Sữa được lên men chủ yếu là khu hệ vi khuẩn lactic và men sữa (Kefir). Dưới tác động của nhóm vi sinh vật này, đường lactose của sữa sẽ được chuyển hóa thành axit lactic và một lượng nhỏ rượu ethanol (nếu sử dụng men sữa). Còn protein trong sữa thì bị pepton hóa, sau đó chuyển thành các amino axit – những sản phẩm dễ tiêu hóa [23].
Thành phần môi trường có ảnh hưởng đến hình dạng tế bào (thường ở dạng hình cầu, hình que). Trong môi trường có hàm lượng rượu cao làm tế bào dài ra. Rượu etylic còn có tác dụng kìm hãm sự phân chia tế bào mạnh hơn so với sự sinh trưởng của vi khuẩn. Vi khuẩn lactic là thể kị khí, nhưng ở điều kiện hiếu khí chúng
vẫn sống và hoạt động kém [31][32]. Một số vi khuẩn lactic điển hình ảnh hưởng đến quá trình lên men ở sữa:
Giống Streptocucus lactis có tế bào hình tròn hoặc hình ovan đường kính
khoảng 0.5- 1 µm, sắp xếp riêng biệt, cặp đôi hoặc thành chuỗi dài. Vi khuẩn này phát triển tốt trong môi trường sữa và một số môi trường pha chế từ sữa, trong khi lại phát triển kém trong môi trường nước thịt pepone. Đây là loại vi khuẩn hiếu khí tùy tiện nên có thể phát triển sâu trong thạch và cho khuẩn lạc hình cây có nhánh. Đặc điểm sinh hóa quan trọng là lên men glucose, lactose, maltose, galactose, dextrin, không lên men saccharose. Vì vậy, Streptococus lactis đóng vai trò quan trọng trong công việc chế biến sữa chua. Phát triển tốt ở nhiệt độ 30°C - 35°C, ở nhiệt độ này vi khuẩn gây đông tụ sữa chua 10- 12 giờ, độ axit giới hạn do
Streptococus lactis tạo nên thường dao động trong khoảng 110 - 120°T, mặc dù có
những chủng yếu chỉ tạo khoảng 90- 100°T. Sữa được lên men chua bởi
Streptococus lactis luôn có hương vị đặc trưng của sản phẩm sữa chua.
Giống Betabacteriu phát triển trên môi trường thạch tạo những khuẩn lạc giống như khuẩn lạc trực khuẩn lactic ưa nhiệt. Khi phát triển trong sữa, vi khuẩn này cho ít axit, nếu cho dịch tự phân nấm men vào môi trường, vi khuẩn này phát triển hẳn lên, đường sữa bị lên men vởi vi khuẩn này không chỉ tạo thành axit lactic mà còn tạo nhiều axit dễ bay hơi. Trong sữa thường có hai loại chính là Betabacterium causasium và Betabacterium breve.
Giống Leuconostoc là nhóm gồm những vi khuẩn lên men lactic điển hình.
Chúng có dạng hình cầu đường kính từ 0.5- 0.8 µm và chiều dài khoảng 1.6 µm, nhưng trong môi trường axit chúng chọn ở hai đầu và dài ra sinh ra lượng axit có hạn vì thế không làm đông tụ sữa. Trái lại, chúng hình thành từ các đường, acetyl metyl cacbonyl hoặc acetoin làm cho bơ thơm. Loại vi khuẩn điển hình này là
Leuconostoc citrovosium được ứng dụng trong sản xuất bơ.
Giống Lactobacillus có dạng hình que. Đây là loại vi khuẩn lactic phổ biến
Chẳng hạn Lactobacillus plantarum có hình dạnh que kích thước từ 0.7- 1.1 µm đến 3- 8 µm, sắp xếp thành chuỗi hoặc đứng riêng lẻ (Pederson, 1936), trong khi
Lactobacillus casei có dạng hình que ngắn hoặc hình que dài, tế bào hình que mảnh,
đôi khi hơi cong, sắp xếp thành cặp hay chuỗi.
