Kính hiển vi điện tử truyền qua (transmission electron microscopy, viết tắt: TEM) là một thiết bị nghiên cứu vi cấu trúc vật rắn, sử dụng chùm điện tử có năng lƣợng cao chiếu xuyên qua mẫu vật rắn mỏng và sử dụng các thấu kính từ để tạo ảnh với độ phóng đại lớn (có thể tới hàng triệu lần), ảnh có thể tạo ra trên màn huỳnh quang, hay trên film quang học, hay ghi nhận bằng các máy chụp kỹ thuật số.
Cấu tạo và nguyên lý làm việc của kính hiển vi điện tử truyền qua:
Trong TEM, điện tử đƣợc sử dụng thay cho ánh sáng (trong kính hiển vi quang học). Điện tử đƣợc phát ra từ súng phóng điện tử. Có hai cách để tạo ra chùm điện tử là sử dụng nguồn phát xạ nhiệt điện tử và sử dụng súng phát xạ trƣờng.
Hình 1.8: Cấu tạo của kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)
Vì trong TEM sử dụng chùm tia điện tử thay cho ánh sáng khả kiến nên việc điều khiển sự tạo ảnh không còn là thấu kính thủy tinh nữa mà thay vào đó là các thấu kính từ. Thấu kính từ thực chất là một nam châm điện có cấu trúc là một cuộn dây cuốn trên lõi làm bằng vật liệu từ mềm. Từ trƣờng sinh ra ở khe từ sẽ đƣợc tính toán để có sự phân bố sao cho chùm tia điện tử truyền qua sẽ có độ lệch thích hợp với từng loại thấu kính. Tiêu cự của thấu kính đƣợc điều chỉnh thông qua từ trƣờng ở khe từ, có nghĩa là điều khiển cƣờng độ dòng điện chạy qua cuộn dây. Vì có dòng điện chạy qua, cuộn dây sẽ bị nóng lên do đó cần đƣợc làm lạnh bằng nƣớc hoặc nitơ lỏng.
Sự tạo ảnh trong TEM: Xét trên nguyên lý, ảnh của TEM vẫn đƣợc tạo theo các cơ chế quang học, nhƣng tính chất ảnh tùy thuộc vào từng chế độ ghi ảnh. Điểm khác cơ bản của ảnh TEM so với ảnh quang học là độ tƣơng phản khác so với ảnh trong kính hiển vi quang học và các loại kính hiển vi khác. Nếu nhƣ ảnh trong kính hiển vi quang học có độ tƣơng phản chủ yếu đem lại do hiệu ứng hấp thụ ánh sáng thì độ tƣơng phản của ảnh TEM lại chủ yếu xuất phát từ khả năng tán xạ điện tử.
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu
2.1.1. Chủng vi sinh vật và plasmid
- E. coli ATCC 25922, E. coli DH5α, E. coli O157:H7 ATCC 43895 đƣợc cung cấp bởi Phòng Công nghệ Tế bào động vật – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
- Vector tách dòng pCR2.1 – TOPO (Invitrogen) - Cặp mồi
- Thƣ viện ssDNA
2.1.2. Hóa chất
- Cao nấm men, tryptone, agar, ampicilin, kanamycin, chloroform, isoamylalcohol, agarose, SDS, Etbt, nƣớc khử ion 2 lần, nƣớc đã xử lý RNA và DNA, methanol, Tween 20%, sữa, MgCl2, dung dịch gốc của dNTPs (Hybaid, Germany)…
- Enzyme λ exonuclease, Taq Polymerase (Promega, Germany) - Màng PVDF – Polyvilidene Fluoride (Pall, Mexico)
- BSA – Bovine Serum Albumin (Sigma)
- Bộ kit tinh sạch DNA từ gel agarose (QIA gen), kit tách dòng TOPO – TA (Invitrogen)
- Hạt nano vàng đƣợc cung cấp bởi Viện Vật lý – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.1.3. Thiết bị và máy móc
- Tủ cấy vô trùng - Lò vi sóng - Máy Vortex - Máy ly tâm
- Cân điện tử, cân phân tích - Tủ lạnh sâu (-20ºC, - 80ºC) - Máy đo pH
- Máy soi gel - Máy lắc, ổn nhiệt - Bể ổn nhiệt - Máy điện di - Máy Nano drop
- Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) - Pipetman và các đầu côn các loại.
