Theo đông y, hoa hòe có vị đắng, tính bình (còn quả vị đắng tính hàn). Do có nhiều tác dụng sinh học và dược lý, từ lâu hoa hoè đã được sử dụng làm thuốc. Mọi bộ phận của cây, đặc biệt là hoa quả khô, hoa và chồi có giá trị rất lớn trong y học. Trong dân gian, hoa hòe được dùng làm thuốc cầm máu cho các bệnh đổ máu cam, ho ra máu, ruột chảy máu, tiểu tiện ra máu với liều lượng từ 5-20g mỗi ngày ở dạng thuốc sắc.
Dựa trên bằng chứng về việc sử dụng phổ biến hoa hòe trong dân gian, các nhà khoa học đã tiến hành các nghiên cứu lâm sàng hiện đại để xác định các hoạt tính sinh học này. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các flavonoid và isoflavonoid chi phối hoạt tính sinh học chính của S. japonica, như kháng viêm, kháng khuẩn, kháng virus, chống loãng xương, chống oxi hóa, triệt tiêu, hạ huyết áp, chống nôn, chống ung thư, và tác dụng cầm máu [22]. Tác dụng của dịch chiết hoặc hợp chất có hoạt tính sinh học được phân lập từ hoa hòe đã được thí nghiệm trên một số mô hình động vật cũng như nghiên cứu in vitro.
In vitro, dịch chiết ethanol của hoa hòe thể hiện hoạt tính chống viêm đáng kể bằng cơ chế ức chế sản xuất NO và TNF-α trong mô hình đại thực bào RAW 264,7 với giá trị IC50 lần lượt là 0,06 và 0,18 mg/ml [64]. Dịch chiết trong ethyl acetate thể hiện hoạt tính kháng khuẩn E. coli và K. pneumoniae với giá trị ức chế tối thiểu (MIC) lần
lượt là 125 và 120 µg/ml. Đồng thời dịch chiết ethyl acetate còn thể hiện hoạt tính chống oxi hóa mạnh và khả năng quét gốc tự do mạnh nhất với RC50=3,13 µg/ml [38].
Loãng xương là một căn bệnh do thiếu hormone, đặc biệt là ở phụ nữ mãn kinh. Nghiên cứu in vivo chỉ ra rằng, dịch chiết nước nóng của hoa hòe với liều dùng 0,556 g/kg/ngày trong 8 tuần đã cải thiện tăng diện tích xương thắt lưng của chột OVX [55].
Wang và cộng sự đã chứng minh rằng sử dụng flavonoids từ hoa hòe theo đường uống với liều 40, 80 và 120 mg/kg mỗi ngày trong 6 tuần có thể giảm cholesterol tổng số, triglyceride và lipoprotein tỉ trọng thấp (LDL-C) và tăng lipoprotein tỉ trọng cao (HDL-C) trong máu ở những con chuột có hàm lượng mỡ máu cao [59].
Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.Nguyên liệu
2.1.1. Mẫu thực vật
Nụ hoa hòe khô (Sophora japonica L.) được công ty Tochimoko, Osaka, Nhật Bản cung cấp.
2.1.2. Mẫu peptide
β-amyloid protein 1-42 được đặt từ công ty Sigma-Aldrich, Mỹ.
2.2. Hóa chất
Các loại hóa chất, dung môi sử dụng cho tách chiết mẫu: n-hexane, ethyl acetate, ethanol, methanol, axit acetic (WAKO, Nhật Bản).
Thuốc nhuộm peptide Thioflavin T (Sigma-Aldrich Mỹ)
Các chất chuẩn: Quercetin (WAKO, Nhật Bản), Rutin (WAKO, Nhật Bản), Neohesperidin (WAKO, Nhật Bản), Quercetin chuẩn (Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương, Việt Nam), Rutin (Trung Quốc).
Các muối Na2HPO4, NaH2PO4, NaCl được cung cấp bởi Merck, Đức. Các hoá chất còn lại đảm bảo độ tinh khiết cho phân tích.
