3. Nội dung nghiên cứu
3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến sự phát sinh chồi của mẫu cấy
BAP thuộc nhóm kích thích sinh trưởng cytokinin được sử dụng phổ biến để cảm ứng tạo chồi, kéo dài thời gian hoạt động của mô phân sinh, hạn chế sự già hóa của tế bào đồng thời thúc đẩy sự phân hóa chồi, kích thích chồi phát triển ở nhiều loài thực vật khác nhau. Theo nhiều nghiên cứu cho biết, BAP thường được sử dụng với nồng độ thay đổi từ 1,0 - 3,0 mg/l là thích hợp cho nhiều loại mô nuôi cấy. Ở các nồng độ cao hơn hoặc thấp hơn đều biểu hiện hiệu quả kích thích kém. Với nồng độ cao sẽ hoạt hóa hình thành chồi bất định.
Qua tìm hiểu một số kết quả nghiên cứu trong nuôi cấy in vitro ở cam quýt cho thấy, tác giả Phan Hữu Tôn (2014) [19] và tác giả Rezadost M (2013) [37] đã sử dụng đoạn trụ trên lá mầm, tác giả Rosely P (2006) [41] sử dụng thân mầm mọc từ hạt đã khử trùng để làm vật liệu mẫu ban đầu trong tạo đa chồi ở một số giống cam quýt.
Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng các đoạn thân mầm của các cây nảy mầm từ hạt đã khử trùng. Cây bưởi Diễn sử dụng trong thí nghiệm khoảng 15 - 20 ngày tuổi, trong giai đoạn này mô chưa hóa gỗ hoàn toàn, phần mô phân sinh sẽ tiếp xúc với các chất kích thích sinh trưởng và biệt hóa tạo các chồi bất định. Thân mầm cắt thành từng đoạn có chiều dài từ 0,8 - 1,0cm trước khi chuyển vào môi trường nuôi cấy. Theo dõi thí nghiệm và đánh giá kết quả sau các khoảng thời gian nuôi cấy. Kết quả theo dõi các chỉ tiêu thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.2 và hình 3.2.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh chồi của mẫu cấy Công
thức
BAP
mg/l Số chồi/mẫu
Chiều cao chồi
(cm) Chất lượng chồi Sau 4 tuần ĐC 0 0,73±0,08 0,34±0,04 + CT1 1 1,22±0,25 0,36±0,09 + CT2 2 1,57±0,32 0,46±0,05 ++ CT3 3 1,81±0,12 0,48±0,07 ++ CT4 4 2,00±0,25 0,55±0,04 ++ CT5 5 2,83±0,28 0,58±0,00 ++ CT6 6 1,55±0,41 0,43±0,07 + CT7 7 1,30±0,17 0,42±0,00 + Sau 6 tuần ĐC 0 1,07±0,12 0,62±0,09 + CT1 1 1,95±0,17 0,67±0,06 ++ CT2 2 2,57±0,38 0,85±0,07 ++ CT3 3 2,60±0,40 0,99±0,13 +++ CT4 4 3,73±0,44 0,99±0,17 +++ CT5 5 4,22±0,18 1,08±0,07 +++ CT6 6 2,22±0,29 0,75±0,02 ++ CT7 7 2,08±0,17 0,71±0,12 ++ Sau 8 tuần ĐC 0 2,07±0,04 0,91±0,08 ++ CT1 1 2,21±0,21 1,08±0,16 ++ CT2 2 3,68±0,28 1,40±0,11 +++ CT3 3 3,90±0,78 1,41±0,15 +++ CT4 4 4,73±0,57 1,56±0,20 +++ CT5 5 5,93±0,25 1,67±0,11 +++ CT6 6 3,56±0,56 1,32±0,11 ++ CT7 7 2,31±0,27 1,28±0,12 ++
Ghi chú: (+) chồi nhỏ, ngắn, lá xanh nhạt; (++) chồi nhỏ, ngắn, lá xanh; (+++) chồi mập, lá to xanh đậm.
Đối chứng BAP 4,0mg/l
BAP 5,0mg/l BAP 6,0mg/l
Hình 3.2. Ảnh hưởng của BAP tới sự phát sinh chồi của mẫu cấy
(sau 8 tuần)
Kết quả thí nghiệm cho thấy, hầu hết các đoạn thân mầm bưởi Diễn có khả năng tái sinh chồi trên các môi trường thí nghiệm. Khả năng tạo đa chồi có sự khác biệt trên các môi trường khi thay đổi nồng độ BAP. Các công thức thí nghiệm đều có khả năng tạo chồi cao hơn so với công thức đối chứng. Ở môi trường đối chứng, số chồi/mẫu sau 4 tuần, 6 tuần, 8 tuần nuôi cấy đều thấp, lần lượt là 0,73; 1,07; 2,07 chồi/mẫu. Trên môi trường nuôi cấy có bổ sung BAP với nồng độ tăng dần từ 1,0mg/l đến 5,0mg/l, quan sát thấy số chồi/mẫu tăng, tăng cao nhất là môi trường nuôi cấy có bổ sung BAP 5mg/l, hiệu quả tạo đa chồi sau 4 tuần nuôi cấy đạt 2,83 chồi/mẫu (tăng 2,1 so với ĐC), sau 6 tuần mẫu nuôi cấy là 3,73 chồi/mẫu (tăng 3,15 so với ĐC), sau 8 tuần nuôi cấy số chồi trên mẫu cấy là 5,93. Các công thức thí nghiệm còn lại cho số chồi/mẫu đạt từ 1,22 đến 2,00 (sau 4 tuần nuôi cấy), 1,95 đến 3,73 (sau 6 tuần nuôi cấy) và 2,21 đến 4,73 (sau 8 tuần nuôi cấy).
Kết quả theo dõi chỉ tiêu về chiều cao chồi cho thấy, khi tăng nồng độ BAP (1,0mg/l đến 5,0mg/l) thì chiều cao chồi tăng dần, tăng cao nhất là môi trường MS có bổ sung BAP 5mg/l. Sau 4 tuần, chiều cao chồi tăng từ 0,36 -0,58cm; sau 6 tuần tăng từ 0,67-1,08cm; sau 8 tuần tăng từ 1,08- 1,67cm. Các môi trường thí nghiệm đều thu được kết quả tốt hơn nhiều so với đối chứng.
Kết quả theo dõi về khả năng tạo đa chồi từ mẫu cấy cây bưởi Diễn của chúng tôi cao hơn so với nghiên cứu của tác giả Ehsan E. và cs trên đối tượng cây có múi. Ở công bố của nhóm tác giả này khi tái sinh in vitro từ mô trưởng thành của cây cam ngọt Thomson, chồi phát triển tốt nhất trên môi trường MS cơ bản có bổ sung BAP 1mg/l chỉ thu được 3,2 chồi/mẫu [33]. Tùy từng giống nuôi cấy, sử dụng nồng độ các chất kích thích sinh trưởng khác nhau để thu được hiệu quả tạo đa chồi tốt nhất.
Xét đồng thời các chỉ tiêu nghiên cứu trong giai đoạn tạo đa chồi cây bưởi Diễn thì môi trường thích hợp nhất trong các nồng độ thăm dò, cho hiệu quả tạo chồi cao nhất là MS cơ bản + đường 30mg/l + agar 9,0g/l có bổ sung BAP 5mg/l, cho hệ số tạo chồi cao đạt 5,93, sự sinh trưởng phát triển của chồi khỏe, chất lượng chồi tốt. Môi trường BAP nồng độ tối ưu thu được được sử dụng trong các nghiên cứu tiếp theo.