Vi khuẩn E. Coli DH5α sau khi đƣợc xử lý bằng CaCl2 giúp màng tế bào trở nên xốp, giúp cho vector pCR2.1 (đã gắn sản phẩm PCR) có thể xâm nhập vào tế bào một cách dễ dàng hơn. Giai đoạn sốc nhiệt kế tiếp (420
C trong 60 giây) nhằm kích thích sự biến nạp plasmid vào trong tế bào. Sau đó tế bào đƣợc cấy trải lên môi trƣờng dƣỡng chất, giúp cho tế bào hồi phục, nhờ sự trợ giúp của bộ máy tổng hợp trong tế bào mà plasmid tiến hành sao mã, phiên mã và dịch mã tạo nên các protein tƣơng ứng. Gen kháng kháng sinh đƣợc chọn làm dấu hiệu chọn lọc để phân biệt những tế bào có tiếp nhận DNA plasmid trong số những tế bào không tiếp nhận. Toàn bộ quá trình tiến hành thực hiện nhƣ đã trình bày trong mục 2.2.7. Kết quả biến nạp đƣợc thể hiện ở hình 3.10.
Hình 3.10: Kết quả biến nạp vector pCR2.1 (đã gắn sản phẩm PCR)vào tế bào E. coli DH5α
Trong môi trƣờng chọn lọc bằng kháng sinh nhƣ trên có thể xảy ra 3 trƣờng hợp:
Trƣờng hợp 1: Tế bào vi khuẩn không nhận plasmid tái tổ hợp nên không sinh trƣởng đƣợc.
Trƣờng hợp 2: Tế bào vi khuẩn nhận plasmid nhƣng không biểu hiện gen kháng kháng sinh nên không sinh trƣởng đƣợc.
Trƣờng hợp 3: Tế bào vi khuẩn nhận đƣợc plasmid tái tổ hợp và biểu hiện gen kháng kháng sinh nên sinh trƣởng đƣợc.
Chỉ những tế bào nhận vector tái tổ hợp (đã gắn sản phẩm PCR) mới có thể sinh trƣởng đƣợc trên môi trƣờng chọn lọc bằng kháng sinh, do plasmid có chứa và
biểu hiện gen kháng kháng sinh. Chúng tôi tiến hành chọn dòng tế bào mang vector tái tổ hợp chứa aptamer đích bằng phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc. Kết quả chúng tôi chọn đƣợc 8 khuẩn lạc chứa vector tái tổ hợp mang aptamer đích (hình 3.11).
Hình 3.11: Kết quả PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi ApF2/ApR2
Giếng 1 – 8: Sản phẩm PCR với cặp mồi ApF2/ApR2 từ các khuẩn lạc số 1-8 tương ứng
GiếngM: Thang DNA 100 bp
3.2.4.Tách DNA plasmid từ vi khuẩn E. coli
Các dòng khuẩn lạc đã chọn ở trên đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng LB lỏng có bổ sung kháng sinh kar để qua đêm ở tủ lắc 370C, 200 v/ph để nhân lên với số lƣợng lớn. Sau khi tách chiết theo quy trình nhƣ đã trình bày ở mục 2.2.8, chúng tôi lấy 5μl dịch plasmid tách từ mỗi khuẩn lạc hòa trong H2O để điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Kết quả điện di đƣợc thể hiện ở hình 3.12.
Hình 3.12: Kết quả tách chiết plasmid tái tổ hợp mang Apamer liên kết
E. coli O157:H7
Giếng 1 – 8: Plasmid tách chiết từ các khuẩn lạc số 1- 8
Kết quả sau khi chạy điện di cho thấy 3 băng đậm, rõ nét, thể hiện 3 trạng thái khác nhau của plasmid. Điều này chứng tỏ quá trình chiết tách và tinh sạch DNA plasmid đã thành công, loại bỏ hoàn toàn RNA và plasmid .
Nhƣ vậy, chúng tôi đã tách đƣợc 8 dòng aptamer ssDNA liên kết E. coli
O157:H7.
3.3. Kết quả tách dòng aptamer liên kết đặc hiệu E. coli O157:H7
3.3.1. Kết quả tách dòng aptamer liên kết đặc hiệu E. coli O157:H7
Sau khi tách riêng rẽ 8 dòng aptamer nhƣ trên, chúng tôi tiến hành PCR thu các dòng aptamer ssDNA thyol hóa.
8 dòng aptamer đã thyol hóa đƣợc tiến hành gắn với hạt vàng có kích thƣớc 40 nm theo quy trình đã trình bày ở phần phƣơng pháp. Sau đó, chúng tôi sử dụng các phức hợp aptamer – hạt nano vàng này để tiến hành chọn lọc dòng có khả năng liên kết đặc hiệu với vi khuẩn đích thông qua phản ứng dot blot.
Chúng tôi sử dụng vi khuẩn E. coli O157:H7 làm kháng nguyên đích và vi khuẩn E. coli thƣờng làm đối chứng.
Kết quả kiểm tra bằng Dot blot cho thấy dòng số 8 đã chọn có sự liên kết đặc hiệu giữa kháng nguyên của E. coli O157:H7 và aptamer ssDNA gắn trên bề mặt hạt nano vàng. Các hạt nano vàng đóng vai trò nhƣ một sensor màu giúp cho có thể quan sát kết quả kiểm tra bằng mắt thƣờng (hình 3.13). Các hạt nano vàng gắn
aptamer bị bắt lại bởi kháng nguyên và giữ cố định trên màng tạo ra một vùng chấm tròn màu đỏ, các vùng khác không chứa kháng nguyên cố định nên chúng không tạo ra màu đỏ do không có sự xuất hiện của các hạt nano vàng.
Hình 3.13: Kết quả Dot blot giữa phức hợp aptamer ssDNA – hạt nano vàng với kháng nguyên đích E. coli O157:H7
1-8: Hình ảnh dotbot của các aptamer-hạt vàng với E. coli O157:H7
Nhƣ vậy, kết quả dotblot chúng ta nhận thấy aptamer dòng số 8 liên kết với
E. coli O157:H7 mạnh nhất, tiếp theo là dòng số 6 và sự giảm màu sắc chấm đỏ ở các mẫu aptamer còn lại thể hiện mức độ liên kết với E. coli O157:H7 giảm dần. Do đó chúng tôi chọn dòng số 8 để tiến hành kiểm tra sự liên kết của phức hợp aptamer 8 - hạt nano vàng với E. coli O157:H7 thông qua chụp ảnh bằng TEM, so sánh sự liên kết của aptamer-hạt vàng với E. coli thƣờng.
8 7 6 5 4 3 2 1
Nhƣ vậy, qua kết quả dotblot cho phép chúng tôi sơ bộ khẳng định: đã gắn thành công aptamer ssDNA với hạt nano vàng, phức hệ sau khi gắn kết vẫn giữ hoạt tính liên kết đặc hiệu với kháng nguyên đích. Và đã chọn đƣợc 1 dòng có ái lực cao