3. Nội dung nghiên cứu
2.3.3. Phương pháp xử lý số liệu
Sử dụng toán thống kê để xác định các chỉ số thống kê như: Trung bình mẫu, phương sai, độ lệch chuẩn và sai số trung bình với n ≥ 30, α = 0,05. Các số liệu nghiên cứu được xử lý thống kê bằng phần mềm excel [12].
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả khử trùng hạt cây bưởi Diễn
Vô trùng mẫu cấy là bước đầu tiên đóng vai trò quyết định sự thành công của quá trình nhân giống in vitro. Vì vậy, cần lựa chọn phương pháp khử trùng và loại hóa chất thích hợp để loại bỏ hoàn toàn các nguồn nấm, vi khuẩn, virus khỏi mẫu trước khi đưa vào môi trường nuôi cấy. Có rất nhiều loại hóa chất được sử dụng để khử trùng. Tuy nhiên, nồng độ khử trùng thích hợp cho các đối tượng khác nhau là hoàn toàn khác nhau. Hạt bưởi Diễn có lớp vỏ ngoài cứng, chứa nhiều chất nhày có thành phần peptin, ngoài ra còn chứa dầu, là điều kiện lý tưởng cho các loại vi sinh vật, nấm mốc phát triển. Vì vậy, cần nghiên cứu để đưa ra công thức khử trùng tốt nhất để hạt nảy mầm tốt nhất cũng như cho chất lượng thân mầm tốt nhất. Phương pháp khử trùng thích hợp phải đảm bảo được các yêu cầu: Tỷ lệ hạt bị nhiễm thấp, thân mầm to, mập và chồi sinh trưởng phát triển tốt.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng javen đến sự nảy mầm của hạt cây bưởi Diễn (sau 4 tuần)
Công thức Thời gian khử trùng (phút) Tỉ lệ hạt sạch nảy mầm (%) Tỉ lệ hạt sạch không nảy mầm (%) Chất lượng chồi CT1 15 26 0 ++ CT2 20 81 0 +++ CT3 25 91 9 +++ CT4 30 56 44 +
Ghi chú: Ghi chú: (+): cây nhỏ, lá màu xanh nhạt; (++) cây nhỏ, lá màu xanh đậm; (+++) cây mập, lá to màu xanh đậm.
Dựa vào kết quả nghiên cứu của một số tác giả đã công bố trên đối tượng cam quýt: Phan Hữu Tôn và cs (2014) [19], Rosely P. và cs (2006) [41], chúng tôi tiến hành vô trùng sơ bộ hạt bằng cồn 70o trong 1 phút và javen 60% ở các ngưỡng thời gian khác nhau. Sau khi khử trùng, hạt được cấy vào môi trường MS cơ bản có bổ sung đường 30g/l và agar 9g/l. Đánh giá khả năng thu được mẫu sạch và khả năng
nảy mầm của hạt là bước tiếp theo để tìm ra công thức khử trùng tốt nhất. Kết quả thí nghiệm được thể hiện ở bảng 3.1 và hình 3.1.
25 phút 30 phút
Hình 3.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến sự nảy mầm của hạt cây bưởi Diễn(sau 4 tuần)
Kết quả trên bảng 3.1 và hình 3.1 cho thấy, với thời gian khử trùng thay đổi các chỉ tiêu nghiên cứu có sự khác nhau rõ rệt. Khử trùng hạt bằng javen 60% trong thời gian 25 phút, tỉ lệ hạt sạch nảy mầm cao, hạt không bị nhiễm, đạt chất lượng chồi tốt nhất. Khi tăng thời gian khử trùng lên 30 phút thì tỉ lệ hạt nảy mầm thấp hơn hẳn (56%), đồng thời tăng tỉ lệ hạt chết là 44%, chất lượng chồi kém. Nguyên nhân có thể do javen là chất độc, nếu kéo dài thời gian khử trùng, javen có thể xâm nhập vào phôi, hạt bị độc nên không thể tái sinh được.
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, thời gian khử trùng có ảnh hưởng khá lớn tới tỷ lệ sống của hạt. Javen có hiệu quả diệt nấm và diệt khuẩn cao đối với hạt của cây bưởi Diễn. Khi lắc nhẹ hạt 25 phút trong javen 60% là vừa đủ, vừa có khả năng tiêu diệt mầm bệnh mà lại tác động nhẹ đến thành tế bào nên cho tỷ lệ sống cao và kích thích mẫu tái sinh.
