3. Nội dung nghiên cứu
1.6. Một số thành tựu trong nhân giống cây có múi
Đã có nhiều công trình nghiên cứu khác nhau nhằm hoàn thiện quy trình nuôi cấy in vitro cây có múi trên thế giới cũng như ở Việt Nam.
Trên thế giới
Trong nghiên cứu của Sunette L. (2004), khi nhân giống quýt Mega-loxycarpa Lush ở Ấn Độ cho thấy, môi trường thuận lợi nhất cho sự tạo chồi từ đoạn thân làMS
cơ bản bổsung BAP 0,25mg/l + NAA 0,5mg/l, môi trường MS cơ bản bổsung BAP 1mg/l và kinetin 0,5mg/l cho hệ số nhân chồi lần lượt là 4,7 và 4,4. Chồi non ra rễ tốt nhất trên môi trường MS bổ sung NAA 2mg/l, số rễ/chồi đạt 4,4 [43].
Theo nghiên cứu của Rezadost M.H. và cs (2013), khi nghiên cứu tái sinh in vitro cây cam chua (Citrus aurantium L.) đã công bố, hạt cam chua nảy mầm tốt nhất trên môi trường MS có bổ sung BAP 2mg/1 và NAA 0,1mg/l. Tỉ lệ tạo chồi từ đoạn thân tốt nhất trên môi trường có BAP 2,5mg/l, kéo dài chồi đạt hiệu quả tối ưu trên môi trường có GA3 0,5mg/l [37].
Tác giả Ehsan E. và cs đã nghiên cứu tái sinh in vitro từ mô trưởng thành của cây cam ngọt Thomson. Kết quả cho thấy, chồi thí nghiệm phát triển tốt nhất trên môi trường MS có bổ sung BAP 1mg/l,NAA 0,1mg/l (3,2chồi/mẫu). Khi cắt mẫu theo chiều dọc hoặc chiều ngang đoạn thân có tỷ lệ phản ứng tạo chồi 56%. Rễ phát sinh trên môi trường MS cơ bản có NAA ( 0,5 - 1mg/l). Tỉ lệ tạo rễ cao nhất đạt 76% [33].
Nghiên cứu môi trường nhân nhanh giống Cam ngọt (Citrus sinensis L. Osbeck), tác giả Shahid A. K. và cs (2011) đã chỉ ra, môi trường tạo mô sẹo tốt nhất là BAP 1mg/l và NAA 0,5mg/l (98%). Môi trường tạo đa chồi tối ưu là môi trường MS cơ bản có bổ sung BAP 1,5mg/l và NAA 1mg/l, tỉ lệ mẫu tạo đa chồi khoảng 90% và đạt 10 chồi/mẫu sau 35 ngày nuôi cấy. Số rễ được tạo ra nhiều nhất trên môi trường MS cơ bản có bổ sung IBA 2,5 mg/l (3,4 rễ/cây) [42].
Trong nghiên cứu nhân giống cây chanh từ lá mầm, Anna K. P. và cs (2015) đã công bố, khi kết hợp các chất điều hòa sinh trưởng thực vật cả auxin và cytokinin trên môi trường MS cơ bản với nồng độ kinetin 0,2mg/l và NAA 1mg/l cho tỉ lệ mẫu tạo đa chồi là 97%. Môi trường MS cơ bản có bổ sung BAP 3,5mg/l cho tỉ lệ mẫu tạo đa chồi đạt 85%. Các chồi tạo rễ tốt nhất trên môi trường MS cơ bản + BAP 5mg/l+NAA 1mg/l, tỉ lệ tạo rễ đạt 82% [30].
Trong nghiên cứu nhân giống cam ngọt Bahia, tác giả Rosely P. và cs (2006) đã chỉ ra, hạt nảy mầm trên môi trường MS cơ bản có bổ sung đường 25g/l và agar 8g/l. Môi trường thuận lợi cho sự phát sinh chồi từ các đoạn thân mầm trên môi trường MS cơ bản + BAP 3mg/l + NAA 0,5mg/l, tỉ lệ mẫu tạo đa chồi là 45,5%.Các chồi tạo rễ trên môi trường MS cơ bản + IBA 1mg/l + NAA 0,5mg/l [41].
