2.2.1. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn
- Chuẩn bị vi khuẩn: E. coli DH5α, E. coli O157:H7 ATCC, E. coli ATCC 25922.
- Chuẩn bị môi trƣờng, dụng cụ nuôi cấy vi khuẩn vô trùng. - Sử dụng tủ cấy vi sinh đã vô trùng:
+ Chuyển môi trƣờng LB lỏng đã đƣợc khử trùng ra ống nuôi.
+ Bổ sung dịch vi khuẩn (đã chuẩn bị) vào ống nuôi theo tỉ lệ 1-2% so với thể tích môi trƣờng trong ống.
- Ống nuôi đƣợc nuôi lắc trên máy lắc 200v/ph ở 37ºC qua đêm.
2.2.2. Phương pháp SELEX sàng lọc aptamer đặc hiệu E. coli 0157:H7
Chuẩn bị thƣ viện
Chuẩn bị một thƣ viện ssDNA có trình tự 5’- ATC CGT CAC ACC TGC TCT CAT ATG – N36– ATA CGG GAG CCA ACA CCA AAG CTTC - 3’ nhận từ phòng Công nghệ Tế bào động vật đƣợc sử dụng để làm nguyên liệu cho quá trình sàng lọc. Trƣớc tiên, tiến hành PCR thƣ viện để tạo lƣợng phân tử đủ lớn cho quá trình sàng lọc.
Cặp mồi đã cải biến sau đây đƣợc gắn vào đầu 5’ và 3’ của các phân tử ssDNA trong thƣ viện để sử dụng cho quá trình khuếch đại:
- Mồi ApR2 Ph: 5’ Photphoryl – ATA CGG GAGA CCA ACA CCA AAG CTTC – 3’.
PCR đƣợc thực hiện với thành phần và chu kỳ đƣợc trình bày trong bảng 2.1 và
chu kỳ nhiệt của PCR khuếch đại các trình tự gen làm giàu thƣ viện trong bảng 2.2.
Bảng 2.1: Thành phần hỗn hợp PCR khuếch đại các trình tự gen làm giàu thƣ viện
Thành phần phản ứng Nồng độ Thể tích (µl)
Dung dịch đệm 10X 2,5
dNTPs 10nM 2,5
MgCl2 25mM 1,25
Mồi xuôi 10pmol/µl 1
Mồi ngƣợc 10pmol/µl 1
DNA khuôn 10 – 100 ng/µl 2
Taq- polymease 5 unit/µl 0,3
H2O
Tổng thể tích
14,45 25
Bảng 2.2: Chu kỳ nhiệt của PCR khuếch đại các trình tự gen làm giàu thƣ viện
20 chu kỳ
Sau quá trình khuếch đại, thu đƣợc một lƣợng lớn các oligonucletit sợi đôi. Tuy nhiên, chỉ có ssDNA mới có thể cuộn gấp tạo cấu trúc không gian để liên kết với vi khuẩn E. coli O157:H7. Do đó, trƣớc mỗi vòng sàng lọc, sản phẩm PCR cần
Nhiệt độ
(ºC) 94 94 55 72 72 8
đƣợc xử lý để tạo ssDNA. Enzyme lamda exonuclease đƣợc sử dụng cho quá trình tạo sợi đơn.
Cắt DNA sợi đôi thành sợi đơn:
Bảng 2.3: Thành phần phản ứng tạo ssDNA Thành phần Thể tích (μl) Sản phẩm PCR 20 Dung dịch đệm 4 Enzyme 2 H2O 14 Tổng thể tích 40 Trộn đều các hợp phần phản ứng (bảng 2.3), ủ 4h, nhệt độ 37ºC. Cuối cùng, ssDNA sẽ đƣợc thu lại bằng cách tủa. Cách thực hiện nhƣ sau:
Bƣớc 1: 0,475µl EDTA 0,5M và 150µl ethanol 10% đƣợc thêm vào mỗi ống mẫu, giữ ở - 20ºC, trong 2,5h.
Bƣớc 2: Ly tâm 12000 v/ph, 20 phút. Loại dịch nổi, thu cặn. Bƣớc 3: Bổ sung 30µl H2O vào mỗi ống.