2.3. Thiết bị thí nghiệm
2.3.1. Thiết bị tách chiết và xác định hợp chất
Máy cô quay chân không (Eyela, Nhật Bản) Máy đo pH (Horiba, Nhật Bản)
Tủy sấy (Memmert, Đức) Máy vortex (Ika, Đức)
Cân phân tích (Shimadzu, Nhật Bản) Cột chạy sắc kýNhật Bản)
Đèn tử ngoại hai bước sóng 245 nm và 368 nm (Trung Quốc)
Thiết bị cộng hưởng từ hạt nhân có độ phân giải siêu cao (JEOL, Nhật Bản) Thiết bị cộng hưởng từ hạt nhân bán rắn JNM-ECA50 (JEOL, Nhật Bản)
Thiết bị đo phổ khối lượng LTQ-Orbitrap XL (ThermoFisher Scientific, Mỹ)
2.3.2. Thiết bị đánh giá khả năng bắt gốc tự do và giảm sự tích tụ peptide β-amyloid amyloid
Máy đọc tín hiệu huỳnh quang Máy đo UV/VIS (Bionate, Anh)
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp tách chiết
Nguyên lý: Chiết xuất là phương pháp sử dụng dung môi để lấy các chất tan ra khỏi các mô thực vật. Sản phẩm thu được của quá trình chiết xuất là một dung dịch của các chất hòa tan trong dung môi. Các hợp chất chuyển hóa thứ cấp trong thực vật có độ phân cực khác nhau, vì vậy dung môi dùng cho các quá trình chiết được lựa chọn với các đặc điểm là dễ thấm vào dược liệu, hòa tan chọn lọc (hòa tan nhiều hoạt chất, ít tạp chất), dễ dàng bay hơi khi cần cô đặc dịch chiết và có tính trơ về mặt hóa học. Về nguyên tắc, để chiết được các chất phân cực (Flavonoids, alkaloids, glycoside…) thì phải sử dụng các dung môi phân cực. Qua khảo sát một số dung môi có độ phân cực tăng dần bao gồm n-hexane, ethyl actate, ethanol, methanol, dung môi methanol được chọn làm dung môi chiết do đáp ứng đầy đủ các yêu cầu nêu trên.
Mục đích: Tách chiết, thu các thành phần chính từ nụ hoa hòe khô bằng phương pháp ngâm chiết. Với mục đích này, chúng tôi không tiến hành nghiền nhỏ nụ hoa hòe để tránh việc thu quá nhiều tạp chất trong quá trình chiết.
Quy trình:
10 g nụ hoa hòe khô được ngâm chiết trong bình tam giác với 100 ml dung môi methanol, tỉ lệ mẫu/dung môi là 1:10 (đảm bảo khả năng chiết các hợp chất chính) trong 24 giờ, thỉnh thoảng lắc đều để tăng sự khuếch tán.
Lọc thu dịch chiết bằng giấy lọc Whatman và phễu lọc, loại bỏ bã, thu được dịch chiết methanol nụ hoa hòe khô.
Cất quay dung môi methanol có trong dịch chiết với hệ thống cô quay chân không Eyela – Nhật Bản, nhiệt độ 70oC, tốc độ quay 400 vòng/phút cho đến khi thu được cao khô. Làm khô cao bằng khí N2 lỏng. Lưu trữ cao khô này trong bình thủy tinh ở 4oC.
Đánh giá kết quả: Tiến hành cân khối lượng cao khô thu được, so sánh với khối lượng nụ hoa hòe khô mang đi chiết xuất thu được tỉ lệ cao khô/nguyên liệu.