Tất cả sự khác nhau về hình thái tế bào này phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy. Chiều dài tế bào thay đổi phụ thuộc rất lớn vào thành phần môi trường nuôi cấy, sự có mặt của oxy cũng như điều kiện nuôi cấy.
1.4. Exoplolysaccharide và những hiểu biết chung về Kefiran 1.4.1. Exopolysaccharide
Exopolysaccharide là một polymer có phân tử lượng lớn bao gồm các gốc đường, được tiết ra môi trường xung quanh trong quá trình trao đổi chất của vi sinh vật. Chúng tổng hợp một phổ rộng các polysaccharite đa chức năng bao gồm các polysaccharite nội bào, polysaccharide cấu trúc và polysaccharide ngoại bào hoặc exopolysaccharide (EPS) [28], [32].
Exopolysaccharide nói chung bao gồm các monosaccharide và một số nhóm các carbonhydrate (như acetate, pyruvate, succunate và phosphate) [27]. Với những đặc tính đa dạng bởi sự kết hợp khác nhau giữa các gốc đường, exopolysaccharite đã được ứng dụng nhiều trong ngành công nghiệp thực phẩm và các ngành công nghiệp khác. Các sản phẩm EPS do vi khuẩn tổng hợp qua quá trình đồng hóa có trạng thái dạng gôm keo hiện nay đang được đưa vào sử dụng trong kỹ thuật làm biofilm. Việc tìm ra ngày càng nhiều hơn, phát triển mạnh hơn các sản phẩm có nguồn gốc từ EPS vi khuẩn đang trở thành cấp thiết đối với nhiều ngành công nghiệp mới.
1.4.2. Chức năng và các dạng đặc trưng của EPS
Những lợi ích mà EPS do vi khuẩn lactic dản sinh ra đã được thừa nhận và chứng minh là tốt cho sức khỏe đối tượng sử dụng. Tác dụng rõ rệt của EPS thể
hiện qua việc tạo thành một lớp vỏ bao bọc bên ngoài chống lại khả năng xâm nhiễm và sinh bệnh của vi khuẩn.
Bảng 1.6. Danh sách các exopolysaccharide [22]
TT Tên các exopolysaccharite Tên chủng vi sinh vật
1 Acetan Acetobacter xylium
2 Alginate Azotobacter vinelandii
3 Cellulose Acetobacter xylinum
4 Chitosan Mucorales spp
5 Curdlan Alcaligenes faecalis và Myxogenes
6 Cyclosophorans Agrobacterium spp, Rhizobium spp và Xanthomonas spp
7 Dextran Leuconostoc mesenteroides,
Leuconostoc dextranicum
8 Emulsan Lactobacillus hilgardii
9 Galactoglucopolysaccharide Acinetobacter calcoaceticus, Achromobacter spp, Agrobacterium radiobacter, Pseudomonas marginalis, Rhizobium spp
10 Gellan 11 Glucuronan
12 N-acetyl-heparosan Aureomonas elodea và
Sphingomonas paucimobilis
13 Hyaluronic acid Sinorhizobium meliloti
14 Indican Escherichia coli
15 Kefiran Streptococcus equi, Lacobacillus
plantarum, Lactobacillus kefiranofacien
16 Lentinan Beijrinckia indica
17 Lavan Lactobacillus hilgardii
18 Pullulan Lentinus elodes
19 Scleroglucan Alcaligenes viscosus, Zymomonas
mobilis
20 Schizophyllan Aureobaidium pullulans
21 Schizophyllan Sclerotium rolfsii, Sclerotium
delfinii và Sclerotium glucanicum
22 Xanthan Schizophylum, Alcaligenes faecalis
myxogenes, Xanthomonas campestris, Alcaligenes spp
1.4.3. Tổng quan về kefiran
Kefiran hay exopolysacarit (EPS), còn được gọi là polysacarit ngoại bào, được định nghĩa là các polyme carbohydrate có thể được sản xuất bởi các vi sinh vật khác nhau [10]. Các biopolyme này được liên kết với các bề mặt tế bào ở dạng viên nang hoặc được tiết vào môi trường ngoại bào dưới dạng chất nhầy. Vi tảo và vi khuẩn tạo ra một lượng lớn EPS, trong khi nấm men và nấm tạo ra một lượng nhỏ. Một số vi sinh vật thông qua quá trình lên men có thể tạo ra EPS với số lượng để sử dụng ở quy mô công nghiệp, bao gồm curdlan, xanthan và dextrangums.
