3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic thích hợp cho quá trình lên men gạo lứt giàu kefiran men gạo lứt giàu kefiran
3.1.1. Phân lập và sơ tuyển chủng vi khuẩn lactic
Tiến hành thu thập các mẫu hạt kefir, các hạt kefir trong môi trường sữa tươi không đường được lọc, tách hạt, đem rửa nhẹ bằng nước cất, và tiến hành phân lập. Từ các mẫu hạt Kefir, tiến hành phân lập các chủng vi khuẩn lactic có trong hạt Kefir. Sử dụng môi trường MRS có bổ sung 0,5% CaCO3 để lựa chọn vi khuẩn lactic. Sau khi lựa chọn, các chủng lactic được tiến hành xác định tốc độ sinh trưởng trên môi trường MRS lỏng trong 24 giờ. Kết quả quá trình khảo sát của các chủng vi khuẩn lactic được thể hiện ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1 Hình thái khuẩn lạc, tế bào của các chủng vi khuẩn lactic
TT Kí hiệu Xuất xứ Hình thái khuẩn lạc
1 LK1 Nguyễn Phong
Sắc, Cầu Giấy
Khuẩn lạc tròn, trơn, trắng sữa. Tế bào hình que, kết đôi.
2 Đại La, Hai Bà
Trưng
Khuẩn lạc tròn, trơn, bóng, trắng sữa. Tế bào hình cầu, hơi dài kết đôi.
3 LK3 Nguyễn An
Ninh, Hai Bà Trưng
Khuẩn lạc tròn, lồi, trắng đục. Tế bào hình que, mảnh, đơn lẻ.
4 LK4 Hồng Hà, Hoàn
Kiếm
Khuẩn lạc tròn, trơn, trắng sữa. Tế bào hình que, xếp chuỗi dài.
5 LK5 Kim Đồng, Hai
Bà Trưng
Khuẩn lạc tròn, trơn, trắng sữa. Tế bào hình que, kết đôi.
6 LK6 Nguyễn Ngọc
Nại, Thanh Xuân
Khuẩn lạc tròn, trơn, bóng, trắng sữa. Tế bào hình que, ngắn đơn lẻ, kết đôi.
7 LK7 Nghĩa Tân, Cầu Giấy
Khuẩn lạc tròn, lồi, trắng đục. Tế bào hình que, mảnh, đơn lẻ.
8 LK8 Hoàng Hoa
Thám, Ba Đình
Khuẩn lạc tròn, trơn, trắng đục. Tế bào hình que, đơn lẻ, kết đôi.
9 LK9 Liễu Giai, Ba
Đình
Khuẩn lạc tròn, trơn, trắng sữa. Tế bào hình que, xếp chuỗi dài.
10 LK10 Xuân La, Tây
Hồ
Khuẩn lạc tròn, trơn, trắng sữa. Tế bào hình que, kết đôi.
11 LK11 Thụy Khuê, Tây Hồ
Khuẩn lạc tròn, lồi, trắng đục. Tế bào hình que, mảnh, đơn lẻ.
Cảnh, Cầu Giấy xếp chuỗi dài. 13 LK13 Tôn Đức Thắng,
Đống Đa
Khuẩn lạc tròn, trơn, trắng đục. Tế bào hình que, đơn lẻ, kết đôi.
14 LK14 Trần Khát Trân, Hai Bà Trưng
Khuẩn lạc tròn, trơn, trắng sữa. Tế bào hình que, xếp chuỗi dài.
15 LK15 Lý Nam Đế,
Hoàn Kiếm
Khuẩn lạc tròn, trơn, trắng sữa. Tế bào hình que, xếp chuỗi dài.
16 LK16 Mỗ Lao, Hà
Đông
Khuẩn lạc tròn, trơn, trắng sữa. Tế bào hình que, kết đôi.
17 LK17 Dương Nội, Hà Đông
Khuẩn lạc tròn, trơn, trắng sữa. Tế bào hình que, kết đôi.
18 LK18 Xuân Thủy, Cầu Giấy
Khuẩn lạc tròn, trơn, trắng đục. Tế bào hình que, đơn lẻ, kết đôi.