2.4.2. Phương pháp sắc ký bản mỏng
Nguyên tắc: Sắc ký bản mỏng (Thin layer chromatography - TLC) là kỹ thuật sắc ký được dùng để tách các chất trong hỗn hợp. Phương pháp sắc ký bản mỏng bao gồm pha tĩnh là một lớp mỏng các chất hấp phụ, thường là silica gel, aluminium oxit hoặc cellulose được phủ trên một mặt phẳng chất trơ. Pha động là hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn theo tỉ lệ thích hợp. Trong quá trình di chuyển các chất trong mẫu thử được di chuyển qua lớp mỏng, theo chiều của pha động, tuy nhiên di chuyển với tốc độ khác nhau. Sau quá trình ta thu được một sắc ký đồ bản mỏng. Cơ chế của sự chia tách là hấp thụ, phân bố trao đổi ion, sàng lọc phân tử, hay sự phối hợp của nhiều cơ chế tùy vào tính chất của pha tĩnh và dung môi của pha động.
Mục đích: Dựa vào sự phân tách khác nhau của các chất trên bản TLC, xác định số lượng các hợp chất có trong dịch chiết. Đồng thời, định hướng xác định nhóm hợp chất dựa vào màu sắc quan sát được dưới bước sóng 365 nm, cũng như màu sắc các hợp chất khi sử dụng thuốc thử Vanillin và AlCl3,
Quy trình:
Sử dụng ống mao quản, chuyển dịch chiết methanol lên bề mặt bản silica gel kích thước 36 cm. Cố định độ dài đường chạy trên bản silica gel là 4,5 cm. Chuẩn bị 5 ml hỗn hợp dung môi khai triển, ổn định trong bình khai triển trước
30 phút để đảm bảo bão hòa dung môi. Hỗn hợp bao gồm ethyl acetate/axit acetic/ethanol với tỉ lệ 4/1/1,
Đặt bản silica gel vào bình khai triển, đậy nắp, đợi đến khi dung môi chạy hết độ dài đường chạy thì lấy bản silica gel ra, để khô.
Quan sát các băng chất trên bản silica gel trong điều kiện thường, dưới bước sóng dài 365 nm, sau khi phun thuốc thử Vaniline và thuốc thử AlCl3.
Đánh giá kết quả: Xác định hệ số di chuyển - giá trị Rf của từng chất dựa vào tỉ lệ độ dài đường chạy của chất với độ dài đường chạy của dung môi. Từ giá trị Rf xác định được, so sánh với giá trị Rf của các chất chuẩn Quercetin và Rutin.
Xác định nhóm chức có thể có trong các hợp chất dựa vào màu sắc khi quan sát được dưới các điều kiện: ánh sáng thường, bước sóng 365 nm, sau khi phun thuốc thử.
2.4.3. Phương pháp sắc ký cột
Nguyên tắc: Sắc ký cột là phương pháp sắc ký được sử dụng để phân lập một hợp chất hóa học đơn lẻ từ hỗn hợp dựa trên sự hấp phụ khác nhau. Các hợp chất di chuyển qua cột với tốc độ khác nhau, cho phép chúng được tách thành các phân đoạn. Tương tự sắc ký bản mỏng, sắc ký cột bao gồm pha động và và pha tĩnh. Pha tĩnh là các loại chất hấp phụ khác nhau (thường là silica gel SiO2 hoặc alumina Al2O3) được nhồi vào cột thủy tinh thẳng đứng, pha động – dạng lỏng, được rót vào từ trên đỉnh cột và chảy xuống dưới cột nhờ tác dụng của trọng lực hoặc của áp suất bên ngoài, là hệ các dung môi dùng để rửa giải (hình 2.1). Kỹ thuật này được áp dụng rộng rãi vì tính đa dạng của chất hấp phụ (pha thường, pha đảo) và các loại dung môi. Ưu điểm chính của sắt ký cột là chi phí tương đối thấp và dễ thao tác.
Hình 2.1. Sơ đồ minh họa cột sắc ký
Mục đích: Tách hỗn hợp cao chiết methanol thành các phân đoạn khác nhau trong các hệ dung môi, tiến hành tinh sạch để thu được các hợp chất.