3.2. Kết quả tạo chồi in vitro cây bưởi Diễn
Trong nuôi cấy in vitro, môi trường nuôi cấy đóng vai trò rất quan trọng, vừa cung cấp chất dinh dưỡng cho mẫu vừa biệt hoá mẫu theo những hướng xác định. Do đó nghiên cứu lựa chọn môi trường nuôi cấy phù hợp nhất sẽ cho hệ số nhân đa chồi cao, chất lượng chồi tốt.
3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến sự phát sinh chồi của mẫu cấy
BAP thuộc nhóm kích thích sinh trưởng cytokinin được sử dụng phổ biến để cảm ứng tạo chồi, kéo dài thời gian hoạt động của mô phân sinh, hạn chế sự già hóa của tế bào đồng thời thúc đẩy sự phân hóa chồi, kích thích chồi phát triển ở nhiều loài thực vật khác nhau. Theo nhiều nghiên cứu cho biết, BAP thường được sử dụng với nồng độ thay đổi từ 1,0 - 3,0 mg/l là thích hợp cho nhiều loại mô nuôi cấy. Ở các nồng độ cao hơn hoặc thấp hơn đều biểu hiện hiệu quả kích thích kém. Với nồng độ cao sẽ hoạt hóa hình thành chồi bất định.
Qua tìm hiểu một số kết quả nghiên cứu trong nuôi cấy in vitro ở cam quýt cho thấy, tác giả Phan Hữu Tôn (2014) [19] và tác giả Rezadost M (2013) [37] đã sử dụng đoạn trụ trên lá mầm, tác giả Rosely P (2006) [41] sử dụng thân mầm mọc từ hạt đã khử trùng để làm vật liệu mẫu ban đầu trong tạo đa chồi ở một số giống cam quýt.
Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng các đoạn thân mầm của các cây nảy mầm từ hạt đã khử trùng. Cây bưởi Diễn sử dụng trong thí nghiệm khoảng 15 - 20 ngày tuổi, trong giai đoạn này mô chưa hóa gỗ hoàn toàn, phần mô phân sinh sẽ tiếp xúc với các chất kích thích sinh trưởng và biệt hóa tạo các chồi bất định. Thân mầm cắt thành từng đoạn có chiều dài từ 0,8 - 1,0cm trước khi chuyển vào môi trường nuôi cấy. Theo dõi thí nghiệm và đánh giá kết quả sau các khoảng thời gian nuôi cấy. Kết quả theo dõi các chỉ tiêu thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.2 và hình 3.2.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh chồi của mẫu cấy Công
thức
BAP
mg/l Số chồi/mẫu
Chiều cao chồi
(cm) Chất lượng chồi Sau 4 tuần ĐC 0 0,73±0,08 0,34±0,04 + CT1 1 1,22±0,25 0,36±0,09 + CT2 2 1,57±0,32 0,46±0,05 ++ CT3 3 1,81±0,12 0,48±0,07 ++ CT4 4 2,00±0,25 0,55±0,04 ++ CT5 5 2,83±0,28 0,58±0,00 ++ CT6 6 1,55±0,41 0,43±0,07 + CT7 7 1,30±0,17 0,42±0,00 + Sau 6 tuần ĐC 0 1,07±0,12 0,62±0,09 + CT1 1 1,95±0,17 0,67±0,06 ++ CT2 2 2,57±0,38 0,85±0,07 ++ CT3 3 2,60±0,40 0,99±0,13 +++ CT4 4 3,73±0,44 0,99±0,17 +++ CT5 5 4,22±0,18 1,08±0,07 +++ CT6 6 2,22±0,29 0,75±0,02 ++ CT7 7 2,08±0,17 0,71±0,12 ++ Sau 8 tuần ĐC 0 2,07±0,04 0,91±0,08 ++ CT1 1 2,21±0,21 1,08±0,16 ++ CT2 2 3,68±0,28 1,40±0,11 +++ CT3 3 3,90±0,78 1,41±0,15 +++ CT4 4 4,73±0,57 1,56±0,20 +++ CT5 5 5,93±0,25 1,67±0,11 +++ CT6 6 3,56±0,56 1,32±0,11 ++ CT7 7 2,31±0,27 1,28±0,12 ++
Ghi chú: (+) chồi nhỏ, ngắn, lá xanh nhạt; (++) chồi nhỏ, ngắn, lá xanh; (+++) chồi mập, lá to xanh đậm.