Tác giả Komal G. và cs (2013) khi nghiên cứu nhân giống tạo cây chanh không hạt (Citrus limon) đã nhận thấy, môi trường tối ưu cho sự tái sinh chồi nách là MS cơ bản +BAP 0,25mg/l+ kinetin 0,5mg/l + IBA 0,5mg/l (đạt 5,5chồi/mẫu). Khi kết hợp 2 cytokinin trên môi trường MS cơ bản là BAP 0,25mg/l và kinetin 1mg/l, thí nghiệm cho tỉ lệ mẫu phát sinh chồi là 75%, thu được nhiều nhất là 7chồi/mẫu [36].
Ở Việt Nam
Nghiên cứu nuôi cấy in vitro trên lá mầm giống cam Vinh (Citrus sinensis) và quýt Đường Canh (Citrus reticulata), Phan Hữu Tôn và cs (2014) đã công bố xác định được chất khử trùng tốt nhất là Johnson 10% lắc trong 15 phút. Tỉ lệ tái sinh chồi tốt nhất đối với giống cam Vinh là môi trường MS cơ bản + đường 30g/l + vitamin B5 5mg/l + agar 8g/l + BAP 1,5 mg/l, với quýt Đường Canh là môi trườngMS cơ bản + đường 30g/l + agar 8,0g/l + vitamin B51,0mg/l + BAP 1,0mg/l, số chồi/mẫu của giống cam Vinh đạt 4,7 và quýt Đường Canh là 5,5. Môi trường tốt nhất cho sự tạo rễ của chồi cam Vinh là môi trường MS cơ bản + đường 30g/l + vitamin B5 5mg/l + agar 8g/l + NAA 0,4mg/l + IAA 0,4mg/l. Tỉ lệ chồi phát sinh rễ là 82,3%, số rễ/chồi là 3,5 và chiều dài rễ là 3,5cm. Với quýt Đường Canh là môi trường MS cơ bản + đường 30g/l + agar 8,0g/l + vitamin B51,0mg/l + NAA 0,3mg/l + IAA 0,4mg/l cho tỉ lệ chồi phát sinh rễ là 86,3%, số rễ/chồi là 3,5 và chiều dài rễ là 3,2cm. Giá thể tốt nhất khi ra cây in vitro là cát vàng + trấu hun với tỷ lệ 1:1, sau 6 tuần tỉ lệ cây sống sót ở giống cam Vinh là 96% và quýt Đường Canh là 95% [19].
Năm 2007, Đỗ Tiến Phát và cs thuộc Viện Công nghệ Sinh học và Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã nghiên cứu và xây dựng thành công hệ thống tái sinh phục vụ công tác chuyển gen vào cây cam Sành bằng
Chương 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu và hóa chất
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu
Đề tài sử dụng hạt cây bưởi Diễn có nguồn gốc tại Phú Diễn, Từ Liêm, Hà Nội.Thời gian lấy mẫu: tháng 1 năm 2016.
2.1.2. Hóa chất, thiết bị
Hóa chất
Các hóa chất cơ bản và thông dụng trong nghiên cứu nuôi cấy: Cồn 700, javen 60%, agar, đường, nước cất khử trùng, MS cơ bản (Murashige and Shoog, 1962). Các chất kích thích sinh trưởng: BAP, kinetin, NAA, IBA, GA3 có nguồn gốc từ Trung Quốc, Ấn Độ, Anh, Đức, Việt Nam.
Bảng 2.1. Thành phần cơ bản của môi trường MS
STT Thành phần Nồng độ (mg/l) STT Thành phần Nồng độ (mg/l) MS1 10 CoCl2.6H2O 0,025 1 CaCl2.2H2O 440,00 11 CuSO4.5H2O 0,025 MS 2 12 Na2MoO4.2H2O 0,25 2 KH2PO4 170,00 MS 4 3 KNO3 1900,00 13 FeSO4.7H2O 27,80 4 MgSO4.7H2O 370,00 14 Na2EDTA 37,30 5 NH4NO3 1650,00 MS5 MS 3 15 Glicine 2,00 6 H3BO3 6,20 16 Thiamine HCl 0,10 7 KI 0,83 17 Pyridoxine HCl 0,50
8 MnSO4.4H2O 22,30 18 Nicotinic Acid 0,50 9 ZnSO4.7H2O 8,60 19 Myo- inositol 100,00
Thiết bị
Các thiết bị chính dùng trong nghiên cứu gồm: Nồi hấp khử trùng (Tommy Nhật Bản), tủ sấy (Đức), buồng cấy vô trùng (Boilogical Safety Cabinets - Mỹ), cân điện tử (Đức)…
Bộ đồ cấy: Dao cấy, que cấy, đĩa cấy, bình tam giác 250ml, 500ml, pipet, ca nhựa, bông, giấy làm nút, giấy thấm, phễu thủy tinh.