Bƣớc 4: Sau khi thu đƣợc sản phẩm ssDNA, tiến hành xử lý biến tính ở 95ºC trong 5 phút, sau đó đƣợc đƣa xuống 4ºC giữ 15 phút rồi ủ ở 25ºC trong 7 phút để ssDNA cuộn xoắn theo cấu trúc thứ cấp đặc thù.
Sàng lọc:
Việc lựa chọn một aptamer đặc hiệu E. coli O157:H7 đƣợc thực hiện bằng cách ủ tế bào đích với ssDNA và ly tâm loại bỏ những thành phần không mong muốn. Tế bào E. coli O157:H7 và tế bào E. coli thƣờng đƣợc nuôi trong môi trƣờng LB cho tới khi đạt pha log, ly tâm thu tế bào và rửa tế bào bằng dung dịch đệm. Sau đó sử dụng các tế bào này để tiến hành các vòng sàng lọc. Chúng tôi thực hiện 8 vòng sàng lọc với vi khuẩn đích và 1 vòng sàng lọc loại trừ.
Dung dịch thƣ viện ssDNA (500 pmole) đƣợc xử lý trong 3 phút ở 85o C và sau đó giữ ở 4o
khuẩn đích và ủ trong 1h ở nhiệt độ phòng, ly tâm 3000v/p, loại bỏ dịch. Phức hợp đƣợc rửa hai lần bằng đệm rửa (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM MgCl 2, và 0,01% Tween 20, pH 8,0) và tách DNA bằng đệm giải hấp (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM MgCl 2, pH 8,0). Các ssDNA thu đƣợc đƣợc tủa với ethanol sau đó làm khuôn cho PCR nhân bản lƣợng lớn cho vòng sàng lọc sau. Sản phẩm PCR sẽ đƣợc xử lý với enzyme lamda eoxonuclease cắt tạo ssDNA và dùng cho vòng chọn lọc tiếp theo. Cứ nhƣ vậy, sau 8 vòng sàng lọc với vi khuẩn đích và 1 vòng sàng lọc loại trừ với vi khuẩn E. coli thƣờng. Ở vòng sàng lọc với E. coli thƣờng, chúng tôi thu nhận ssDNA không bám dính, tủa lại với ethanol và dùng làm khuôn thực hiện PCR nhân bản các aptamer sau các vòng chọn lọc.
Để theo dõi quá trình làm giàu của các phân tử gắn đặc hiệu với E. coli
O157:H7 trong suốt quá trình sàng lọc, dung dịch thƣ viện đƣa vào và sản phẩm thu đƣợc sau giải hấp của mỗi vòng đƣợc đo nồng độ trên máy NanoDrop. Quá trình sàng lọc sẽ dừng lại khi % của sản phẩm giải hấp của những DNA đặc hiệu E. coli
O157:H7 đạt 55% so với dung dịch thƣ viện đƣa vào. Hỗn hợp trình tự gắn thu đƣợc sau vòng sàng lọc cuối cùng đƣợc sử dụng để tách dòng và giải trình tự.
2.2.3. Phương pháp PCR
Phƣơng pháp PCR (polymerase chain reaction – phản ứng chuỗi trùng hợp) là một trong những phƣơng pháp đƣợc sử dụng rộng rãi nhất trong lĩnh vực sinh học phân tử. Phƣơng pháp do Kary Mullis phát minh vào năm 1985. Phƣơng pháp PCR cho phép tổng hợp nhanh và chính xác từng đoạn DNA riêng biệt. Ðây là phƣơng pháp thuận tiện cho việc xác định sự có mặt của một gen nào đó trong tế bào với độ chính xác cao. Phƣơng pháp này dựa trên sự khám phá hoạt tính sinh học ở nhiệt độ cao của DNA polymerase đƣợc tìm thấy trong các sinh vật ƣa nhiệt (vi khuẩn sống trong các suối nƣớc nóng). Phần lớn các DNA polymerase chỉ làm việc ở nhiệt độ thấp. Nhƣng ở nhiệt độ thấp, DNA tồn tại ở dạng cuộn xoắn chặt vì vậy DNA polymerase không có nhiều khả năng làm biến tính phần lớn các phần của phân tử DNA. Nhƣng các polymerase chịu nhiệt này hoạt động ở nhiệt độ rất cao, có thể lên
đến 100oC. Ở nhiệt độ này DNA (dạng thẳng) sẽ bị biến tính và DNA polymerase có điều kiện hoạt động.