- Các loại cốc đong, bình định mức, đĩa peptri, que cấy, ống facol, ống eppendrof...
- Và các thiết bị khác của Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen, Phòng Công nghệ Tế bào động vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa họcvà Công nghệ Việt Nam
2.1.4 . Môi trường và dung dịch
- Dung dịch I: Tris – HCl 50mM; pH=8,0; EDTA 10nM; pH=8,0; Glucose 50mM
- Dung dịch II: NaOH 0,2M; SDS 1%
- Dung dịch III: Đệm acetate kali 3M, pH 5,5; Acid acetic băng 11,5% - Dung dịch phenol:chloroform:isomylalcohol (25:24:1)
- TE: Tris – HCl 1M, pH=8,0; EDTA 0,5M; pH=8,0
- TAE 50X: Tris – base 121g; Acid acetic băng 28,6ml; EDTA 0,5M ; pH=8,0, nƣớc cất vừa đủ 500ml
- PBS 10X: Na2HPO4 80,6mM; KH2PO4 19mM; KCl 27nM; NaCl 1,37M; pH=7,4; nƣớc khử ion
- Gel agarose 0,8% pha trong TAE
- Ethidium bromide dung dịch gốc: (10mg/ml) 1g ethidium bromide; 100ml
H2O. Quấy vài giờ bằng máy khuấy từ cho tan đều. Giữ dung dịch trong lọ tối ở
nhiệt độ phòng. Khi dùng pha 20µl dung dịch gốc trong 100 ml đệm TAE 1X
- Đệm tra mẫu DNA (loading Buffer): Tris HCl 1M, pH=8,0, 1ml; EDTA 0,5M, pH=8,0, 0,2 ml; Glycerol 2ml; Bromphenol blue 1% , 2ml
- Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn LB lỏng: Cao nấm men 0,5%; Trypton 1%; Nacl 0,5%
- Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn LB đặc: Môi trƣờng nuôi cấy LB lỏng bổ sung 1,5% agar
- Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn LB đặc + karamycin: Môi trƣờng nuôi cấy LB đặc bổ sung 50µg/ml karamycin
Các môi trƣờng trên đƣợc khử trùng ở 121ºC, 1atm, 15 phút. Kháng sinh đƣợc bổ sung sau khi khử trùng môi trƣờng và nhiệt độ giảm xuống còn 50ºC.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn
- Chuẩn bị vi khuẩn: E. coli DH5α, E. coli O157:H7 ATCC, E. coli ATCC 25922.
- Chuẩn bị môi trƣờng, dụng cụ nuôi cấy vi khuẩn vô trùng. - Sử dụng tủ cấy vi sinh đã vô trùng:
+ Chuyển môi trƣờng LB lỏng đã đƣợc khử trùng ra ống nuôi.
+ Bổ sung dịch vi khuẩn (đã chuẩn bị) vào ống nuôi theo tỉ lệ 1-2% so với thể tích môi trƣờng trong ống.
- Ống nuôi đƣợc nuôi lắc trên máy lắc 200v/ph ở 37ºC qua đêm.
2.2.2. Phương pháp SELEX sàng lọc aptamer đặc hiệu E. coli 0157:H7
Chuẩn bị thƣ viện
Chuẩn bị một thƣ viện ssDNA có trình tự 5’- ATC CGT CAC ACC TGC TCT CAT ATG – N36– ATA CGG GAG CCA ACA CCA AAG CTTC - 3’ nhận từ phòng Công nghệ Tế bào động vật đƣợc sử dụng để làm nguyên liệu cho quá trình sàng lọc. Trƣớc tiên, tiến hành PCR thƣ viện để tạo lƣợng phân tử đủ lớn cho quá trình sàng lọc.
Cặp mồi đã cải biến sau đây đƣợc gắn vào đầu 5’ và 3’ của các phân tử ssDNA trong thƣ viện để sử dụng cho quá trình khuếch đại:
- Mồi ApR2 Ph: 5’ Photphoryl – ATA CGG GAGA CCA ACA CCA AAG CTTC – 3’.