Quy trình:
Chuẩn bị hệ dung môi để chạy cột, thể tích mỗi hệ là 200 ml, bao gồm: Hệ dung môi 1: n- hexane/ethyl acetate với tỉ lệ 5/5 Hệ dung môi 2: n-hexane/ethyl acetate với tỉ lệ 2/8 Hệ dung môi 3: ethyl acetate 100%
Hệ dung môi 4: ethyl acetate/ethanol với tỉ lệ 5/5 Hệ dung môi 5: ethanol 100%
Hệ dung môi 6: ethanol/nước với tỉ lệ 8/2
Tiến hành nhồi cột ướt, rót hỗn hợp silica gel và dung môi vào cột. Mở van tháo dung môi với tốc độ chảy nhỏ để dung môi thoát ra khỏi cột, tránh bị tràn. Kích thước cột sử dụng: chiều dài 60 cm, đường kính trong 3 cm.
Vừa nhồi vừa gõ nhẹ cột để bọt khí thoát ra ngoài và silica lắng xuống. Tiếp tục đổ hỗn hợp vào cột cho đến khi tất cả lượng silica gel đã hết.
Rửa thành cột bằng dung môi và mở van tháo dung môi đến khi mức dung môi cách bề mặt silica 2cm thì dừng lại.
Thêm 1 lớp cát mỏng để ổn định bề mặt silica gel.
Thêm 0,6g cao khô và bắt đầu chạy cột với hệ dung môi 1, tốc độ 45 giọt/phút. Khi hệ dung môi 1 gần hết (còn cách mặt phẳng cát khoảng 3 cm) thì tiếp tục
thêm hệ dung môi 2, Lặp lại bước này cho đến khi hết các hệ dung môi.
Đánh giá kết quả: Dựa vào màu sắc và thể tích dung môi đểthu các phân đoạn
khác nhau, sử dụng sắc ký bản mỏng để xác định số lượng các chất trong phân đoạn, đồng thời so sánh với giá trị Rf của chất chuẩn Quercetin và Rutin. Từ kết quả này, xác định các phân đoạn chỉ chứa một hợp chất duy nhất để tiến hành tinh sạch.
2.4.4. Phương pháp chiết lỏng – lỏng
Nguyên tắc: Chiết lỏng-lỏng, còn được gọi là tách pha, là một quá trình tách bao gồm việc chuyển chất tan từ một dung môi này sang dung môi khác, hai dung môi không hòa tan hoặc hòa tan một phần với nhau. Thông thường, một trong các dung môi là dung môi phân cực và dung môi còn lại là dung môi không phân cực.
Trong các quá trình chiết tách, chiết lỏng-lỏng bao gồm bước pha trộn (tiếp xúc), bước tách pha trong một dụng cụ chiết như phễu chiết, bình chiết. Trong bước pha trộn, cần lắc mạnh và đều để tạo điều kiện thuận lợi cho việc chuyển giao chất chiết từ dung môi này sang dung môi khác. Chiết lỏng lỏng là một phương pháp hiệu quả để tách hoặc loại bỏ các hợp chất không mong muốn ra khỏi hỗn hợp trong các phân cứu và phân tích hóa học. Phương pháp này được sử dụng rộng rãi vì sự đơn giản và tiện lợi của nó [10].
Mục đích: Dựa vào khả năng tan khác nhau của các chất trong các dung và sự phân lớp của các dung môi, thu các phân đoạn chất và chất kết tủa khi tiến hành chiết lỏng lỏng.
Quy trình:
10 g nụ hoa hòe khô được ngâm chiết trong 100 ml methanol trong 24 giờ. Thu được 100 ml dịch chiết methanol.
Chuyển 100 ml dịch chiết methanol sang phễu chiết quả lê, thêm 100 ml n- hexane, lắc đều, sau khi dung dịch trong phễu phân lớp, tiến hành tách phần dịch phía dưới và phía trên của phễu.
Với phần dịch phía dưới, cô quay với hệ thống cô quay chân không Eyela – Nhật Bản ở 70oC, tốc độ 450 vòng/phút đến khi thu được 10 ml dịch chiết đặc. Thêm 100 ml Ethyl acetate vào bình chứa 10 ml dịch chiết đặc, thấy xuất hiện
kết tủa.