Exopolysacarit là có thể hòa tan trong nước có chuỗi dài hoặc phân nhánh gồm các monosacarit, chủ yếu là glucose, galactose, mannose và axit glucuronic hoặc các dẫn xuất của các loại đường này như rhamnose, theo các tỷ lệ khác nhau. Các chất sinh học này được sử dụng làm chất nhũ hóa, chất ổn định, chất tạo keo, chất kết dính, chất bôi trơn, chất keo tụ và chất làm đặc, và chúng cũng được sử dụng trong sản xuất huyền phù và màng [22], [32]. Những ứng dụng này dựa trên cấu trúc hóa học của các biopolymer.
Hình 1.1. Cấu trúc của kefiran
EPS có thể thu được trong quá trình lên men của hạt kefir hoặc một số chủng
Lactobacillus trong một số môi trường như: sữa bò, sữa dê, sữa đậu nành, dịch
galactose theo tỷ lệ 1,00: 0,43. Thành phần này được so sánh với thành phần monosacarit của polysacarit thu được từ kefir trong sữa bò, có tỷ lệ 1,00: 1,14 (glucose: galactose) [22].
Kefiran có nhiều tính chất, chức năng đặc biệt, nó có thể tạo thành gel ở nhiệt độ thấp, vì vậy nó được sử dụng làm chất keo trong các ứng dụng thực phẩm. Bên cạnh đó, các đặc tính chữa bệnh của kefiran như kháng nấm, kháng khuẩn, hoạt động chống oxy hóa, bảo vệ biểu mô và điều hòa miễn dịch đã thu hút sự chú ý như là một chất bảo quản thực phẩm tiềm năng. Do đó, việc sử dụng kefiran trong sản xuất màng bọc thực phẩm có tính chất cơ lý tốt, từ đó làm tăng thời hạn sử dụng, tăng chất lượng thực phẩm [26].
1.4.3.1. Ứng dụng của kefiran
Trong ngành công nghiệp thực phẩm, kefiran được sử dụng như một chất ổn định, chất phụ gia thực phẩm. Do các đặc tính đông tụ khi nhiệt độ thấp và có tính ổn định cao, kefiran cho thấy tiềm năng ứng dụng trong chế biến các món tráng miệng đông lạnh như kem. Kefiran cũng được ứng dụng làm phụ gia thực phẩm tự nhiên trong ngành làm bánh, vì nó có thể tạo ra các tính chất lưu biến tốt trong điều kiện chế biến bột [18], [26], [32].
Kefiran cũng là thành phần chính trong các chất tạo màng sinh học. Ghasemlou et al. (2011) đã nghiên cứu một màng ăn được mới chiết xuất từ kefiran, trong đó glycerol và sorbitol được sử dụng làm chất hóa dẻo. Theo kết quả của họ, kefiran đóng vai trò cơ bản trong những màng phim ăn được này thông qua tác nhân tạo màng [19] [32].
Hoạt động chống oxy hóa. Vì hoạt động chống oxy hóa của các chất chống oxy hóa là thông qua việc duy trì quá trình oxy hóa, chúng có thể bảo quản thực phẩm như các gốc tự do. Do đó, kefiran đã được sử dụng như một chất bổ sung chống oxy hóa tự nhiên, nhờ hoạt động chống oxy hóa, kháng khuẩn và chống ung thư của nó. Một trong những ứng dụng đáng chú ý khác của kefiran là sử dụng kết hợp chitosan và kefiran, làm màng tổng hợp, trong đánh giá hoạt tính chống oxy hóa và tính chất
cấu trúc (bao gồm cả tính chất cơ học, tính chất vật lý và tính thấm hơi nước). Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc bổ sung chitosan vào các màng này giúp cải thiện hoạt động chống oxy hóa, các tính năng vật lý, tính thấm hơi nước và tính chất quang học, bên cạnh việc tăng cường độ giãn dài khi đứt, độ bền kéo, biến dạng đâm và cường độ đâm thủng màng [22].