PCR đƣợc thực hiện với thành phần và chu kỳ đƣợc trình bày trong bảng 2.1 và
chu kỳ nhiệt của PCR khuếch đại các trình tự gen làm giàu thƣ viện trong bảng 2.2.
Bảng 2.1: Thành phần hỗn hợp PCR khuếch đại các trình tự gen làm giàu thƣ viện
Thành phần phản ứng Nồng độ Thể tích (µl)
Dung dịch đệm 10X 2,5
dNTPs 10nM 2,5
MgCl2 25mM 1,25
Mồi xuôi 10pmol/µl 1
Mồi ngƣợc 10pmol/µl 1
DNA khuôn 10 – 100 ng/µl 2
Taq- polymease 5 unit/µl 0,3
H2O
Tổng thể tích
14,45 25
Bảng 2.2: Chu kỳ nhiệt của PCR khuếch đại các trình tự gen làm giàu thƣ viện
20 chu kỳ
Sau quá trình khuếch đại, thu đƣợc một lƣợng lớn các oligonucletit sợi đôi. Tuy nhiên, chỉ có ssDNA mới có thể cuộn gấp tạo cấu trúc không gian để liên kết với vi khuẩn E. coli O157:H7. Do đó, trƣớc mỗi vòng sàng lọc, sản phẩm PCR cần
Nhiệt độ
(ºC) 94 94 55 72 72 8
đƣợc xử lý để tạo ssDNA. Enzyme lamda exonuclease đƣợc sử dụng cho quá trình tạo sợi đơn.
Cắt DNA sợi đôi thành sợi đơn:
Bảng 2.3: Thành phần phản ứng tạo ssDNA Thành phần Thể tích (μl) Sản phẩm PCR 20 Dung dịch đệm 4 Enzyme 2 H2O 14 Tổng thể tích 40 Trộn đều các hợp phần phản ứng (bảng 2.3), ủ 4h, nhệt độ 37ºC. Cuối cùng, ssDNA sẽ đƣợc thu lại bằng cách tủa. Cách thực hiện nhƣ sau:
Bƣớc 1: 0,475µl EDTA 0,5M và 150µl ethanol 10% đƣợc thêm vào mỗi ống mẫu, giữ ở - 20ºC, trong 2,5h.
Bƣớc 2: Ly tâm 12000 v/ph, 20 phút. Loại dịch nổi, thu cặn. Bƣớc 3: Bổ sung 30µl H2O vào mỗi ống.
Bƣớc 4: Sau khi thu đƣợc sản phẩm ssDNA, tiến hành xử lý biến tính ở 95ºC trong 5 phút, sau đó đƣợc đƣa xuống 4ºC giữ 15 phút rồi ủ ở 25ºC trong 7 phút để ssDNA cuộn xoắn theo cấu trúc thứ cấp đặc thù.
Sàng lọc:
Việc lựa chọn một aptamer đặc hiệu E. coli O157:H7 đƣợc thực hiện bằng cách ủ tế bào đích với ssDNA và ly tâm loại bỏ những thành phần không mong muốn. Tế bào E. coli O157:H7 và tế bào E. coli thƣờng đƣợc nuôi trong môi trƣờng LB cho tới khi đạt pha log, ly tâm thu tế bào và rửa tế bào bằng dung dịch đệm. Sau đó sử dụng các tế bào này để tiến hành các vòng sàng lọc. Chúng tôi thực hiện 8 vòng sàng lọc với vi khuẩn đích và 1 vòng sàng lọc loại trừ.
Dung dịch thƣ viện ssDNA (500 pmole) đƣợc xử lý trong 3 phút ở 85o C và sau đó giữ ở 4o
khuẩn đích và ủ trong 1h ở nhiệt độ phòng, ly tâm 3000v/p, loại bỏ dịch. Phức hợp đƣợc rửa hai lần bằng đệm rửa (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM MgCl 2, và 0,01% Tween 20, pH 8,0) và tách DNA bằng đệm giải hấp (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM MgCl 2, pH 8,0). Các ssDNA thu đƣợc đƣợc tủa với ethanol sau đó làm khuôn cho PCR nhân bản lƣợng lớn cho vòng sàng lọc sau. Sản phẩm PCR sẽ đƣợc xử lý với enzyme lamda eoxonuclease cắt tạo ssDNA và dùng cho vòng chọn lọc tiếp theo. Cứ nhƣ vậy, sau 8 vòng sàng lọc với vi khuẩn đích và 1 vòng sàng lọc loại trừ với vi khuẩn E. coli thƣờng. Ở vòng sàng lọc với E. coli thƣờng, chúng tôi thu nhận ssDNA không bám dính, tủa lại với ethanol và dùng làm khuôn thực hiện PCR nhân bản các aptamer sau các vòng chọn lọc.