Đối chứng BAP 4,0mg/l
BAP 5,0mg/l BAP 6,0mg/l
Hình 3.2. Ảnh hưởng của BAP tới sự phát sinh chồi của mẫu cấy
(sau 8 tuần)
Kết quả thí nghiệm cho thấy, hầu hết các đoạn thân mầm bưởi Diễn có khả năng tái sinh chồi trên các môi trường thí nghiệm. Khả năng tạo đa chồi có sự khác biệt trên các môi trường khi thay đổi nồng độ BAP. Các công thức thí nghiệm đều có khả năng tạo chồi cao hơn so với công thức đối chứng. Ở môi trường đối chứng, số chồi/mẫu sau 4 tuần, 6 tuần, 8 tuần nuôi cấy đều thấp, lần lượt là 0,73; 1,07; 2,07 chồi/mẫu. Trên môi trường nuôi cấy có bổ sung BAP với nồng độ tăng dần từ 1,0mg/l đến 5,0mg/l, quan sát thấy số chồi/mẫu tăng, tăng cao nhất là môi trường nuôi cấy có bổ sung BAP 5mg/l, hiệu quả tạo đa chồi sau 4 tuần nuôi cấy đạt 2,83 chồi/mẫu (tăng 2,1 so với ĐC), sau 6 tuần mẫu nuôi cấy là 3,73 chồi/mẫu (tăng 3,15 so với ĐC), sau 8 tuần nuôi cấy số chồi trên mẫu cấy là 5,93. Các công thức thí nghiệm còn lại cho số chồi/mẫu đạt từ 1,22 đến 2,00 (sau 4 tuần nuôi cấy), 1,95 đến 3,73 (sau 6 tuần nuôi cấy) và 2,21 đến 4,73 (sau 8 tuần nuôi cấy).
Kết quả theo dõi chỉ tiêu về chiều cao chồi cho thấy, khi tăng nồng độ BAP (1,0mg/l đến 5,0mg/l) thì chiều cao chồi tăng dần, tăng cao nhất là môi trường MS có bổ sung BAP 5mg/l. Sau 4 tuần, chiều cao chồi tăng từ 0,36 -0,58cm; sau 6 tuần tăng từ 0,67-1,08cm; sau 8 tuần tăng từ 1,08- 1,67cm. Các môi trường thí nghiệm đều thu được kết quả tốt hơn nhiều so với đối chứng.
Kết quả theo dõi về khả năng tạo đa chồi từ mẫu cấy cây bưởi Diễn của chúng tôi cao hơn so với nghiên cứu của tác giả Ehsan E. và cs trên đối tượng cây có múi. Ở công bố của nhóm tác giả này khi tái sinh in vitro từ mô trưởng thành của cây cam ngọt Thomson, chồi phát triển tốt nhất trên môi trường MS cơ bản có bổ sung BAP 1mg/l chỉ thu được 3,2 chồi/mẫu [33]. Tùy từng giống nuôi cấy, sử dụng nồng độ các chất kích thích sinh trưởng khác nhau để thu được hiệu quả tạo đa chồi tốt nhất.
Xét đồng thời các chỉ tiêu nghiên cứu trong giai đoạn tạo đa chồi cây bưởi Diễn thì môi trường thích hợp nhất trong các nồng độ thăm dò, cho hiệu quả tạo chồi cao nhất là MS cơ bản + đường 30mg/l + agar 9,0g/l có bổ sung BAP 5mg/l, cho hệ số tạo chồi cao đạt 5,93, sự sinh trưởng phát triển của chồi khỏe, chất lượng chồi tốt. Môi trường BAP nồng độ tối ưu thu được được sử dụng trong các nghiên cứu tiếp theo.
3.2.2. Ảnh hưởng của kinetin đến sự phát sinh chồi của mẫu cấy
Kinetin là kích thích sinh trưởng cùng nhóm với BAP, chất này cũng có khả năng kích thích tế bào phân chia mạnh trong nuôi cấy mô.
Thí nghiệm thăm dò nồng độ kinetin đến sự phát sinh chồi của mẫu cấy được tiến hành với thời gian và các chỉ tiêu theo dõi như thí nghiệm thăm dò nồng độ BAP. Chúng tôi thu được kết quả thể hiện ở bảng 3.3 và hình 3.3.