Kefiran có thể được sử dụng như một chất kháng khuẩn và làm lành vết thương, chống lại một số chủng gây bệnh có sức đề kháng cao. Các nghiên cứu gần đây về hoạt động kháng khuẩn của kefiran ở Staphylococcus aureus và chuột Wistar với
các tổn thương trên da đã cho thấy rằng cả hai đều cho thấy hoạt tính kháng khuẩn, chống viêm cao đối với tất cả các sinh vật [32]. Trong nghiên cứu này, hoạt tính kháng khuẩn cao nhất của kefiran đã được báo cáo chống lại Streptococcus pyogenes. Tương tự như vậy, các nghiên cứu cho thấy kefiran làm tăng hoạt tính
kháng nấm chống lại một số loài nấm sợi và hoạt động kháng khuẩn chống lại các loài vi khuẩn. Chức năng kháng khuẩn tuyệt vời của kefiran đã được báo cáo chống lại Fusarium graminearum CZ1 và Streptococcus faecalis KR6. Ngoài ra, do hoạt
động chống nấm của kefiran, nó đã ngăn chặn việc sản xuất aflatoxin B1 của
Aspergillus flavus AH3.
Hình 1.2. Cấu trúc của kefiran và kết nối tiểu cầu-kefiran được hiển thị bằng kính hiển vi quang học (Jenab et al., 2015)
a. Các tinh thể được làm từ kefiran và polysacarit
Kefiran cũng thu hút sự chú ý đáng kể như một vật liệu sinh học và y học mới, do tính tương thích sinh học và độ nhạy nước của nó. Người ta đã phát hiện ra rằng kefiran có thể có hiệu quả đối với quá trình chuyển hóa cholesterol, phòng ngừa một số bệnh ung thư và các hoạt động chống ung thư bằng cách uống. Kefiran cũng có thể được sử dụng để tăng sản xuất interferon từ các tế bào động vật. Xem xét các đặc tính chống tăng sinh của kefiran, kefiran được sản xuất trong ống nghiệm của L.
kefiranaciens đã trình bày hoạt động chống ung thư tốt chống lại nhiều tế bào ung
thư như ung thư cổ tử cung và tế bào gan.
1.4.3.2. Cơ chế sinh tổng hợp kefiran ở vi khuẩn lactic [32]
Về cơ bản, tùy thuộc vào thành phần của các đơn vị lặp lại và con đường sinh tổng hợp, EPS có thể được phân loại thành hai loại: homopolysacaride (HoPS) hoặc heteropolysacaride (HePS) (Hình 1.1) [32]. Khối lượng phân tử của HePS dao động từ 104 đến 106 Da, thường thấp hơn khối lượng phân tử trung bình của HoPS (lên tới khoảng 107 Da). Mức sản xuất HePS từ LAB thường thấp hơn so với HoPS. Ngoài ra, các vi sinh vật sản xuất không sử dụng EPS của vi khuẩn làm nguồn năng lượng.
Sinh tổng hợp EPS của vi khuẩn là một quá trình phức tạp bao gồm số lượng lớn enzyme và protein điều hòa. Về cơ bản, quá trình sinh tổng hợp EPS có thể được chia thành ba bước chính: thứ nhất, chất nền carbon được đồng hóa. Thứ hai, các polysacarit được tổng hợp vị trí nội bào và cuối cùng, chúng thoát ra khỏi tế bào. Sinh tổng hợp EPS trong LAB có bốn bước chính bắt đầu từ vận chuyển đường vào tế bào chất, tổng hợp đường-1-P, trùng hợp các đơn vị tiền chất và cuối cùng là vận chuyển EPS bên ngoài tế bào.
Tổng hợp Homopolysaccharide (HoPS) là một quá trình tương đối đơn giản. Một số đặc điểm của tổng hợp HoPS là ở đây: không có giai đoạn vận chuyển tích cực trong con đường tổng hợp, không tiêu tốn năng lượng và yêu cầu sinh tổng hợp các enzyme ngoại bào, các enzyme ngoại bào này được đặt tên là glycosyltransferase và fructosyltransferase (FTF hoặc fructansucrase).