19 LK19 Tam Trinh,
Hoàng Mai
Khuẩn lạc tròn, trơn, trắng đục. Tế bào hình que, đơn lẻ, kết đôi.
20 LK20 Ngọc Hồi,
Hoàng Mai
Khuẩn lạc tròn, trơn, trắng sữa. Tế bào hình que, xếp chuỗi dài.
Tiến hành lên men 20 chủng vi khuẩn lactic đã phân lập trong môi trường MRS ở 30°C trong 48 giờ. Kết thúc lên men, ly tâm thu sinh khối tế bào và phần dịch trong. Đánh giá mức độ tạo sinh khối của mỗi chủng và xác định hàm lượng axit tổng số trong dịch lên men. Kết quả được trình bày trong Hình 3.1.
Hình 3.1. Khả năng tạo sinh khối và axit tổng số của các chủng vi khuẩn lactic
Kết quả cho thấy, trong 20 chủng vi khuẩn lactic được khảo sát, các chủng kí hiệu , LK2, LK6, LK7, LK10, LK18 cho nhiều sinh khối nhất (OD = 1,135- 1,153). Lượng axit tạo thành trong môi trường sau khi lên men ứng với 6 chủng trên dao
0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 LK1 LK2 LK3 LK4 LK5 LK6 LK7 LK8 LK9 LK10 LK11 LK12 LK13 LK14 LK15 LK16 LK17 LK18 LK19 LK20 Ký hiệu chủng OD (600nm) Axit tổng số (g/l)
động trong khoảng 1,15- 1,28 g/l. Các chủng vi khuẩn có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt, tạo sinh khối nhiều sẽ thích hợp cho sinh tổng hợp kefiran hơn các chủng còn lại.
3.1.2. Lựa chọn chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp kefiran cao
Tiếp tục khảo sát khả năng sinh tổng hợp exopolysaccharide của 6 chủng lựa chọn trong môi trường dịch gạo lứt 5°Bx (có bổ sung 1% peptone, 0,5% cao nấm men) ở 30°C trong 48 giờ. Dịch gạo lứt sau khi lên men được xác định pH và hàm lượng kefiran.
Hình 3.2. Khả năng tạo kefiran của các chủng lactic
Kết quả cho thấy, trong môi trường dịch thủy phân gạo lứt, 6 chủng lựa chọn đều có khả năng sinh tổng hợp kefiran. Trong đó, chủng sản sinh ra lượng kefiran nhiều nhất (đạt 2,76 g/l). Các chủng còn lại có lượng kefiran dao động từ 1,81- 2,16 g/l. pH môi trường sau lên men từ các chủng khác nhau đều tương đương nhau (pH = 4,4). Như vậy, chủng LK2 được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2. Định danh chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn được
Đặc điểm hình thái và trình tự gen 16S rRNA của chủng LK2 được thể hiện trong hình 3.3 và hình 3.4. 4.32 4.34 4.36 4.38 4.4 4.42 4.44 4.46 4.48 4.5 4.52 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 LK2 LK6 LK7 LK10 LK12 LK18 g/l Kí hiệu chủng pH Hàm lượng kefiran (g/l)
a. Hình thái khuẩn lạc (trên môi trường MRS)
b. Hình thái tế bào (dưới kính hiển vi ×100)
Hình 3.3. Hình thái của chủng
Cây phát sinh chủng loại dựa vào trình tự 16S rRNA chỉ ra mối liên hệ giữa chủng LK2 và các loài gần gũi trong chi Leuconostoc. Trình tự 16S rRNA của
chủng tương đồng 100% với trình tự 16S rRNA của Leuconostoc mesenteroides
ATCC 8293 (T). Dựa trên các đặc điểm của chủng cũng như kết quả phân tích gen, có thể xếp chủng vào loài Leuconostoc mesenteroides. Kết quả này cũng thống nhất với báo cáo danh sách tên các chủng vi khuẩn lactic được tìm thấy trong hạt kefir đã được công bố.