2.2. Địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 1 năm 2016 đến tháng 5 năm 2017 tại phòng Công nghệ tế bào thực vật thuộc khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên.
2.3.Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp pha môi trường và nuôi cấy
Môi trường cơ bản được sử dụng trong nghiên cứu là môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962).
Nguyên tắc pha môi trường nuôi cấy: Pha môi trường đặc với thành phần và hàm lượng các chất phù hợp. Môi trường cơ bản là MS, có đầy đủ muối khoáng, các chất hữu cơ, vitamin,…Tất cả các hóa chất phải được tan đều, không kết tủa. Môi trường có bổ sung chất độn là thạch làm giá đỡ không quá rắn hay quá mềm để khi cấy mẫu được dễ dàng. Khử trùng ở nhiệt độ 120oC, áp suất 0,7at - 1,2at. Sau khi khử trùng để nguội, ổn định sau 2 - 3 ngày và tiến hành cấy mẫu trong buồng cấy vô trùng [17].
2.3.2. Phương pháp nuôi cấy in vitro
Các thí nghiệm được đặt trong phòng nuôi cấy ở nhiệt độ 25±2°C, cường độ chiếu sáng 2000 lux, độ ẩm 60 - 80%, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày. Mỗi thí nghiệm tạo mẫu in vitro cấy 30 mẫu, bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại. Thí nghiệm ngoài vườn ươm được bố trí 3 lần lặp lại mỗi lần 35 mẫu.
(i) Tạo mẫu sạch in vitro từ hạt cây bưởi Diễn
Các bước thí nghiệm được tiến hành như sau:
Hạt bưởi ngâm xà phòng loãng trong 20 - 30 phút sau đó rửa sạch nhiều lần dưới vòi nước máy.
(1) Đưa mẫu vào bình sạch, rửa lại mẫu bằng nước cất khử trùng.
(2) Khử trùng mẫu bằng cồn 70o(1 phút). Rửa lại bằng nước cất khử trùng. (3) Khử trùng mẫu với javen 60% (thời gian15, 20, 25, 30 phút).
(4) Rửa sạch mẫu bằng nước cất khử trùng 3 lần.
Hạt sau khi khử trùng tiến hành bóc vỏ và thấm khô trên giấy thấm. Ở mỗi ngưỡng thời gian khử trùng cấy 30 hạt mẫu. Theo dõi các chỉ tiêu như: Tỉ lệ hạt sạch nảy mầm (%), tỉ lệ hạt sạch không nảy mầm (%); chất lượng chồi từ các hạt nảy mầm.
Các bước khử trùng thực hiện trong môi trường vô trùng.
(ii) Phương pháp tạo đa chồi từ nguồn mẫu sạch thu được
Nội dung 1: Ảnh hưởng riêng rẽ của chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin đến khả năng phát sinh chồi
Để thăm dò ảnh hưởng riêng rẽ của chất kích thích sinh trưởng đến sự phát sinh đa chồi cây bưởi Diễn, tất cả các công thức môi trường nuôi cấy đều sử dụng môi trường MS cơ bản có bổ sung đường 30 g/l + agar 9,0g/l và các chất kích thích sinh trưởng có hàm lượng thay đổi. Đối chứng sử dụng môi trường MS cơ bản + đường 30 g/l + agar 9,0 g/l không bổ sung các chất kích thích sinh trưởng [17]. Ở mỗi công thức nuôi cấy tiến hành trên 30 mẫu cấy.
(1) Các đoạn thân mầm được cấy trên môi trường MS cơ bản + đường 30g/l + agar 9,0g/l + bổ sung BAP với nồng độ1 mg/l; 2 mg/l; 3 mg/l; 4 mg/l; 5 mg/l; 6 mg/l; 7 mg/l tương ứng với các công thức từ 1 - 7.
(2) Các đoạn thân mầm được cấy trên môi trường MS cơ bản + đường 30g/l+ agar 9,0g/l + bổ sung kinetin với nồng độ 0,3 mg/l; 0,5 mg/l; 0,7 mg/l; 0,9 mg/l tương ứng với các công thức từ 1- 4.
