Từ thƣ viện aptamer ssDNA tổng hợp, chúng tôi tiến hành sàng lọc aptamer liên kết E. coli O157:H7 theo phƣơng pháp SELEX đã trình bày ở mục phƣơng pháp. Quá trình sàng lọc gồm 8 vòng sàng lọc với vi khuẩn đích và 1 vòng sàng lọc loại trừ (đã trình bày ở phần phƣơng pháp). Sau mỗi vòng sàng lọc, dịch giải hấp đƣợc sử dụng làm khuôn cho PCR làm giàu và lặp lại vòng sàng lọc tiếp theo (hình 3.5). Trong quá trình sàng lọc với vi khuẩn đích, nồng độ chất tẩy rửa Tween tăng dần để loại bỏ các aptamer liên kết lỏng lẻo.
Hình 3.5: Kết quả PCR làm giàu sau mỗi vòng sàng lọc với cặp mồi ApF2/ApR2
1– 3: Sản phẩm PCR từ dịch giải hấp với cặp mồi của gen; GiếngM: Thang DNA 100bp.
Kết quả điện di cho thấy: Trên đƣờng chạy xuất hiện vạch băng sáng đậm, so với thang DNA chuẩn thì băng này có kích thƣớc khoảng 70 bp. Nhƣ vậy, có thể khẳng định các bƣớc sàng lọc là ổn định.
Thƣ viện trƣớc khi đƣa vào sàng lọc và sản phẩm sau giải hấp đƣợc đo nồng độ trên máy Nano Drop để kiểm soát tiến trình của sự làm giàu. Điều kiện phân tách khắt khe với việc tăng nồng độ Tween 20% sau mỗi vòng đƣợc thực hiện để đảm bảo tính chọn lọc cao của aptamer mong muốn (bảng 3.1). Trong ba vòng đầu tiên
Sản phẩm PCR 100 bp
của sàng lọc, phần trăm Tween 20% trong đệm rửa tăng từ 0,1% lên 0,2% rồi 0,5% tƣơng ứng thu đƣợc phần trăm DNA giải hấp giảm từ 12% đến 5,1% và sau đó đến 0,22%. Từ vòng sàng lọc thứ 3 đến vòng sàng lọc thứ 6, phần trăm Tween 20% trong đệm rửa tiếp tục tăng từ 0,7% đến 1,2%; sản phẩm của quá trình làm giàu tăng 13 lần từ 0,22% đến 2,9%. Một sự gia tăng ấn tƣợng đƣợc nhìn thấy ở vòng sàng lọc thứ 7 và sự gia tăng đáng kể có ý nghĩa ở vòng thứ 8. Quá trình sàng lọc đƣợc dừng lại khi phần trăm DNA đặc hiệu E. coli O157:H7 thu đƣợc sau giải hấp đạt 55% so với thƣ viện đƣa vào.
Bảng 3.1: Tóm tắt điều kiện nghiêm ngặt tăng dần cho mỗi vòng sàng lọc
Vòng sàng lọc % Tween trong
đệm rửa % sản phẩm giải hấp so với đầu vào
1 0,1 12 2 0,2 5,1 3 0,5 0,22 4 0,7 0,4 5 1 1,6 6 1,2 2,9 7 1,5 24 8 1,7 55
Để hạn chế tối đa những sản phẩm thu đƣợc sau giải hấp nhƣng không đặc hiệu với E. coli O157:H7, chúng tôi thực hiện vòng sàng lọc loại trừ. Quy trình thực hiện tƣơng tự nhƣ các vòng sàng lọc bình thƣờng, chỉ khác ở chỗ thay vì E. coli
O157:H7, là E. coli thƣờng và sau bƣớc ủ với ssDNA, dịch ủ chứ không phải sản phẩm giải hấp đƣợc giữ lại cho các thí nghiệm tiếp theo. Sau vòng này, những trình tự có khả năng gắn trực tiếp vào E. coli thƣờng sẽ bị loại bỏ.