Hình 3.4. Vị trí phân loại của chủng với các loài có quan hệ họ hàng gần trong chi Leuconostoc dựa vào trình tự gen rRNA 16S
3.3. Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất bột gạo lứt lên men lactic giàu kefiran kefiran
3.3.1. Sơ chế gạo lứt
Trước khi tiến hành thủy phân gạo, gạo lứt cần được xử lý nhiệt để thuận tiện cho quá trình thủy phân, tạo mùi hương cho sản phẩm. Thông qua quá trình xử lí nhiệt, các chuỗi tinh bột bị dextrin hóa, tạo ra các mạch ngắn hơn, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình thủy phân bằng enzyme. Qua đó chúng tôi tiến hành rang gạo lứt ở các nhiệt độ khác nhau từ 135oC – 195oC trong cùng khoảng thời gian là 30 phút. Sau khi rang, các mẫu được tiến hành thủy phân và đánh giá cảm quan, hiệu suất thủy phân trong cùng điều kiện. Quá trình thủy phân được tiến hành như mục 3.8. Kết quả được thể hiện trong Bảng 3.2.
Leuconostoc gelidum subsp. gelidum KCTC 3527 Leuconostoc gelidum subsp. aenigmaticum POUF4d Leuconostoc gelidum subsp. gasicomitatum LMG 18811
Leuconostoc inhae IH003
Leuconostoc carnosum NRIC 1722 Leuconostoc miyukkimchii M2
Leuconostoc rapi LMG 27676 Leuconostoc kimchii IMSNU 11154
Leuconostoc palmae TMW 2.694 Leuconostoc lactis JCM 6123 Leuconostoc holzapfelii BFE 7000
Leuconostoc citreum ATCC 49370 Leuconostoc pseudomesenteroides NRIC 1777
Leuconostoc mesenteroides subsp. jonggajibkimchii DRC1506 Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum DSM 20484 Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides ATCC 8293 LK2
Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris ATCC 19254 Leuconostoc suionicum DSM 20241
Pseudomonas putida ATCC 12633
99 65 99 84 84 56 43 46 33 73 73 95 65 62 0.020
Hình 3.5 Gạo lứt sau khi được rang tại các nhiệt độ khác nhau
Bảng 3.2 Đánh giá cảm quan gạo lứt rang và hiệu suất thủy phân trong cùng điều kiện
Nhiệt độ rang Hiệu suất
thủy phân Cảm quan
135°C 78% Gạo sống lõi, chưa có mùi thơm 145°C 82% Gạo chưa chín hết, chưa có mùi thơm 155°C 83% Gạo chín, chưa thơm
165°C 89% Gạo chín, có mùi thơm đặc trưng của gạo rang
175°C 91% Gạo chín, có mùi thơm đặc trưng của gạo rang, bắt đầu có mùi cháy
185°C 85% Gạo bắt đầu bị cháy, đã có mùi khét
Bảng 3.2 cho thấy, nhiệt độ thích hợp cho quá trình rang gạo lứt là 165°C trong khoảng thời gian 30 phút. Gạo lứt rang trong điều kiện này cho kết quả cảm quan
gạo rang. Gạo rang trong điều kiện này chín đều, thời gian rang không bị kéo dài và nhiệt độ rang không quá cao, như vậy sẽ không gây phân hủy các hợp chất trong gạo lứt.
3.3.2. Nghiên cứu điều kiện nhân giống sinh khối thích hợp
3.3.2.1. Lựa chọn môi trường nhân giống
Do quá trình lên men được thực hiện trên môi trường là dịch gạo lứt thủy phân, có nhiều điều kiện khác so với các môi trường cơ bản, và nguồn gốc của chủng giống là từ nấm sữa kefir được nuôi trên môi trường với nguồn dinh dưỡng là từ sữa động vật. Nên việc thích ứng của các chủng giống với môi trường lên men có đặc tính mới là rất quan trong cho quá trình lên men sau này. Nếu chủng giống có sự phát triển tốt trên môi trường cơ bản mà không có sự thích ứng với môi trường mới, quá trình lên men trên môi trường mới sẽ không đạt hiệu quả cao. Vì vậy việc khảo sát môi trường nhân giống là rất cần thiết và quan trọng để quá trình lên men đạt hiệu quả cao nhất. Sử dụng chủng LK2 cho các thí nghiệm tiếp theo. Chủng LK2 được nhân giống cấp 1 trên môi trường MRS lỏng, cơ bản. Điều kiện nhân giống tại nhiệt độ 30oC trong khoảng 24 giờ. Khi tỉ lệ giống đạt 109 tế bào/ml sẽ được sử dụng làm nguồn giống cho quá trình nhân giống cấp 2.