Các hợp phần chủ yếu của PCR:
DNA mẫu, mồi, enzyme polymerase chịu nhiệt, các loại nucleotit, nƣớc, dung dịch đệm, Mg2+
Ba giai đoạn trong một chu kỳ của PCR (hình 2.1, hình 2.2): Có 3 giai đoạn chính trong PCR và chúng đƣợc lặp đi lặp lại nhiều lần (chu kỳ) (thƣờng từ 25 đến 75 chu kỳ).
- Giai đoạn biến tính (denaturation): Trong giai đoạn này phân tử DNA mẫu bị biến tính ở nhiệt độ cao (thƣờng là từ 94-95ºC, lớn hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử) trong vòng 30 giây đến 1 phút, tất cả các liên kết hydro giữa hai mạch của phân tử bị bẻ gãy và tạo thành các ssDNA.
- Giai đoạn lai (hybridization): Nhiệt độ đƣợc hạ thấp (thƣờng từ 40-70ºC) cho phép các mồi bám vào các phân tử ssDNA, đánh dấu phần DNA cần đƣợc khuyếch đại. Giai đoạn này kéo dài từ 30 giây đến một phút (còn đƣợc gọi là giai đoạn ủ). Nếu nhiệt độ quá thấp thì các mồi sẽ gây nên nhiều lỗi và kết quả sẽ tạo nên nhiều sản phẩm phụ. Nếu nhiệt độ quá cao thì phản ứng sẽ không có kết quả. Công thức để xác định nhiệt độ nóng chảy (Tm) một cách tƣơng đối là Tm=4(G+C) + 2(A+T).
- Giai đoạn kéo dài (elongation): Nhiệt độ đƣợc tăng lên đến 72ºC giúp cho
DNA polymerase xúc tác tổng hợp DNA tốt nhất. Công việc của DNA polymerase là di chuyển dọc theo DNA sợi đơn và sử dụng nó làm khuôn để tổng hợp sợi DNA mới bổ sung với DNA mẫu bằng cách kéo dài các phần đã đƣợc đánh dấu bởi các mồi. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào kích thƣớc của DNA mẫu, thƣờng kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút.
Hình 2.1: Ba giai đoạn trong một chu kỳ của PCR
Hình 2.2: Ðồ thị biễu diễn mối quan hệ giữa thời gian và nhiệt độ trong một chu kỳ của PCR
Ở giai đoạn này của chu kỳ cuối cùng, thời gian đƣợc tăng thêm vài phút để các sợi DNA chƣa đƣợc sao chép xong hoàn thành quá trình tổng hợp. Sau mỗi chu kỳ, số bản sao của DNA mẫu lại đƣợc tăng gấp đôi. Ðây là sự nhân bản theo cấp số nhân. Nhƣ vậy cứ 1 phân tử DNA mẫu, sau PCR với n chu kỳ sẽ tạo thành 2n
bản sao phân tử DNA (hình 2.3).
Ƣu điểm của phƣơng pháp PCR là chỉ cần một thời gian ngắn đã cho một số lƣợng DNA theo mong muốn. Sản phẩm của PCR đƣợc phân tách trên gel agarose nhuộm ethimidium bromide (EtBr) và quan sát dƣới máy chiếu tia UV.
Hình 2.3: PCR với lƣợng sản phẩm tăng theo cấp số nhân
Trong đề tài, phƣơng pháp PCR khuếch đại các trình tự gắn sử dụng cặp mồi
ApF2/ApR2, thành phần và chu kỳ phản ứng nhƣ bảng 2.4.
