Sử dụng Vector pCR 2.1 – TOPO để tiến hành tách dòng. Vector pCR 2.1 – TOPO có các đặc điểm sau:
- Có một vùng Ori giúp vector độc lập sao chép trong tế bào chủ.
- Có chứa các gen kháng kháng sinh là ampr (ampicillin) và kar (kanamycin) nhƣ là các dấu chuẩn chọc lọc, cho phép các dòng vi khuẩn mang vector mọc trên môi trƣờng chứa các kháng sinh này. Ngoài ra, chúng còn chứa gen mã hóa cho
100 bp
enzyme β – Galactosidase, có khả năng chuyển hóa cơ chất X – Gal, giúp chọn lọc một cách dễ dàng do phản ứng tạo màu.
- Mang những vị trí nhận biết duy nhất của một số enzyme giới hạn. Vector có 17 vị trí cắt cho các enzyme giới hạn nhƣ: E.coRI, HinIII, NsiI, KprI, SacI,
bamHI, SpeI, BstXI, E.coRV, NetI, AraI, PaeI, XhoI, XbaI, ApaI riêng E.coRI và
BstXI có hai vị trí cắt.
Trong phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pCR2.1, enzyme
topoisomerase (có trong bộ TA Cloning Kit) sẽ bám vào chuỗi kép DNA tại một vị trí đặc hiệu và cắt bỏ liên kết phosphodieste ở đầu 5’ – CCCTT trên một chuỗi đơn của vector, đồng thời tạo nên liên kết cộng hóa trị giữa gốc phosphat đầu 3’ của chuỗi vừa bị cắt với tyrosyl tại vị trí 274 của enzyme topoisomerase bằng chính năng lƣợng liên kết phosphodieste. Trong khi đó, dƣới tác dụng của enzyme Taq DNA polymerase một gốc adenin tự do đầu 3' đƣợc gắn trên sản phẩm của PCR mà không phụ thuộc vào trình tự khuôn. Nhƣ vậy, sản phẩm có thể dễ dàng gắn vào vector đã có sẵn một gốc thymine trên đầu 5’. Tiếp theo liên kết giữa gốc phosphat của DNA và Tyrosyl của enzyme bị phá vỡ nhờ tác động của nhóm 5’ – OH của sợi đơn đã bị cắt trƣớc đó, điều này sẽ làm chuyển hƣớng phản ứng và giải phóng enzyme topoisomerase (hình 3.9).
Hình 3.9: Cơ chế hoạt động của TA Cloning kit. (Nguồn: Invitrogen) Enzyme Topoisomeraza
bám vào ví trí đặc hiệu
Vector pCR2.1 - TOPO
Sản phẩm PCR khuếch đại với Taq Polymeraza
Phản ứng gắn hoàn thành
Enzyme Topoisomeraza
đƣợc giải phóng Ủ 25 phút