Sau 8 vòng sàng lọc với vi khuẩn đích và 1 vòng sàng lọc loại trừ, chúng tôi thu đƣợc một hỗn hợp ssDNA có khả năng gắn kết với vi khuẩn đích. Trong hỗn hợp ssDNA này bao gồm nhiều phân tử ssDNA có trình tự khác nhau cũng nhƣ khả năng liên kết với vi khuẩn đích là khác nhau. Chính vì vậy, công việc tiếp theo của
chúng tôi là chọn ra đƣợc 1 vài aptamer có khả năng liên kết đặc hiệu nhất với vi khuẩn đích. Để giải quyết vấn đề này, sản phẩm sau sàng lọc đã đƣợc tủa lại để chuẩn bị cho quá trình tách dòng và chọn dòng aptamer liên kết đặc hiệu vi khuẩn
E. coli O157:H7.
Nhƣ vậy, kết thúc quá trình sàng lọc 9 vòng, chúng tôi thu đƣợc hỗn hợp các aptamer ssDNA có khả năng liên kết E. coli O157:H7.
3.2. Kết quả tách dòng aptamer liên kết vi khuẩn E. coli O157:H7
Để tìm đƣợc phân tử aptamer có khả năng gắn tốt nhất với E. coli O157:H7 trong hỗn hợp các aptamer ssDNA vừa thu đƣợc trên, chúng tôi tiến hành tách dòng và chọn dòng aptamer liên kết đặc hiệu vi khuẩn E. coli O157:H7. Quá trình tách dòng đƣợc tiến hành theo hình 3.6.
Hình 3.7: Quy trình tách dòng aptamer ssDNA liên kết vi khuẩn E. coli O157:H7
3.2.1. Nhân bản trình tự aptamer ssDNA liên kết vi khuẩn E. coli
O157:H7
Dịch sàng lọc sau vòng loại trừ đƣợc đƣa vào quy trình tách dòng (hình 3.7) và xác định trình tự. Đầu tiên, cần tiến hành PCR để tăng số bản sao của aptamer
Gắn sản phẩm PCR vào vecto pCR 2.1 - TOPO
Tinh sạch sản phẩm PCR
Phân tích điện di trên gel agarose Nhân bản Aptamer liên kết E.coli
O157:H7
Hỗn hợp Aptamer ssDNA liên kết
E.coli O157:H7
Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5α
Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn E.coli
Táchđƣợc các dòng Aptamer liên kếtvi khuẩn E.coli O157:H7
ssDNA gắn với vi khuẩn E. coli O157:H7. Sau đó phân tích điện di trên gel agarose, chúng tôi thu đƣợc kết quả trên hình 3.8.
M 1
Hình 3.8: Kết quả điện di sản phẩm PCR
Giếng 1: Sản phẩm PCR aptamer ssDNA liên kết vi khuẩn E. coli O157:H7
Giếng M: Thang DNA 100 bp
Sau khi hoàn thành bƣớc khuếch đại trình tự liên kết, chúng tôi tiến hành tách dòng những đoạn gen này. Quá trình tách dòng đƣợc thực hiện bằng cách gắn trực tiếp sản phẩm PCR vào vector tách dòng pCR2.1 – TOPO (Invitrogen), sau đó biến nạp vào tế bào E. coli chủng DH5α để chọn lọc dòng tái tổ hợp mang đoạn gen gắn đặc hiệu với E. coli O157:H7.
3.2.2. Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pCR 2.1 – TOPO
Sử dụng Vector pCR 2.1 – TOPO để tiến hành tách dòng. Vector pCR 2.1 – TOPO có các đặc điểm sau:
- Có một vùng Ori giúp vector độc lập sao chép trong tế bào chủ.
- Có chứa các gen kháng kháng sinh là ampr (ampicillin) và kar (kanamycin) nhƣ là các dấu chuẩn chọc lọc, cho phép các dòng vi khuẩn mang vector mọc trên môi trƣờng chứa các kháng sinh này. Ngoài ra, chúng còn chứa gen mã hóa cho
100 bp
enzyme β – Galactosidase, có khả năng chuyển hóa cơ chất X – Gal, giúp chọn lọc một cách dễ dàng do phản ứng tạo màu.
- Mang những vị trí nhận biết duy nhất của một số enzyme giới hạn. Vector có 17 vị trí cắt cho các enzyme giới hạn nhƣ: E.coRI, HinIII, NsiI, KprI, SacI,
bamHI, SpeI, BstXI, E.coRV, NetI, AraI, PaeI, XhoI, XbaI, ApaI riêng E.coRI và
BstXI có hai vị trí cắt.