Ở môi trường thí nghiệm có bổ sung kinetin chúng tôi nhận thấy, khi nồng độ kinetin tăng dần từ 0,3- 0,7mg/l cho chỉ tiêu theo dõi về số chồi/mẫu và chiều cao chồi đều tốt hơn so với đối chứng. Kết quả thí nghiệm tốt nhất quan sát thấy trên môi trường có bổ sung kinetin 0,7mg/l, sau 4 tuần nuôi cấy, số chồi/mẫu là 1,40, chiều cao chồi là 0,43cm; sau 6 tuần nuôi cấy, số chồi/mẫu là 1,90, chiều cao chồi là 0,95cm; sau 8 tuần nuôi cấy, số chồi/mẫu đạt 3,00, chiều cao chồi là 1,17cm. Nếu tiếp tục tăng nồng độ kinetin lên 0,9mg/l thì số chồi phát sinh và chiều cao chồi giảm. Sau 8 tuần nuôi cấy, số chồi/mẫu chỉ đạt 2,07, chiều cao chồi là 0,96cm.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của kinetin đến sự phát sinh chồi của mẫu cấy Công
thức
Kinetin
(mg/l) Số chồi/mẫu
Chiều cao chồi (cm) Chất lượng chồi Sau 4 tuần ĐC 0 0,73±0,08 0,34±0,05 + CT1 0,3 0,75±0,11 0,35±0,09 + CT2 0,5 1,37±0,16 0,40±0,06 ++ CT3 0,7 1,40±0,23 0,43±0,07 ++ CT4 0,9 0,90±0,32 0,36±0,12 + Sau 6 tuần ĐC 0 1,07±0,12 0,51±0,04 + CT1 0,3 1,27±0,10 0,61±0,06 ++ CT2 0,5 1,64±0,19 0,78±0,09 ++ CT3 0,7 1,90±0,33 0,95±0,06 +++ CT4 0,9 1,37±0,24 0,68±0,16 ++ Sau 8 tuần ĐC 0 1,60±0,04 0,61±0,06 + CT1 0,3 1,73±0,24 0,95±0,03 ++ CT2 0,5 2,14±0,27 1,04±0,13 +++ CT3 0,7 3,00±0,27 1,17±0,12 +++ CT4 0,9 2,07±0,22 0,96±0,13 ++
Ghi chú: (+) chồi nhỏ, ngẵn, lá nhỏ, màu vàng nhạt; (++) chồi nhỏ, ngắn, lá nhỏ, màu xanh nhạt; (+++) chồi mập, màu xanh nhat.
Quan sát hình 3.3 cho thấy, kinetin có ảnh hưởng đến sự tạo đa chồi ở cây bưởi Diễn. Trên môi trường bổ sung kinetin các mẫu cấy đều có khả năng tạo đa chồi, chủ yếu tạo chồi đơn, ít lá, lá nhỏ và nhọn, màu xanh nhạt.
Xét đồng thời các chỉ tiêu theo dõi về số chồi, chiều cao chồi, chất lượng chồi khi thăm dò trên môi trường có bổ sung kinetin, kết quả thí nghiệm cho thấy, các chỉ tiêu theo dõi đều cao hơn so với công thức đối chứng không bổ sung kinetin. Công thức 3 là môi trường tối ưu nhất cho sự tạo đa chồi trong các công thức nghiên cứu.
So sánh hiệu quả trong tạo đa chồi của cây bưởi Diễn khi sử dụng BAP và kinetin nhận thấy, môi trường có bổ sung BAP 5mg/l cho số chồi/mẫu, chiều cao chồi và chất lượng chồi cao hơn hẳn trên môi trường bổ sung kinetin 0,7mg/l. Như vậy có
thể kết luận: Khi nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của BAP và kinetin lên hiệu quả tạo đa chồi thì môi trường bổ sung BAP cho kết quả tốt hơn so với kinetin.