Dùng giấy lọc thu lấy kết tủa, rửa tủa nhiều lần bằng ethyl acetate, sử dụng hệ thống khí N2 lỏng để làm khô tủa.
Đánh giá kết quả: Hòa tan 1 lượng nhỏ kết tủa thu được bằng methanol, kiểm
tra bằng sắc ký lớp mỏng, so sánh với chất chuẩn Quercetin và Rutin.
2.4.5. Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân
Nguyên tắc: Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance – NMR) là
một phương pháp vật lý hiện đại nghiên cứu cấu tạo của các hợp chất hữu cơ, có ý nghĩa quan trọng để xác định cấu tạo các phân tử phức tạp như các hợp chất thiên nhiên. Phương pháp NMR nghiên cứu cấu trúc phân tử bằng sự tương tác bức xạ điện từ tuần số radio với tập hợp hạt nhân được đặt trong từ trường mạnh. Các hạt nhân này là một phần của nguyên tử và các nguyên tử lại được tập hợp thành phân tử. Do vậy phổ NMR có thể cung cấp thông tin chi tiết về cấu trúc phân tử mà khó có thể nhận biết bằng bất kỳ phương pháp nào khác. Có nhiều hạt nhân có thể nghiên cứu bằng kỹ
thuật NMR, xong hydro và carbon là chung nhất. Phương pháp phổ biến được sử dụng là phương pháp phổ 1H-NMR và phổ 13C-NMR [25].
Mục đích: Xác định cấu trúc phân tử của các hợp chất tinh sạch được từ cao chiết nụ hoa hòe khô.
Quy trình:
Hòa tan 10 mg hợp chất cần xác định cấu trúc vào 1 ml DMSO trong ống NMR. Đảm bảo toàn bộ hợp chất tan hết trong DMSO và mực chất lỏng chiếm 1/3 ống NMR.
Đo phổ bằng hệ thống máy cộng hưởng từ hạt nhân độ phân giải cao Lamda 500 (JEOL, Nhật Bản) và thiết bị cộng hưởng từ hạt nhân bán rắn JNM-ECA500 (JEOL, Nhật Bản) tại Khoa Toán học và Khoa học sự sống, ĐH Khoa học tự nhiên, ĐH Hiroshima, Nhật Bản.
Thông số thiết bị được cài đặt khi đo phổ 1H-NMR như sau: Cường độ từ trường: 11,72T
Tần số cộng hưởng: 1H/499MHz Quang phổ kế: Lambda
Hệ điều hành: WinLambda_V2
Dung môi: dimethyl sulfoxide-d6 99,9%D với 0,03% TMS (Công ty KANTO, Nhật Bản)
Ống mẫu: 5 mm
Đếm tích lũy: 1H 16 lần
Thông số thiết bị được cài đặt khi đo phổ 13C-NMR như sau: Quang phổ kế: ECA
Hệ điều hành: DELTA5,04
Đầu ra gradient từ trường: 0,9T/m Tần số cộng hưởng: 13C/125,7MHz
Dung môi: dimethyl sulfoxide-d6 99,9%D, với 0,03% TMS (Công ty KANTO, Nhật Bản)
Ống mẫu: 5mm
Số lượng tích lũy: 13C 2000 lần
Đánh giá kết quả: Dựa vào phổ thu được, so sánh với phổ của chất chuẩn, so sánh với ngân hàng phổ chuẩn có sẵn, xác định cấu trúc phân tử của hợp chất.
2.4.6. Phương pháp khối phổ
Nguyên tắc: Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry – MS) là một kỹ thuật
phân tích hóa học giúp xác định hàm lượng và loại chất hóa học có trong một mẫu bằng cách đo tỉ lệ khối lượng trên điện tích và số lượng của các ion pha khí. Đây là kỹ thuật phân tích đo phổ về khối lượng của các phân tử điện khi chúng di chuyển trong điện trường. Mẫu được ion hóa trở thành các phân tử tích điện khác nhau và được phân tách dựa vào sự sai khác về giá trị m/z. Dữ liệu khối phổ được tự động ghi lại. Khối