Trong phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pCR2.1, enzyme
topoisomerase (có trong bộ TA Cloning Kit) sẽ bám vào chuỗi kép DNA tại một vị trí đặc hiệu và cắt bỏ liên kết phosphodieste ở đầu 5’ – CCCTT trên một chuỗi đơn của vector, đồng thời tạo nên liên kết cộng hóa trị giữa gốc phosphat đầu 3’ của chuỗi vừa bị cắt với tyrosyl tại vị trí 274 của enzyme topoisomerase bằng chính năng lƣợng liên kết phosphodieste. Trong khi đó, dƣới tác dụng của enzyme Taq DNA polymerase một gốc adenin tự do đầu 3' đƣợc gắn trên sản phẩm của PCR mà không phụ thuộc vào trình tự khuôn. Nhƣ vậy, sản phẩm có thể dễ dàng gắn vào vector đã có sẵn một gốc thymine trên đầu 5’. Tiếp theo liên kết giữa gốc phosphat của DNA và Tyrosyl của enzyme bị phá vỡ nhờ tác động của nhóm 5’ – OH của sợi đơn đã bị cắt trƣớc đó, điều này sẽ làm chuyển hƣớng phản ứng và giải phóng enzyme topoisomerase (hình 3.9).
Hình 3.9: Cơ chế hoạt động của TA Cloning kit. (Nguồn: Invitrogen) Enzyme Topoisomeraza
bám vào ví trí đặc hiệu
Vector pCR2.1 - TOPO
Sản phẩm PCR khuếch đại với Taq Polymeraza
Phản ứng gắn hoàn thành
Enzyme Topoisomeraza
đƣợc giải phóng Ủ 25 phút
3.2.3. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E. coli DH5α
Vi khuẩn E. Coli DH5α sau khi đƣợc xử lý bằng CaCl2 giúp màng tế bào trở nên xốp, giúp cho vector pCR2.1 (đã gắn sản phẩm PCR) có thể xâm nhập vào tế bào một cách dễ dàng hơn. Giai đoạn sốc nhiệt kế tiếp (420
C trong 60 giây) nhằm kích thích sự biến nạp plasmid vào trong tế bào. Sau đó tế bào đƣợc cấy trải lên môi trƣờng dƣỡng chất, giúp cho tế bào hồi phục, nhờ sự trợ giúp của bộ máy tổng hợp trong tế bào mà plasmid tiến hành sao mã, phiên mã và dịch mã tạo nên các protein tƣơng ứng. Gen kháng kháng sinh đƣợc chọn làm dấu hiệu chọn lọc để phân biệt những tế bào có tiếp nhận DNA plasmid trong số những tế bào không tiếp nhận. Toàn bộ quá trình tiến hành thực hiện nhƣ đã trình bày trong mục 2.2.7. Kết quả biến nạp đƣợc thể hiện ở hình 3.10.
Hình 3.10: Kết quả biến nạp vector pCR2.1 (đã gắn sản phẩm PCR)vào tế bào E. coli DH5α
Trong môi trƣờng chọn lọc bằng kháng sinh nhƣ trên có thể xảy ra 3 trƣờng hợp:
Trƣờng hợp 1: Tế bào vi khuẩn không nhận plasmid tái tổ hợp nên không sinh trƣởng đƣợc.
Trƣờng hợp 2: Tế bào vi khuẩn nhận plasmid nhƣng không biểu hiện gen kháng kháng sinh nên không sinh trƣởng đƣợc.
Trƣờng hợp 3: Tế bào vi khuẩn nhận đƣợc plasmid tái tổ hợp và biểu hiện gen kháng kháng sinh nên sinh trƣởng đƣợc.
Chỉ những tế bào nhận vector tái tổ hợp (đã gắn sản phẩm PCR) mới có thể sinh trƣởng đƣợc trên môi trƣờng chọn lọc bằng kháng sinh, do plasmid có chứa và
biểu hiện gen kháng kháng sinh. Chúng tôi tiến hành chọn dòng tế bào mang vector tái tổ hợp chứa aptamer đích bằng phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc. Kết quả chúng tôi chọn đƣợc 8 khuẩn lạc chứa vector tái tổ hợp mang aptamer đích (hình 3.11).