Đối chứng Kinetin 0,5mg/l
Kinetin 0,7mg/l Kinetin 0,9mg/l
Hình 3.3. Ảnh hưởng của kinetin đến sự phát sinh chồi của mẫu cấy
3.2.3. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và kinetin đến sự phát sinh chồi của mẫu cấy
Để nghiên cứu ảnh hưởng khi phối hợp BAP và kinetin đến quá trình tạo đa chồi của mẫu cấy, chúng tôi sử dụng nồng độ BAP tối ưu ở thí nghiệm trước kết hợp với kinetin thay đổi nồng độ (0,3; 0,5; 0,7; 0,9mg/l). Các mẫu cấy là đoạn thân mầm có kích thước 0,8-1cm. Môi trường đối chứng là MS cơ bản không bổ sung chất kích thích sinh trưởng. Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.4 và hình 3.4.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và kinetin đến sự phát sinh chồi của mẫu cấy
Công thức BAP (mg/l) Kinetin (mg/l) Số chồi/mẫu Chiều cao chồi (cm) Chất lượng chồi Sau 4 tuần ĐC 0 0 0,73±0,08 0,34±0,03 + CT2 5,0 0,3 1,39 ±0,17 0,54±0,05 ++ CT3 0,5 1,72 ±0,08 0,69±0,03 ++ CT4 0,7 1,50 ±0,31 0,55±0,04 ++ CT5 0,9 1,30 ±0,08 0,49±0,04 + Sau 6 tuần ĐC 0 0 1,07 ±0,12 0,71±0,12 ++ CT1 5,0 0,3 2,24 ±0,14 0,87±0,08 ++ CT2 0,5 3,03 ±0,49 1,70±0,04 +++ CT3 0,7 2,52 ±0,14 0,92±0,04 ++ CT4 0,9 1,46 ±0,04 0,77±0,04 ++ Sau 8 tuần ĐC 0 0 2,07 ±0,17 0,91±0,08 ++ CT1 5,0 0,3 2,84 ±0,10 1,19±0,07 +++ CT2 0,5 4,47 ±0,60 2,27±0,10 +++ CT3 0,7 3,19 ±0,30 1,48±0,08 +++ CT4 0,9 2,39 ±0,04 1,03±0,05 ++
Ghi chú: (+) chồi nhỏ, ngắn, màu xanh nhạt; (++) chồi ngắn, màu xanh nhạt; (+++) chồi mập, lá to, màu xanh đậm.
ĐC BAP 5mg/l + kinetin 0,5mg/l
Hình 3.4. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và kinetin đến sự phát sinh chồi của mẫu cấy (sau 8 tuần)
Qua bảng 3.4 chúng tôi nhận thấy, kết quả ở các công thức thí nghiệm đều có sự khác nhau về các chỉ tiêu nghiên cứu. Số chồi/mẫu và chiều cao chồi tăng tỉ lệ thuận với nồng độ kinetin tăng dần từ 0,3 đến 0,5mg/l. Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng nồng độ kinetin thì khả năng phát sinh chồi giảm. Hiệu quả tạo chồi tốt nhất là môi trường MS cơ bản + đường 30g/l + agar 9,0g/l + BAP 5mg/l + kinetin 0,5mg/l, sau 4 tuần, số chồi/mẫu là 1,72, chiều cao chồi là 0,69cm; Sau 6 tuần số chồi/mẫu là 3,03 (cao hơn 1,63 lần so với đối chứng), chiều cao chồi là 1,70 (cao hơn 1,36cm so với đối chứng), sau 8 tuần nuôi cấy, số chồi/mẫu là 4,47 (cao hơn 2,40 lần so với đối chứng), chiều cao chồi là 2,27 (cao hơn 1,36cm so với đối chứng).
Ở nghiên cứu của chúng tôi, nồng độ BAP kết hợp với kinetin tối ưu cho sự tạo đa chồi cao hơn so với kết quả nghiên của tác giả Komal G (2013) trong nhân giống chanh không hạt (Citrus limon) [36]. Sự khác biệt là do hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng nội sinh của mỗi giống là khác nhau, do sử dụng nguồn hóa chất khác nhau.
So sánh kết quả thí nghiệm giữa các công thức bổ sung chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin (BAP hoặc kinetin và tổ hợp BAP và kinetin), thì môi trường bổ sung BAP cho hiệu quả tạo đa chồi và chất lượng chồi tốt nhất (hình 3.2). Mặt khác, đây là môi trường thông dụng trong nuôi cấy, giảm giá thành do giảm chi phí môi trường nuôi cấy. Môi trường bổ sung kinetin, hiệu quả tạo đa chồi và chất lượng chồi kém (hình 3.3). Do đó, có thể sắp xếp hệ số tạo đa chồi cây bưởi Diễn trên môi trường bổ sung các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin theo thứ tự là: BAP > BAP +kinetin > kinetin.
3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của GA3 đến sự kéo dài chồi ở cây bưởi Diễn
GA3 đối với thực vật là hormon sinh trưởng giúp kích thích sự kéo dài thân nguyên vẹn, vươn dài lóng, kích thích sự phân chia tế bào.
Từ những đặc tính điển hình của GA3, chúng tôi tiến hành thăm dò ảnh hưởng của GA3 đến sự kéo dài chồi của cây bưởi Diễn bằng cách bổ sung vào môi trường nuôi cấy GA3 với nồng độ thay đổi.
Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng các chồi đạt chiều cao 1,5- 2,5cm cấy chuyển sang môi trường MS cơ bản + đường 30g/l + agar 9,0g/l + GA3 thay đổi nồng