Glycosyltransferase được gọi là GTF hoặc glycansucrase. Enzyme sử dụng glucose. Fructosyltransferase được gọi là FTF hoặc fructansucrase. Ngoài ra fructose được sử dụng bởi enzyme này. Đường được sử dụng làm chất cho glycosyl trong quá trình tổng hợp HoPS. [22]
Hình 1.3. Cơ chế sinh tổng hợp HoPS
Vận chuyển đường, tổng hợp nucleotide đường, đơn vị lặp lại tổng hợp và trùng hợp các đơn vị lặp lại được hình thành trong tế bào chất là bốn bước chính của quá trình tổng hợp Heteropolysaccharide (HePS) [32]. Cơ chế tổng hợp của Hee HePS phức tạp hơn. Trong quá trình này, các đơn vị nucleotide tiền chất như UDP- GalNac, GDP-fructose, dTDPrhamnose, UDP-galactose và UDP-glucose được tổng hợp nội bào từ glucose-1-phosphate và fructose-6-phosphate. Ngoài ra, một số enzyme và/ hoặc protein có liên quan đến quá trình sinh tổng hợp và bài tiết HePS. Các nucleotide đường có vai trò thiết yếu trong sinh tổng hợp HePS. Tầm quan trọng của các nucleotide đường, có nguồn gốc từ đường-1-P là: vai trò của chúng trong hoạt hóa đường (Kích hoạt đường là cần thiết cho phản ứng trùng hợp monosacarit, xen kẽ đường (epime hóa, khử carboxyl, khử hydrat hóa và vân vân). Cùng với các enzyme kích hoạt và biến đổi đường đóng một vai trò quan trọng trong việc hình thành các khối xây dựng và thành phần EPS cuối cùng. Sinh tổng hợp HePS là quá trình tiêu thụ năng lượng. Đây là một số bước mà năng lượng
phốt phát đường, cần một ATP khác để tổng hợp từng nucleotide và cần thêm một ATP nữa để phosphoryl hóa chất mang lipid C55 isoprenoid (Hình 1.3).
Hình 1.4. Sơ lược về sinh tổng hợp HePS.
1.4.4 Tình hình nghiên cứu, sản xuất Kefiran hiện nay.
Hiện nay, kefiran là dòng sản phẩm chức năng mới được sử dụng thông dụng tại Nhật Bản, Mỹ, Hàn Quốc, dưới dạng bột, viên nén, dạng sệt…, có tác dụng điều hòa glucose trong máu, điều hòa huyết áp, kháng vi sinh, nâng cao chức năng miễn dịch cũng như chức năng gan [18], [26], [27], [30]. Kefiran đã được nhập khẩu vào Việt Nam, được sử dụng như thực phẩm chức năng hoặc thực phẩm thực dưỡng.
Thông thường, các sản phẩm kefiran thường được sản xuất từ nguyên liệu là sữa tươi từ động vật hoặc từ môi trường tổng hợp. Điều đó dẫn đến việc chi phí cho nguồn nguyên liệu cao, nhiều người có khả năng dị ứng với nguồn lactose từ sữa hoặc không sử dụng sản phẩm từ động vật không thể tiếp cận đến sản phẩm. Vì vậy, việc đánh giá, khảo sát quá trình lên men lactic giàu kefiran từ gạo lứt để tạo sản phẩm giàu kefiran có nguồn gốc từ các loại hạt giúp đa dạng đối tượng có thể tiếp cận sản phẩm. Việc sử dụng dịch gạo lứt thủy phân cho quá trình lên men cũng đáp ứng được một phần về mặt dinh dưỡng cho vi khuẩn lactic phát triển. Ngoài ra,
nguồn nguyên liệu là gạo lứt cũng được đánh giá là phổ biến và rẻ hơn nguồn dinh dưỡng là sữa. Bên cạnh đó cũng tận dụng được nguồn nguyên liệu, đa dạng hóa sản phẩm từ gạo lứt của Việt Nam.
Đối với sản phẩm bột gạo lứt lên men lactic đã có một số nghiên cứu của các nhóm tác giả quan tâm tới khả năng lên men lactic của vi khuẩn lactic trên môi