Hình 3.11: Kết quả PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi ApF2/ApR2
Giếng 1 – 8: Sản phẩm PCR với cặp mồi ApF2/ApR2 từ các khuẩn lạc số 1-8 tương ứng
GiếngM: Thang DNA 100 bp
3.2.4.Tách DNA plasmid từ vi khuẩn E. coli
Các dòng khuẩn lạc đã chọn ở trên đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng LB lỏng có bổ sung kháng sinh kar để qua đêm ở tủ lắc 370C, 200 v/ph để nhân lên với số lƣợng lớn. Sau khi tách chiết theo quy trình nhƣ đã trình bày ở mục 2.2.8, chúng tôi lấy 5μl dịch plasmid tách từ mỗi khuẩn lạc hòa trong H2O để điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Kết quả điện di đƣợc thể hiện ở hình 3.12.
Hình 3.12: Kết quả tách chiết plasmid tái tổ hợp mang Apamer liên kết
E. coli O157:H7
Giếng 1 – 8: Plasmid tách chiết từ các khuẩn lạc số 1- 8
Kết quả sau khi chạy điện di cho thấy 3 băng đậm, rõ nét, thể hiện 3 trạng thái khác nhau của plasmid. Điều này chứng tỏ quá trình chiết tách và tinh sạch DNA plasmid đã thành công, loại bỏ hoàn toàn RNA và plasmid .
Nhƣ vậy, chúng tôi đã tách đƣợc 8 dòng aptamer ssDNA liên kết E. coli
O157:H7.
3.3. Kết quả tách dòng aptamer liên kết đặc hiệu E. coli O157:H7
3.3.1. Kết quả tách dòng aptamer liên kết đặc hiệu E. coli O157:H7
Sau khi tách riêng rẽ 8 dòng aptamer nhƣ trên, chúng tôi tiến hành PCR thu các dòng aptamer ssDNA thyol hóa.
8 dòng aptamer đã thyol hóa đƣợc tiến hành gắn với hạt vàng có kích thƣớc 40 nm theo quy trình đã trình bày ở phần phƣơng pháp. Sau đó, chúng tôi sử dụng các phức hợp aptamer – hạt nano vàng này để tiến hành chọn lọc dòng có khả năng liên kết đặc hiệu với vi khuẩn đích thông qua phản ứng dot blot.
Chúng tôi sử dụng vi khuẩn E. coli O157:H7 làm kháng nguyên đích và vi khuẩn E. coli thƣờng làm đối chứng.
Kết quả kiểm tra bằng Dot blot cho thấy dòng số 8 đã chọn có sự liên kết đặc hiệu giữa kháng nguyên của E. coli O157:H7 và aptamer ssDNA gắn trên bề mặt hạt nano vàng. Các hạt nano vàng đóng vai trò nhƣ một sensor màu giúp cho có thể quan sát kết quả kiểm tra bằng mắt thƣờng (hình 3.13). Các hạt nano vàng gắn
aptamer bị bắt lại bởi kháng nguyên và giữ cố định trên màng tạo ra một vùng chấm tròn màu đỏ, các vùng khác không chứa kháng nguyên cố định nên chúng không tạo ra màu đỏ do không có sự xuất hiện của các hạt nano vàng.
Hình 3.13: Kết quả Dot blot giữa phức hợp aptamer ssDNA – hạt nano vàng với kháng nguyên đích E. coli O157:H7
1-8: Hình ảnh dotbot của các aptamer-hạt vàng với E. coli O157:H7
Nhƣ vậy, kết quả dotblot chúng ta nhận thấy aptamer dòng số 8 liên kết với
E. coli O157:H7 mạnh nhất, tiếp theo là dòng số 6 và sự giảm màu sắc chấm đỏ ở các mẫu aptamer còn lại thể hiện mức độ liên kết với E. coli O157:H7 giảm dần. Do đó chúng tôi chọn dòng số 8 để tiến hành kiểm tra sự liên kết của phức hợp aptamer 8 - hạt nano vàng với E. coli O157:H7 thông qua chụp ảnh bằng TEM, so sánh sự liên kết của aptamer-hạt vàng với E. coli thƣờng.
8 7 6 5 4 3 2 1
Nhƣ vậy, qua kết quả dotblot cho phép chúng tôi sơ bộ khẳng định: đã gắn thành công aptamer ssDNA với hạt nano vàng, phức hệ sau khi gắn kết vẫn giữ hoạt tính liên kết đặc hiệu với kháng nguyên đích. Và đã chọn đƣợc 1 dòng có ái lực cao với E. coli O157:H7 trong số các dòng thí nghiệm.