Để theo dõi quá trình làm giàu của các phân tử gắn đặc hiệu với E. coli
O157:H7 trong suốt quá trình sàng lọc, dung dịch thƣ viện đƣa vào và sản phẩm thu đƣợc sau giải hấp của mỗi vòng đƣợc đo nồng độ trên máy NanoDrop. Quá trình sàng lọc sẽ dừng lại khi % của sản phẩm giải hấp của những DNA đặc hiệu E. coli
O157:H7 đạt 55% so với dung dịch thƣ viện đƣa vào. Hỗn hợp trình tự gắn thu đƣợc sau vòng sàng lọc cuối cùng đƣợc sử dụng để tách dòng và giải trình tự.
2.2.3. Phương pháp PCR
Phƣơng pháp PCR (polymerase chain reaction – phản ứng chuỗi trùng hợp) là một trong những phƣơng pháp đƣợc sử dụng rộng rãi nhất trong lĩnh vực sinh học phân tử. Phƣơng pháp do Kary Mullis phát minh vào năm 1985. Phƣơng pháp PCR cho phép tổng hợp nhanh và chính xác từng đoạn DNA riêng biệt. Ðây là phƣơng pháp thuận tiện cho việc xác định sự có mặt của một gen nào đó trong tế bào với độ chính xác cao. Phƣơng pháp này dựa trên sự khám phá hoạt tính sinh học ở nhiệt độ cao của DNA polymerase đƣợc tìm thấy trong các sinh vật ƣa nhiệt (vi khuẩn sống trong các suối nƣớc nóng). Phần lớn các DNA polymerase chỉ làm việc ở nhiệt độ thấp. Nhƣng ở nhiệt độ thấp, DNA tồn tại ở dạng cuộn xoắn chặt vì vậy DNA polymerase không có nhiều khả năng làm biến tính phần lớn các phần của phân tử DNA. Nhƣng các polymerase chịu nhiệt này hoạt động ở nhiệt độ rất cao, có thể lên
đến 100oC. Ở nhiệt độ này DNA (dạng thẳng) sẽ bị biến tính và DNA polymerase có điều kiện hoạt động.
Các hợp phần chủ yếu của PCR:
DNA mẫu, mồi, enzyme polymerase chịu nhiệt, các loại nucleotit, nƣớc, dung dịch đệm, Mg2+
Ba giai đoạn trong một chu kỳ của PCR (hình 2.1, hình 2.2): Có 3 giai đoạn chính trong PCR và chúng đƣợc lặp đi lặp lại nhiều lần (chu kỳ) (thƣờng từ 25 đến 75 chu kỳ).
- Giai đoạn biến tính (denaturation): Trong giai đoạn này phân tử DNA mẫu bị biến tính ở nhiệt độ cao (thƣờng là từ 94-95ºC, lớn hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử) trong vòng 30 giây đến 1 phút, tất cả các liên kết hydro giữa hai mạch của phân tử bị bẻ gãy và tạo thành các ssDNA.
- Giai đoạn lai (hybridization): Nhiệt độ đƣợc hạ thấp (thƣờng từ 40-70ºC) cho phép các mồi bám vào các phân tử ssDNA, đánh dấu phần DNA cần đƣợc khuyếch đại. Giai đoạn này kéo dài từ 30 giây đến một phút (còn đƣợc gọi là giai đoạn ủ). Nếu nhiệt độ quá thấp thì các mồi sẽ gây nên nhiều lỗi và kết quả sẽ tạo nên nhiều sản phẩm phụ. Nếu nhiệt độ quá cao thì phản ứng sẽ không có kết quả. Công thức để xác định nhiệt độ nóng chảy (Tm) một cách tƣơng đối là Tm=4(G+C) + 2(A+T).