Bảng 2.4: Thành phần PCR khuếch đại các trình tự gen Thành phần phản ứng Nồng độ Thể tích (µl)
Dung dịch đệm 10X 2,5
dNTPs 10nM 2,5
MgCl2 25mM 1,25
Mồi xuôi 10pmol/µl 1
Mồi ngƣợc 10pmol/µl 1
DNA khuôn 10 – 100 ng/µl 5
Taq- polymease 5 unit/µl 0,3
H2O
Tổng thể tích
11,45 25
Bảng 2.5: Chu kỳ nhiệt của PCR khuếch đại các trình tự gen
10 chu kỳ
Nhiệt độ (ºC) 94 94 55 72 72 8
2.2.4. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR
Trong trƣờng hợp lý tƣởng, kết thúc PCR, ta thu đƣợc 1 sản phẩm duy nhất tuy nhiên thƣờng sản phẩm vẫn lẫn tạp với một lƣợng mồi, dNTPs dƣ, enzyme,
DNA polymease. Nếu không tinh sạch sản phẩm PCR, những hợp phần tạp có thể ảnh hƣởng đến phản ứng giải trình tự sau này. Do đó, cần tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR theo các bƣớc sau (sử dụng kit của hãng QIAgen):
Bƣớc 1: Bổ sung 5 lần thể tích buffer 1 vào sản phẩm PCR, trộn đều Bƣớc 2: Chuyển dịch vào cột gắn DNA và ly tâm 12000 v/ph, 1 phút Bƣớc 3: Giữ nguyên cột, loại dịch phía dƣới cột
Bƣớc 4: Bổ sung 500µl buffer 2 vào cột và ly tâm 12000 v/ph, 1 phút Bƣớc 5: Giữ nguyên cột, loại dịch phía dƣới cột
Bƣớc 6: Lặp lại bƣớc 4 và 5
Bƣớc 7: Ly tâm 12000 v/ph, 1 phút để làm khô
Bƣớc 8: Bổ sung 30µl nƣớc vào cột ly tâm 12000 v/ph, 1 phút
Bƣớc 9: Chuyển dịch sau ly tấm sang ống eppendorf mới và bảo quản sản phẩm sau tinh sạch để tiến hành giải trình tự
2.2.5. Phương pháp điện di trên gel agarose
Nguyên tắc:
Điện di là hiện tƣợng dịch chuyển của các phân tử tích điện dƣới tác động của điện trƣờng. Kỹ thuật này giúp phân tách các phân tử DNA, RNA, protein dựa trên các đặc điểm vật lý nhƣ khối lƣợng hay điện tích thực của chúng.
Khi các phân tử tích điện đƣợc đặt trong một điện trƣờng, chúng sẽ dịch chuyển về các cực dƣơng hoặc âm tùy theo điện tích của chúng. Protein có điện tích thực dƣơng hoặc âm, còn các nucleic acid có điện tích âm nhờ khung phosphate của mình và vì thế chỉ dịch chuyển hƣớng đến cực dƣơng [11].
Các phân tử protein và nucleic acid có thể đƣợc chạy điện di trên một khuôn đỡ (support matrix) nhƣ giấy, cellulose acetate, gel tinh bột, agarose hoặc polyacrylamide gel. Tuy nhiên, kỹ thuật điện di trên giá rắn (agarose hoặc polyacrylamide) đƣợc sử dụng phổ biến nhất. Kỹ thuật này sử dụng một dung dịch
đệm để dẫn điện và tạo điện trƣờng đều, một bản gel để phân tách các phân tử và các chất nhuộm khác nhau để phát hiện vị trí các phân tử trên gel sau khi điện di. Trong đó, polyacrylamide gel đƣợc dùng để phân tách các phân tử protein và các phân tử DNA có chiều dài <1 kb, còn agarose gel phân tách hiệu quả các phân tử DNA hoặc RNA có kích thƣớc từ 20 bp-20 kb.
Điện di agarose gel đƣợc xem là phƣơng pháp tối ƣu nhất dùng để phân tích, xác định và tinh sạch các đoạn DNA.
Nguyên tắc: Các phân tử nucleic acid có khối lƣợng và điện tích khác nhau đƣợc tách ra khi di chuyển từ cực âm sang cực dƣơng của hệ điện di trong một điện trƣờng có điện thế và cƣờng độ thích hợp. Tốc độ dịch chuyển của các phân tử trong gel phụ thuộc vào kích thƣớc, cấu hình phân tử, nồng độ gel, lực điện trƣờng... Vị trí của DNA trong gel đƣợc xác định trực tiếp: các băng DNA trong gel đƣợc nhuộm ở nồng độ thấp của thuốc nhuộm huỳnh quang EtBr và có thể phát hiện dƣới ánh sáng tử ngoại.
Các yếu tố ảnh hƣởng: Kích thƣớc của phân tử, nồng độ agarose, cấu hình của DNA, thành phần base và nhiệt độ.