3.3.2. Kết quả xác định sự liên kết của phức hợp aptamer - hạt nano vàng với E. coli O157:H7 với E. coli O157:H7
Vi khuẩn E. coli O157:H7 đƣợc nuôi trong môi trƣờng LB lỏng đạt OD600 = 1. Tiến hành thu tế bào vi khuẩn, rửa bằng dung dịch PBS, sau đó hoà lại trong 1ml PBS. Dùng 100µl dung dịch vi khuẩn ủ với 100µl phức hợp aptamer - hạt vàng, ủ lắc ở nhiệt độ phòng 60 phút, sau đó ly tâm thu tế bào ở tốc độ 3000v/p trong 5 phút, rửa 3 lần với PBS và cuối cùng hòa lại trong 100µl PBS, dung dịch thu đƣợc đƣợc mang xử lý và chụp ảnh TEM. Kết quả thu đƣợc trên hình 3.14 cho thấy phức hợp aptamer - hạt nano vàng bám đặc hiệu trên bề mặt vi khuẩn E. coli O157:H7.
Nhƣ vậy, kết quả chụp ảnh dƣới kính hiển vi điện tử (hình 3.14) đã một lần nữa khẳng định kết quả gắn các hạt nano vàng (đƣờng kích 30nm - 40 nm) với aptamer bám đặc hiệu E. coli O157:H7. Còn đối với E. coli thƣờng, phức hệ không liên kết.Các chấm đen là các hạt vàng; các sợi mảnh dài là lông roi của vi khuẩn E. coli O157:H7.
Trên hình có một vài phức hợp aptamer – hạt nano vàng liên kết E. coli
thƣờng, có thể đó là do quá trình ủ màng trong quá trình sàng lọc chƣa khóa hết các vị trí có thể liên kết với E. coli thƣờng.
a b
Hình 3.14:Ảnh chụp TEM sự liên kết của phức hệ aptamer-hạt nano vàng với E. coli O157:H7 và E. coli thƣờng
a, Ảnh chụp TEM sự liên kết của phức hệ aptamer-hạt nano vàng với E. coli
O157:H7
b, Ảnh chụp TEM sự liên kết của phức hệ aptamer-hạt nano vàng với E. coli thường
3.4. Xác định trình tự aptamer nhận biết đặc hiệu E. coli O157:H7
3.4.1. Tách DNA plasmid từ vi khuẩn E. coli
Dòng khuẩn lạc đã chọn ở trên đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng LB lỏng có bổ sung kháng sinh kar
qua đêm ở tủ lắc 370
C, 200 v/ph để nhân lên với số lƣợng lớn. Sau khi tách chiết theo quy trình nhƣ đã trình bày ở mục 2.2.8, chúng tôi lấy 5μl dịch plasmid tách từ mỗi khuẩn lạc hòa trong H2O để điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Kết quả điện di đƣợc thể hiện ở hình 3.15.
Hình 3.15: Kết quả tra sản phẩm tách dòng của aptamer ssDNA 8
Giếng 1-2: Plasmidtách chiết từ khuẩn lạc dòng số 8.
Kết quả điện di cho thấy 3 băng đậm, rõ nét, thể hiện 3 trạng thái khác nhau của plasmid. Điều này chứng tỏ quá trình chiết tách và tinh sạch DNA plasmid đã thành công, loại bỏ hoàn toàn RNA và plasmid.
Nhƣ vậy, chúng tôi đã tách đƣợc dòng aptamer ssDNA 8 nhận biết đặc hiệu
E. coli O157:H7.
3.4.2. Kết quả xác định trình tự aptamer nhận biết đặc hiệu E. coli
O157:H7
Chúng tôi tiến hành xác định trình tự aptamer dòng số 8 bằng phƣơng pháp giải trình tự acid nucleic tự động trình bày ở mục 2.2.9, kết quả thu đƣợc thể hiện ở hình 3.16.
1 ATACGGGAGC CAACACCAAC CACACCAACC GGACGCTTAT GCCTTGCCAT 51 CTACAGAGCA GGTGTGACGG ATA
Hình 3.16: Trình tự aptamer ssDNA 8
Để dự đoán cấu trúc bậc 2 của aptamer - 8 có khả năng nhận biết đặc hiệu vi khuẩn E. coli O157:H7 chúng tôi sử dụng công cụ Mfold dựa trên trình tự đã biết. Đây là công cụ hỗ trợ tính toán phân tử sinh học đƣợc Đại học Washington of