Kết quả đánh giá khả năng sinh trưởng cây bưởi Diễn sau các thời gian: 4 tuần, 6 tuần, 8 tuần nuôi cấy qua các chỉ tiêu theo dõi sau: Số chồi/mẫu; Chiều cao chồi (cm); Chất lượng chồi.
Chồi sinh trưởng tốt: Chồi mập, lá to màu xanh đậm (+++) Chồi sinh trưởng trung bình: Chồi nhỏ, lá xanh (++) Chồi sinh trưởng kém: Chồi nhỏ, lá nhỏ màu xanh nhạt (+)
Nội dung 2: Ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin đến khả năng phát sinh chồi
Các đoạn thân mầm được cấy trên môi trường MS cơ bản + đường 30g/l + agar 9g/l, sử dụng BAP nồng độ tối ưu trên môi trường tạo đa chồi kết hợp với kinetin nồng độ 0,3; 0,5; 0,7; 0,9 mg/l. Đối chứng sử dụng môi trường MS cơ bản + đường 30g/l + agar 9,0g/l không bổ sung các chất kích thích sinh trưởng. Theo dõi và đánh giá kết quả sau 4 tuần, 6 tuần, 8 tuần.Các chỉ tiêu theo dõi như nội dung 1.
(iii) Phương pháp kéo dài chồi
Những chồi tạo ra trên môi trường nhân nhanh có kích thước đạt từ 1,5cm - 2,5cm được cấy chuyển sang môi trường kéo dài chồi. Sử dụng môi trường MS cơ bản + đường 30g/l + agar 9g/l +GA3với nồng độ thay đổi (0,3; 0,5; 0,7; 0,9 mg/l). Đối chứng sử dụng môi trường MS cơ bản + đường 30g/l + agar 9,0g/l không có các chất kích thích sinh trưởng. Mỗi công thức thí nghiệm được tiến hành trên 35 mẫu. Đánh giá kết quả sau 4 tuần, 6 tuần, 8 tuần. Các chỉ tiêu theo dõi: Chiều cao chồi (cm); Chất lượng chồi.
Chồi tốt: Chồi mập, khỏe, cao, màu xanh đậm (+++) Chồi trung bình: Chồi cao, màu xanh (++)
Chồi kém: Chồi nhỏ, ngắn, màu xanh nhạt (+)
(iv) Phương pháp tạo cây hoàn chỉnh
Khi các chồi bưởi Diễn đạt chiều cao 3- 4cm và có 3-5 lá được cấy chuyển sang môi trường ra rễ. Mỗi công thức thí nghiệm được tiến hành trên 35 mẫu. Môi trường thí nghiệm thăm dò là MS cơ bản + đường 30g/l + aga 9g/l + α-NAA nồng độ 0,3; 0,5; 0,7; 0,9 mg/l hoặc IBA nồng độ 0,3; 0,5; 0,7; 0,9 mg/l. Theo dõi, đánh giá kết quả sau 4 tuần, 6 tuần, 8 tuần.
Các chỉ tiêu theo dõi: Số rễ/chồi; Chiều dài rễ (cm); Chất lượng rễ Rễ tốt: Rễ mập, khỏe, dài, màu trắng sữa hoặc trắng xanh (+++) Rễ trung bình: Rễ khỏe, màu trắng xanh (++)
Rễ kém: Rễ nhỏ, ngắn, màu trắng (+)
(v) Đưa cây ra vườn ươm
Thí nghiệm ngoài vườn ươm được bố trí 3 lần lặp lại, mỗi lần 35 mẫu.
Các chồi đơn đạt chiều cao 4-5cm, mọc 4- 5 lá, có 2-3 rễ, chiều dài rễ đạt 3- 4cm, rễ mập đủ tiêu chuẩn đưa cây ra ngoài vườn ươm.
Cách bố trí thí nghiệm: thăm dò trên 3 loại giá thể: (1) Cát vàng + trấu hun (tỉ lệ 1:1);
(2) Đất thịt trung bình + trấu hun (tỉ lệ 6:4) (3) Đất thịt trung bình
Tuần đầu tiên để cây ở điều kiện phòng. Tuần thứ hai đưa cây ra nhà lưới. Tưới phun dưới dạng sương mù vào lúc sáng sớm. Theo dõi, đánh giá tỉ lệ sống sót và chất lượng cây sau 4 tuần.