- Giai đoạn kéo dài (elongation): Nhiệt độ đƣợc tăng lên đến 72ºC giúp cho
DNA polymerase xúc tác tổng hợp DNA tốt nhất. Công việc của DNA polymerase là di chuyển dọc theo DNA sợi đơn và sử dụng nó làm khuôn để tổng hợp sợi DNA mới bổ sung với DNA mẫu bằng cách kéo dài các phần đã đƣợc đánh dấu bởi các mồi. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào kích thƣớc của DNA mẫu, thƣờng kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút.
Hình 2.1: Ba giai đoạn trong một chu kỳ của PCR
Hình 2.2: Ðồ thị biễu diễn mối quan hệ giữa thời gian và nhiệt độ trong một chu kỳ của PCR
Ở giai đoạn này của chu kỳ cuối cùng, thời gian đƣợc tăng thêm vài phút để các sợi DNA chƣa đƣợc sao chép xong hoàn thành quá trình tổng hợp. Sau mỗi chu kỳ, số bản sao của DNA mẫu lại đƣợc tăng gấp đôi. Ðây là sự nhân bản theo cấp số nhân. Nhƣ vậy cứ 1 phân tử DNA mẫu, sau PCR với n chu kỳ sẽ tạo thành 2n
bản sao phân tử DNA (hình 2.3).
Ƣu điểm của phƣơng pháp PCR là chỉ cần một thời gian ngắn đã cho một số lƣợng DNA theo mong muốn. Sản phẩm của PCR đƣợc phân tách trên gel agarose nhuộm ethimidium bromide (EtBr) và quan sát dƣới máy chiếu tia UV.
Hình 2.3: PCR với lƣợng sản phẩm tăng theo cấp số nhân
Trong đề tài, phƣơng pháp PCR khuếch đại các trình tự gắn sử dụng cặp mồi
ApF2/ApR2, thành phần và chu kỳ phản ứng nhƣ bảng 2.4.
Bảng 2.4: Thành phần PCR khuếch đại các trình tự gen Thành phần phản ứng Nồng độ Thể tích (µl)
Dung dịch đệm 10X 2,5
dNTPs 10nM 2,5
MgCl2 25mM 1,25
Mồi xuôi 10pmol/µl 1
Mồi ngƣợc 10pmol/µl 1
DNA khuôn 10 – 100 ng/µl 5
Taq- polymease 5 unit/µl 0,3
H2O
Tổng thể tích
11,45 25
Bảng 2.5: Chu kỳ nhiệt của PCR khuếch đại các trình tự gen
10 chu kỳ
Nhiệt độ (ºC) 94 94 55 72 72 8
2.2.4. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR
Trong trƣờng hợp lý tƣởng, kết thúc PCR, ta thu đƣợc 1 sản phẩm duy nhất tuy nhiên thƣờng sản phẩm vẫn lẫn tạp với một lƣợng mồi, dNTPs dƣ, enzyme,
DNA polymease. Nếu không tinh sạch sản phẩm PCR, những hợp phần tạp có thể ảnh hƣởng đến phản ứng giải trình tự sau này. Do đó, cần tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR theo các bƣớc sau (sử dụng kit của hãng QIAgen):
Bƣớc 1: Bổ sung 5 lần thể tích buffer 1 vào sản phẩm PCR, trộn đều Bƣớc 2: Chuyển dịch vào cột gắn DNA và ly tâm 12000 v/ph, 1 phút Bƣớc 3: Giữ nguyên cột, loại dịch phía dƣới cột
Bƣớc 4: Bổ sung 500µl buffer 2 vào cột và ly tâm 12000 v/ph, 1 phút Bƣớc 5: Giữ nguyên cột, loại dịch phía dƣới cột
Bƣớc 6: Lặp lại bƣớc 4 và 5
Bƣớc 7: Ly tâm 12000 v/ph, 1 phút để làm khô
Bƣớc 8: Bổ sung 30µl nƣớc vào cột ly tâm 12000 v/ph, 1 phút
Bƣớc 9: Chuyển dịch sau ly tấm sang ống eppendorf mới và bảo quản sản phẩm sau tinh sạch để tiến hành giải trình tự
2.2.5. Phương pháp điện di trên gel agarose
Nguyên tắc: