hiệu chủng pH Hàm lượng kefiran (g/l)
a. Hình thái khuẩn lạc (trên môi trường MRS)
b. Hình thái tế bào (dưới kính hiển vi ×100)
Hình 3.3. Hình thái của chủng
Cây phát sinh chủng loại dựa vào trình tự 16S rRNA chỉ ra mối liên hệ giữa chủng LK2 và các loài gần gũi trong chi Leuconostoc. Trình tự 16S rRNA của
chủng tương đồng 100% với trình tự 16S rRNA của Leuconostoc mesenteroides
ATCC 8293 (T). Dựa trên các đặc điểm của chủng cũng như kết quả phân tích gen, có thể xếp chủng vào loài Leuconostoc mesenteroides. Kết quả này cũng thống nhất với báo cáo danh sách tên các chủng vi khuẩn lactic được tìm thấy trong hạt kefir đã được công bố.
Hình 3.4. Vị trí phân loại của chủng với các loài có quan hệ họ hàng gần trong chi Leuconostoc dựa vào trình tự gen rRNA 16S
3.3. Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất bột gạo lứt lên men lactic giàu kefiran kefiran
3.3.1. Sơ chế gạo lứt
Trước khi tiến hành thủy phân gạo, gạo lứt cần được xử lý nhiệt để thuận tiện cho quá trình thủy phân, tạo mùi hương cho sản phẩm. Thông qua quá trình xử lí nhiệt, các chuỗi tinh bột bị dextrin hóa, tạo ra các mạch ngắn hơn, tạo điều kiện