Giai đoạn vườn ươm
Những cây bưởi trong bầu đất đạt chiều cao hơn 5cm, hình thành thêm lá mới,
lá xanh, chiều dài rễ đạt 3-4cm, khỏe sẵn sàng chuyển cây ra ngoài môi trường tự nhiên. Tiến hành bỏ vỏ bầu, trồng cây trên luống với mật độ 30cm. Tuần đầu tiên phủ bằng ni lông. Tưới nước vào buổi chiều. Theo dõi, đánh giá kết quả sau 1 tháng, 2 tháng, 3 tháng. Chỉ tiêu theo dõi: Chiều cao cây (cm), số lá, chất lượng cây.
Chất lượng cây: (+); Cây nhỏ, thấp, lá nhỏ, lá xanh nhạt; (++): cây thấp, lá xanh đậm; (+++): cây to, cao, phiến lá rộng, lá xanh đậm
2.3.3. Phương pháp xử lý số liệu
Sử dụng toán thống kê để xác định các chỉ số thống kê như: Trung bình mẫu, phương sai, độ lệch chuẩn và sai số trung bình với n ≥ 30, α = 0,05. Các số liệu nghiên cứu được xử lý thống kê bằng phần mềm excel [12].
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả khử trùng hạt cây bưởi Diễn
Vô trùng mẫu cấy là bước đầu tiên đóng vai trò quyết định sự thành công của quá trình nhân giống in vitro. Vì vậy, cần lựa chọn phương pháp khử trùng và loại hóa chất thích hợp để loại bỏ hoàn toàn các nguồn nấm, vi khuẩn, virus khỏi mẫu trước khi đưa vào môi trường nuôi cấy. Có rất nhiều loại hóa chất được sử dụng để khử trùng. Tuy nhiên, nồng độ khử trùng thích hợp cho các đối tượng khác nhau là hoàn toàn khác nhau. Hạt bưởi Diễn có lớp vỏ ngoài cứng, chứa nhiều chất nhày có thành phần peptin, ngoài ra còn chứa dầu, là điều kiện lý tưởng cho các loại vi sinh vật, nấm mốc phát triển. Vì vậy, cần nghiên cứu để đưa ra công thức khử trùng tốt nhất để hạt nảy mầm tốt nhất cũng như cho chất lượng thân mầm tốt nhất. Phương pháp khử trùng thích hợp phải đảm bảo được các yêu cầu: Tỷ lệ hạt bị nhiễm thấp, thân mầm to, mập và chồi sinh trưởng phát triển tốt.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng javen đến sự nảy mầm của hạt cây bưởi Diễn (sau 4 tuần)
Công thức Thời gian khử trùng (phút) Tỉ lệ hạt sạch nảy mầm (%) Tỉ lệ hạt sạch không nảy mầm (%) Chất lượng chồi CT1 15 26 0 ++ CT2 20 81 0 +++ CT3 25 91 9 +++ CT4 30 56 44 +
Ghi chú: Ghi chú: (+): cây nhỏ, lá màu xanh nhạt; (++) cây nhỏ, lá màu xanh đậm; (+++) cây mập, lá to màu xanh đậm.
Dựa vào kết quả nghiên cứu của một số tác giả đã công bố trên đối tượng cam quýt: Phan Hữu Tôn và cs (2014) [19], Rosely P. và cs (2006) [41], chúng tôi tiến hành vô trùng sơ bộ hạt bằng cồn 70o trong 1 phút và javen 60% ở các ngưỡng thời gian khác nhau. Sau khi khử trùng, hạt được cấy vào môi trường MS cơ bản có bổ sung đường 30g/l và agar 9g/l. Đánh giá khả năng thu được mẫu sạch và khả năng
nảy mầm của hạt là bước tiếp theo để tìm ra công thức khử trùng tốt nhất. Kết quả thí nghiệm được thể hiện ở bảng 3.1 và hình 3.1.
25 phút 30 phút
Hình 3.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến sự nảy mầm của hạt cây bưởi Diễn(sau 4 tuần)
Kết quả trên bảng 3.1 và hình 3.1 cho thấy, với thời gian khử trùng thay đổi các chỉ tiêu nghiên cứu có sự khác nhau rõ rệt. Khử trùng hạt bằng javen 60% trong thời gian 25 phút, tỉ lệ hạt sạch nảy mầm cao, hạt không bị nhiễm, đạt chất lượng chồi tốt nhất. Khi tăng thời gian khử trùng lên 30 phút thì tỉ lệ hạt nảy mầm thấp hơn hẳn (56%), đồng thời tăng tỉ lệ hạt chết là 44%, chất lượng chồi kém. Nguyên nhân có thể