Nhuộm DNA bằng EtBr và chụp ảnh, quan sát. Các ứng dụng của điện di agarose gel:
- Ƣớc lƣợng kích thƣớc của các phân tử DNA sau khi thực hiện phản ứng cắt hạn chế (ví dụ: lập bản đồ hạn chế của DNA đƣợc tạo dòng…)
- Phân tích các sản phẩm PCR (ví dụ: trong chẩn đoán di truyền phân tử hoặc in dấu di truyền…)
- Phân tách DNA hệ gen đã đƣợc cắt hạn chế trƣớc khi thẩm tích Southern hoặc RNA trƣớc khi thẩm tích Northern
Trong một phạm vi nhất định của nồng độ gel agarose, kích thƣớc phân tử tuyến tính với quãng đƣờng dịch chuyển của DNA trên gel agarose. Thƣờng các đoạn gen có kích thƣớc từ 300 - 10.000 bp có thể đƣợc phân tách trên gel agarose 0.8%. Nồng độ gel thƣờng phụ thuộc vào kích thƣớc sản phẩm DNA cần phân tách.
2.2.6. Phản ứng gắn gen vào vector tách dòng
Nguyên tắc:
Chèn một đoạn DNA ngoại lai vào một phân tử DNA có kích thƣớc nhỏ (vector tách dòng) thƣờng có dạng vòng với mục đích nhân bản đoạn DNA ngoại lai với số lƣợng lớn. Vector tách dòng có các đặc điểm sau:
- Kích thƣớc tƣơng đối nhỏ so với nhiễm sắc thể của tế bàovật chủ - Có thể nhân đôi độc lập trong tế bào vật chủ
- Có vùng nhận biết enzym giới hạn
- Có thể nhận biết bằng gen chỉ thị hoặc gen đánh dấu - Trình tự nucleotit đã xác định
- Phải thích hợp với tế bào vật chủ
- Có vị trí gắn phân tử DNA ngoại lai(polycloning site)
Trong đề tài sử dụng vector tách dòng pCR2.1 – TOPO (Invitrogen) (hình 2.4) đƣợc sử dụng để gắn trực tiếp sản phẩm của PCR. Trên sản phẩm enzyme sẽ tạo một gốc adenin tự do đầu 3’ mà không phụ thuộc vào trình tự khuôn, trong khi đó một gốc Thymine tự do đƣợc thiết kế trên vector tách dòng pCR2.1. Điều này cho phép sản phẩm PCR có thể dễ dàng gắn vào vector khi có mặt enzyme xúc tác.
Cách tiến hành:
Sử dụng bộ kit theo vector pCR2.1 (Invitrogen) để tách dòng. Trộn các thành phần của phản ứng và ủ ở 22º trong 30 phút.
2.2.7. Phương pháp biến nạp plasmid vào tế bào E. coli DH5α
Nguyên tắc:
Công đoạn này nhằm mục đích sử dụng bộ máy của tế bào chủ để sao chép vector tái tổ hợp thành một số lƣợng lớn bản sao. Việc chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn tức là làm cho vi khuẩn trở thành khả biến (có khả năng thấm vector tái tổ hợp). Sự thấm này có thể xảy ra một cách tự nhiên hoặc đƣợc cảm ứng. Tuy nhiên, tùy theo vào loại plasmid sử dụng làm vector và tùy theo sự định vị của vùng cài lắp chứa bên trong vector mà ngƣời nghiên cứu sẽ chọn phƣơng pháp biến nạp hoặc tải nạp.
Biến nạp là hiện tƣợng chuyển vật chất di truyền trực tiếp từ tế bào thể cho D (Doner) sang tế bào thể nhận R (Reception), không cần sự tiếp xúc giữa hai tế bào hoặc nhân tố trung gian là phage hoặc virus. Biến nạp đƣợc thực hiện với vector chuyển gen là plasmid. Có nhiều phƣơng pháp biến nạp nhƣ hóa biến nạp, điện biến nạp, biến nạp tế bào trần, phƣơng pháp bắn gen và phƣơng pháp vi tiêm. Trong đề tài nghiên cứu sử dụng phƣơng pháp hóa biến nạp: dựa vào tác dụng của CaCl2