Để tiến hành khảo sát môi trường nhân giống cấp 2 phù hợp với điều kiện lên men lactic giàu kefiran, các môi trường được thử nghiệm cho quá trình nhân giống cấp 2 là RYG, RYP, RYGP và đối chứng với môi trường MRS cơ bản. Thành phần môi trường nhân giống cấp 2 được thể hiện trong Bảng 3.3.
Các môi trường nhân giống được pha chế, thanh trùng, và đưa về nhiệt độ 30°C trước khi bổ sung giống từ môi trường cấp 1. Lượng giống bổ sung là 5% (theo thể tích, lượng giống quy về 109 tế bào/ml. Các môi trường được nuôi trong cùng điều kiện là 30°C trong 24 giờ. Tiến hành đánh giá sự phát triển sinh khối của chủng giống và chọn môi trường phù hợp cho quá trình nhân giống cấp 2. Kết quả đánh giá sự phát triển sinh khối của chủng giống trên các môi trường được thể hiện trong Hình 3.6.
Bảng 3.3. Thành phần môi trường khảo sát nhân giống cấp 2
Thành phần môi trường nhân giống cấp 2 Tên môi trường
RYG RYP RYGP MRS
Dịch gạo lứt thủy phân (°Bx) 1 1 1 -
Glucose (g/l) 10 - 10 20 Cao nấm men (g/l) 10 10 10 5 Peptone (g/l) - 2 2 10 Cao thịt (g/l) - - - 10 Triamonium citrate (g/l) - - - 2 K2HPO4(g/l) 2 2 2 2 CH3COONa (g/l) - - - 5 Tween 80 (g/l) 1 1 1 1 MgSO4(g/l) 0,2 0,2 0,2 0,2 MnSO4 (g/l) - - - 0,05 pH 6,0 6,0 6,0 6,0
Hình 3.6. Khả năng sinh trưởng của chủng trên các môi trường nhân giống khác nhau
Từ kết quả Hình 3.6 cho thấy, các môi trường nhân giống MRS và RYGP cho kết quả tương đương nhau và cao nhất trong các môi trường. Nhằm tạo điều kiện
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 0 2 4 6 8 10 12 14
MRS (1) RYG (2) RYP (3) RYGP (4)
g/l
Mật độ tế bào (x10^8) Kefiran g/l
thuận lợi nhất cho quá trình lên men, cũng như việc tạo điều kiện cho chủng giống thích ứng với môi trường lên men, môi trường RYGP được sử dụng cho quá trình nhân giống cấp 2.
3.3.2.2. Khảo sát thời gian và nhiệt độ nhân giống
Sự sinh trưởng và phát triển của các chủng vi sinh vật trong quá trình lên men được diễn ra theo một chu kỳ nhất định. Giai đoạn đầu của quá trình lên men là sự thích nghi của các chủng vi sinh vật trong môi trường. Thời gian càng kéo dài hàm lượng sinh khối vi sinh vật càng tăng. Tuy nhiên sau một thời gian lên men nhất định, khi lượng cơ chất trong môi trường dần cạn kiệt, tế bào vi sinh vật bị phân rã do tác động của enzyme trong canh trường là nguyên nhân khiến hàm lượng sinh khối bị giảm. Vì vậy, để thu được hàm lượng sinh khối lớn nhất cần xác định được thời gian lên men hiệu quả.
Trong quá trình lên men với quy mô lớn, việc chia quá trình nhân giống thành nhiều cấp sẽ đảm bảo cho tỉ lệ giống được ổn định. Nếu nhân giống một lần thì lượng giống khởi đầu là rất lớn, hoặc nếu chia quá trình nhân giống thành quá nhiều cấp sẽ dẫn đến già giống, không đảm bảo cho quá trình sinh trưởng của giống khi tiến hành lên men. Vì vậy, tùy thuộc vào quy mô lên men mà tiến hành chia việc nhân giống thành các cấp cho phù hợp.
Chất lượng giống ảnh hưởng rất lớn đến quá trình lên men, vì vậy các quá trình nhân giống cần được thực hiện trong các điều kiện thích hợp nhất. Thời gian và nhiệt độ trong quá trình nhân giống có ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng giống. Nếu nhiệt độ nhân giống không thích hợp với chủng giống thì quá trình phát triển sinh khối của giống không tốt, không đảm bảo mật độ giống ban đầu cho quá trình lên men. Về thời gian nhân giống, nếu thời gian nhân giống không được tối ưu, quá ngắn hoặc quá dài, sẽ dẫn đến mật độ giống không đảm bảo hoặc giống quá già, không đảm bảo cho quá trình lên men sau này. Vì vậy, quá trình khảo sát được thực hiện trên dải nhiệt độ từ 25°C- 38°C, thời gian khảo sát đến 28 giờ. Kết quả của quá trình khảo sát được thể hiện trong Hình 3.7.
Hình 3.7. Khảo sát nhiệt độ và thời gian nhân giống trên môi trường RYGP của chủng
Dựa vào kết quả Hình 3.7, điều kiện nhân giống thích hợp nhất là trong khoảng từ 30°C - 32°C trong khoảng thời gian 22 giờ. Tại điều kiện này, mật độ giống là tốt nhất đạt 15,98 ×108 tế bào/ml, hàm lượng kefian được sinh ra trong thời gian này cũng là cao nhất.
3.3.2.3. Khảo sát mật độ giống bổ sung vào môi trường lên men
Tỉ lệ giống bổ sung cho quá trình lên men cũng là một trong các yếu tố ảnh hưởng lớn tới quá trình lên men. Nếu lượng giống bổ sung thấp, thời gian lên men sẽ bị kéo dài, ảnh hưởng tới hiệu quả kinh tế, nếu lượng giống bổ sung ban đầu quá nhiều, tỉ lệ dinh dưỡng trong môi trường so với mật độ giống thấp, dẫn tới cạnh tranh dinh dưỡng sẽ xảy trong quá trình lên men. Điều này cũng ảnh hưởng tới hiệu suất của quá trình lên men, ngoài ra sẽ tốn một lượng giống nhiều hơn mức bình thường. Vì vậy, việc khảo sát lượng giống bổ sung ban đầu là cần thiết. Môi trường lên men cơ bản được sử lý trước khi tiến hành lên men. Mật độ giống được khảo sát từ 2% - 10%. Môi trường lên men được đặt trong điều kiện là 32oC. Tiến hành khảo sát trong khoảng thời gian là 24 giờ, xác định các thông số về mật độ tế bào, lượng kefiran sinh ra. Kết quả của quá trình thể hiện trong Hình 3.8.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 8 12 16 18 20 21 22 23 24 M ật đ ộ tế b ào ( 10 8 tế b ào/m l)
Thời gian nuôi cấy (giờ)
25°C 28°C 30°C 32°C 35°C 38°C
Hình 3.8. Khảo sát tỉ lệ tiếp giống vào môi trường lên men
Kết quả Hình 3.8 cho thấy, với tỉ lệ giống bổ sung là 2% mật độ giống không cao bằng các nồng độ khảo sát khác, thời gian giống phát triển đến cực điểm cũng bị kéo dài. Trong khi đó, với các nồng độ giống bổ sung là 8% và 10% ban đầu có sự phát triển nhanh nhưng cũng nhanh chóng đi vào pha cân bằng và suy giảm mật độ sau đó. Tỉ lệ giống bổ sung là 6% cho kết quả tốt nhất. Mật độ tế bào là cao nhất tại thời điểm 22 giờ kể từ thời điểm bổ sung giống. Hàm lượng kefiran sinh ra trong quá trình nhân giống cũng là cao nhất đạt 0,636 g/l.